HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別和多成分定量不同產(chǎn)地甘松的質(zhì)量評(píng)價(jià)

王姿楊 ，邢耀瑩 ，付文芮 ，王 露 ，鄧小斌 ，龐 哲 ，崔治家 *，邵 晶 ,

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

2. 西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000

3. 甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

4. 甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

甘松NardostachyosRadixet Rhizoma 為敗醬科植物甘松NardostachysjatamansiDC.的干燥根及根莖，是我國(guó)應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥及藏藥，在阿育吠陀和烏納尼醫(yī)學(xué)體系中也一直用于治療各種疾病。最早記載于唐代陳藏器所著的藥學(xué)專著《本草拾遺》中。甘松性辛、甘，溫；歸脾、胃經(jīng)；具有理氣止痛、開郁醒脾、外用祛濕消腫的功效。臨床上常用于治療脘腹脹滿、食欲不振、嘔吐；外用治療牙痛、腳氣腫毒[1]。甘松中含有萜類、黃酮類、醌類、糖類、香豆素類、木脂素類等成分[2-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘松具有抗心律失常、抗氧化、抑菌、抗炎、抗瘧、抗抑郁、降血壓、鎮(zhèn)靜、抗癲癇、保護(hù)心肌細(xì)胞等多種生物活性[7-18]。

我國(guó)甘松藥材以野生為主，主要分布在西藏、四川、甘肅、青海等省份[19]。由于采收、加工、儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)的不規(guī)范性，導(dǎo)致市場(chǎng)甘松藥材質(zhì)量差異較大，且常摻雜有其他植物干燥根及根莖，有時(shí)難以識(shí)別，《中國(guó)藥典》2020 年版對(duì)甘松質(zhì)量評(píng)價(jià)以揮發(fā)油和甘松新酮含量為指標(biāo)，文獻(xiàn)研究多以揮發(fā)油、甘松新酮、綠原酸和蒙花苷等作為指標(biāo)性成分對(duì)甘松藥材進(jìn)行質(zhì)量控制[20]，另有文獻(xiàn)研究丁香酸、馬兜鈴?fù)瑯幼鳛楦仕伤幉牡幕瘜W(xué)成分[21-22]，分別具有抗肺癌藥理作用[23]、殺傷癌細(xì)胞作用[24]。本課題組前期開展的基于“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接-藥效學(xué)驗(yàn)證”的甘松“理氣止痛、開郁醒脾”功效質(zhì)量標(biāo)志物研究，也表明綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)瓤勺鳛楦仕少|(zhì)量標(biāo)志成分，相關(guān)研究結(jié)果另行發(fā)表。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道甘松中丁香酸、馬兜鈴?fù)? 種化學(xué)成分在HPLC 研究中的指認(rèn)及定量分析，故對(duì)甘松原料藥材、飲片、藥材粉末的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)中尚缺乏全面性，因此有必要對(duì)甘松建立基于臨床有效性的多成分綜合評(píng)價(jià)方法。

本研究以收集到的16 個(gè)批次的甘松藥材作為研究對(duì)象，通過(guò)HPLC 法對(duì)甘松中綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴?fù)? 種化學(xué)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，建立不同批次甘松樣品指紋圖譜，并運(yùn)用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，HCA），對(duì)所有樣品的圖譜進(jìn)行探索性分析，結(jié)合正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）篩選不同批次甘松藥材的差異成分，并對(duì)其共有峰進(jìn)行分析，同時(shí)構(gòu)建甘松藥材的主成分綜合評(píng)價(jià)模型，為甘松藥材的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)提供方法和參考依據(jù)，以期規(guī)范當(dāng)前甘松藥材的市場(chǎng)流通及產(chǎn)地采收加工現(xiàn)狀，同時(shí)保障優(yōu)質(zhì)的甘松藥材能夠應(yīng)用于中醫(yī)藥臨床。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ME204E 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BS110S 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó) Waters 公司）；YH-IS 型遠(yuǎn)紅外電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司）；3 號(hào)藥典篩（浙江上虞市金鼎標(biāo)準(zhǔn)篩具廠）。

1.2 材料

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)A22GB158496）、丁香酸（ 批號(hào) S18J10K93270 ）、 蒙花苷（ 批號(hào)A02GB144093）、甘松新酮（批號(hào)H30D5X1）、馬兜鈴?fù)ㄅ?hào)R09J9F63410），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。甲醇（色譜純，批號(hào) 20220103）、乙腈（色譜純，批號(hào)20230301）、85%磷酸（色譜純，批號(hào)20210415）、乙醇（分析級(jí)，批號(hào)20220901），購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。實(shí)驗(yàn)用甘松藥材為2022 年6、10 月分別于四川、青海、甘肅3 個(gè)省野外采集的樣品。經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)崔治家教授鑒定為敗醬科植物甘松N.jatamansiDC.的干燥根及根莖，共16 批（編號(hào)S1～S16），具體信息見(jiàn)表1。

表1 甘松藥材來(lái)源Table 1 Sources of N. jatamansi

2 方法

2.1 不同產(chǎn)地甘松樣品HPLC 指紋圖譜的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴?fù)? 種對(duì)照品適量，加甲醇分別制成一定質(zhì)量濃度的母液，分別量取一定體積混合，制成含綠原酸80.0 μg/mL、丁香酸0.8μg/mL、蒙花苷3.5 μg/mL、甘松新酮700.0 μg/mL、馬兜鈴?fù)?75.0 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取甘松藥材細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（30 ℃、40 kHz、600 W），放冷，用95%乙醇補(bǔ)足質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 mL，水浴蒸干，用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，搖勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜條件參考楊祎辰等[25]研究，并在其基礎(chǔ)上加以改善，最終確定色譜條件：Agilent 5 HC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液（B）-乙腈（D），梯度洗脫（0～20 min，10%～35% D；20～23 min，35%～40% D；23～37 min，40%～54% D；37～42 min，54%～69%D；42～47 min，69%～72% D；47～48 min，72%～10% D）；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取甘松樣品（S1），按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得各共有峰保留時(shí)間的RSD均小于0.35%，峰面積的RSD 均小于1.91%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取甘松樣品（S1）6 份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)得各共有峰保留時(shí)間的RSD 均小于0.35%，峰面積的RSD 均小于2.98%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取甘松樣品（S1），按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后的0、2、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣分析，測(cè)得各共有峰保留時(shí)間的RSD 均小于0.36%，峰面積的RSD 均小于2.47%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 指紋圖譜的建立及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析 將“2.1.2”項(xiàng)下方法制成的16 批供試品溶液按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。并導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》，以S1樣品為參照指紋圖譜（R），設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.2 min，采用多點(diǎn)校正法自動(dòng)匹配分析法建立指紋圖譜，中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，并進(jìn)行相似度計(jì)算。將得到的60 個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 25.0進(jìn)行HCA 分析，SIMCA 14.1 進(jìn)行PCA 分析、OPLSDA 分析。

2.2 5 個(gè)指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 同“2.1.1”項(xiàng)。

2.2.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項(xiàng)。

2.2.3 色譜條件 同“2.1.3”項(xiàng)。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇逐次稀釋成系列不同濃度，進(jìn)樣測(cè)定，記錄5 種成分的色譜峰面積，以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別建立綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮和馬兜鈴?fù)木€性回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R2），各相關(guān)系數(shù)均大于0.999 6，表明各成分線性關(guān)系良好，見(jiàn)表2。

表2 甘松藥材中5 種成分線性關(guān)系考察結(jié)果Table 2 Results of linear relationship between five components of N. jatamansi

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴?fù)姆迕娣e積分值，計(jì)算RSD 分別為2.02%、2.87%、2.02%、1.08%、2.08%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取甘松樣品粉末（S1）6 份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴?fù)钠骄|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.590 0、0.038 4、0.043 5、10.242 3、1.576 3 mg/g，RSD 分別為2.66%、1.23%、0.90%、1.84%、3.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取甘松樣品（S1），按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后的0、2、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣分析，記錄綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴?fù)姆迕娣e積分值，計(jì)算RSD 分別為2.47%、2.37%、1.98%、1.47%、1.64%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知成分含量的甘松粉末9 份（S1），每份約0.25 g，置具塞錐形瓶中，按比例（1∶0.8、1∶1、1∶1.2）分別精密加入一定體積的對(duì)照品溶液，每個(gè)比例按“2.1.2”項(xiàng)方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率和RSD 值。結(jié)果綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴?fù)钠骄厥章史謩e為99.41%、98.96%、99.13%、102.97%、101.03%，RSD 分別為1.33%、1.87%、1.91%、0.96%、1.58%。

2.2.9 樣品測(cè)定 分別精密稱取16 批次甘松樣品粉末0.5 g（平行3 份），按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定5 個(gè)成分峰面積，代入“2.2.4”項(xiàng)下直線回歸方程，計(jì)算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC 指紋圖譜的建立

將16 批次樣品色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》，建立16 批樣品的HPLC 指紋圖譜（圖1），以S1 為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗口設(shè)定為0.2 min，以中位數(shù)法建立對(duì)照?qǐng)D譜（R），采用多點(diǎn)校正全譜峰自動(dòng)匹配共得到60 個(gè)共有峰，通過(guò)與混合對(duì)照品溶液圖譜（圖2）比對(duì)，指認(rèn)出其中5 個(gè)共有峰，依次為綠原酸（7 號(hào)峰）、丁香酸（13 號(hào)峰）、蒙花苷（32號(hào)峰）、甘松新酮（50 號(hào)峰）、馬兜鈴?fù)?5 號(hào)峰）。

圖1 16 批次甘松的HPLC 疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig.1 HPLC superimposed fingerprints and control fingerprints of 16 batches of N. jatamansi (R)

圖2 混合對(duì)照品溶液的HPLC 圖Fig.2 HPLC diagram of mixed reference solution

3.2 共有峰面積差異分析

不同產(chǎn)地甘松藥材各共有峰峰面積RSD 為26.17%～88.42%，且7（綠原酸）、50（甘松新酮）、52、55（馬兜鈴?fù)┨?hào)共有峰峰面積相對(duì)較高；四川產(chǎn)甘松藥材各共有峰峰面積RSD 為1.12%～65.72%，且7、12、35、50、52、55、59 號(hào)共有峰峰面積相對(duì)較高；青海河南產(chǎn)甘松藥材各共有峰峰面積RSD 為22.98%～72.76%，且7、12、35、41、49、50、52、55、59 號(hào)共有峰峰面積相對(duì)較高；甘肅瑪曲產(chǎn)甘松藥材7、12、50、52、55 號(hào)共有峰峰面積相對(duì)較高。不同產(chǎn)地甘松藥材的共有峰峰面積差異較大，其中均以50 號(hào)共有峰甘松新酮的峰面積最高。

3.3 相似度分析

以生成的對(duì)照指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算16 批次甘松樣品的相似度，結(jié)果如表3 所示，樣品相似度為0.943～0.999，其中四川甘松相似度為 0.943～0.974，平均相似度為0.956；青海甘松相似度為0.981～0.999，相似度較高，平均相似度為0.997；甘肅甘松相似度為0.959，表明各批次甘松樣品之間不同峰面積對(duì)應(yīng)的成分含量存在一定差異，可通過(guò)指紋圖相似度結(jié)果將青海甘松分別與四川、甘肅甘松進(jìn)行區(qū)分，但甘肅甘松并未能通過(guò)指紋圖譜相似度與四川甘松進(jìn)行有效區(qū)分。從平均相似度來(lái)看，呈現(xiàn)青海＞甘肅＞四川的趨勢(shì)。

表3 16 批次甘松樣品HPLC 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 HPLC fingerprint similarity evaluation results of 16 batches of N. jatamansi samples

3.4 化學(xué)模式識(shí)別

3.4.1 HCA 以指紋圖譜60 個(gè)共有峰的峰面積為變量，進(jìn)行min-max 標(biāo)準(zhǔn)化處理，導(dǎo)入SPSS 25.0軟件，采用組間聯(lián)接、歐式距離法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖3 所示，各色塊顏色由藍(lán)至紅分別代表各化合物峰面積由低到高，當(dāng)距離為20 時(shí)，16 批甘松樣品可聚為2 類，其中5 批甘松（S1～S3、S6、S15）聚為第1 類，分別產(chǎn)自四川阿壩州、青海河南縣、甘肅瑪曲縣；其余甘松（S4、S5、S7～S14、S16）聚為第2 類，均產(chǎn)自青海河南縣；當(dāng)距離為15 時(shí)，16 批甘松樣品可聚為3 類，其中3 批甘松（S1～S3）聚為第1 類，產(chǎn)自四川阿壩州，此類樣品各共有峰代表的化學(xué)成分含量高低不一；2 批甘松（S6、S15）聚為第2 類，分別產(chǎn)自青海河南縣、甘肅瑪曲縣，此類樣品各共有峰代表的化學(xué)成分含量均相對(duì)較小；其余甘松（S4、S5、S7～S14、S16）聚為第3 類，均產(chǎn)自青海河南，此類樣品各共有峰代表的化學(xué)成分含量整體分布較為均勻，且各成分相對(duì)含量均處于較高水平。HCA 結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的甘松藥材質(zhì)量存在一定的差異，除S6 外，均可按其產(chǎn)地來(lái)源進(jìn)行有效區(qū)分。

圖3 甘松60 個(gè)共有峰的聚類分析熱圖Fig.3 Cluster analysis heat map of 60 common peaks of N.jatamansi

3.4.2 PCA 以60 個(gè)共有峰的峰面積為變量，得到16×60 階數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PCA，以主成分特征值＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到7個(gè)主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率為94.503%，說(shuō)明這7 個(gè)主成分能充分代表甘松藥材的基本特征和主要信息。特征值及貢獻(xiàn)率見(jiàn)表4。

表4 特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic values and variance contribution rate

進(jìn)一步通過(guò)將各特征向量標(biāo)準(zhǔn)化后，由PC1（52.408%）和PC2（16.338%）為坐標(biāo)軸構(gòu)建的PCA得分散點(diǎn)圖可以看出不同產(chǎn)地的甘松樣品（除S6外）明顯分開，如圖4，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的16 批樣品被分為3 類，與HCA 結(jié)果完全一致。

圖4 16 批不同產(chǎn)地甘松樣品的PCA 散點(diǎn)得分圖Fig.4 Scatter plot of PCA scores of 16 batches of N.jatamansi samples of different origins

因子載荷矩陣反映了各主成分與60 個(gè)共有峰即原始變量之間的相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表5。結(jié)果表明，主成分1 主要反映了色譜峰3、4、7、9～22、24、26～31、34、37～39、41、42、44～50、52～56、58、59 的信息，主成分2 主要反映了色譜峰1、2、5、6、23、33、35、36、40、57 的信息，主成分3主要反映了色譜峰8、25、32 的信息，主成分4 主要反映了色譜峰43 的信息，主成分5 主要反映了色譜峰60 的信息，主成分6 主要反映了色譜峰56的信息，主成分7 主要反映了色譜峰51 的信息。

表5 因子載荷矩陣Table 5 Factor load matrix

3.4.3 OPLS-DA 為了更好地分析不同產(chǎn)地甘松樣本之間的差異，采用SMICA 14.1 軟件對(duì)16 批甘松藥材60 個(gè)共有峰進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA（模型的擬合效果通常通過(guò)R2X、R2Y、Q2這3 個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)，這些指標(biāo)大于0.5 較為可信，并且越接近1說(shuō)明模型的擬合效果越好[25-27]）散點(diǎn)得分圖見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，同HCA 和PCA 一致，分為3 類。200 次置換檢驗(yàn)顯示該模型不存在過(guò)擬合（圖6）。變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，VIP 值越高，對(duì)組間差異的影響越大[28]。以VIP＞1 篩選出差異化合物，由VIP 得分圖（圖7）可知，貢獻(xiàn)值較大的差異化合物有31 個(gè)，依次為35、57、40、33、45、23、28、38、36、30、48、9、52、49、50、41、44、55、7、18、34、59、31、26、13、27、17、46、20、29、54 號(hào)峰，其中7 號(hào)峰為綠原酸，13 號(hào)峰為丁香酸、50 號(hào)峰為甘松新酮，55 號(hào)峰為馬兜鈴?fù)?，這些化合物是甘松各批次樣品間產(chǎn)生差異的主要標(biāo)志性成分，提示在甘松的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)中，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這些成分的含量變化。而32 號(hào)峰為蒙花苷，但32 號(hào)峰并未出現(xiàn)在VIP＞1 的色譜峰中，則基于本研究樣本，提示它可能不是甘松質(zhì)量差異的主要成分。

圖5 16 批甘松藥材OPLS-DA 圖Fig.5 OPLS-DA analysis of 16 batches of N. jatamansi

圖6 不同產(chǎn)地甘松200 次置換檢驗(yàn)OPLS-DA 模型驗(yàn)證Fig.6 Validation of OPLS-DA model for 200 times replacement test of N. jatamansi of different origin

圖7 不同產(chǎn)地甘松各成分VIP 圖Fig.7 VIP diagram of each component of N. jatamansi of different origins

3.4.4 指紋圖譜綜合評(píng)價(jià) 運(yùn)用SPSS 25.0 軟件計(jì)算16 批次甘松樣品的主成分得分，以各主成分對(duì)應(yīng)的貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)計(jì)算綜合得分，并將其排序，見(jiàn)表6。由表可知，S4、S7、S10 3 個(gè)批次甘松綜合得分位居前3，因此，以60 個(gè)共有峰峰面積為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，可得S4、S7、S10 3 個(gè)批次甘松質(zhì)量較好，S6 和S15 排名最后。

表6 16 批次甘松的主成分因子得分和排序Table 6 Principal component factor scores and ranking of 16 batches of N. jatamansi

3.5 不同產(chǎn)地甘松的化學(xué)成分含量測(cè)定

由甘松HPLC 指紋圖譜共指認(rèn)出5 個(gè)共有化學(xué)成分，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。由表可以看出不同產(chǎn)地批次甘松中5 個(gè)指標(biāo)成分含量存在差異。不同產(chǎn)地甘松藥材平均含量為甘松新酮＞馬兜鈴?fù)揪G原酸＞丁香酸＞蒙花苷。青海（除S6 的綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.447 6 mg/g 外）、四川、甘肅甘松的綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為均在2.302 9 mg/g 以上、1.046 5～1.670 3 mg/g、1.997 2 mg/g，呈現(xiàn)青海＞甘肅＞四川的趨勢(shì)；四川甘松中丁香酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于0.041 4 mg/g，整體小于甘肅、青海（除S6 的丁香酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.028 4 mg/g 外）甘松中丁香酸的含量，可作為四川甘松與其他產(chǎn)地甘松區(qū)分的指標(biāo)成分；蒙花苷含量在甘肅甘松中達(dá)到最低（0.016 7 mg/g），明顯低于其他產(chǎn)區(qū)甘松，可作為區(qū)分甘肅甘松與其他產(chǎn)區(qū)甘松的指標(biāo)成分；甘松新酮在青海、四川、甘肅甘松中質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次降低，分別為14.570 2～37.869 1 mg/g、10.900 6～13.817 1 mg/g、7.442 1 mg/g；青海（除S6 的馬兜鈴?fù)|(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.246 1 mg/g 外）、四川、甘肅甘松的馬兜鈴?fù)|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為均在2.506 8 mg/g 以上、1.850 2～2.223 2 mg/g、0.673 7 mg/g；青海（除S6 的5 種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.310 5 mg/g 外）、四川、甘肅甘松的5 種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為均在30.759 9 mg/g以上、14.137 8～17.369 8 mg/g、10.182 6 mg/g。甘松新酮、馬兜鈴?fù)? 種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)青海＞四川＞甘肅的趨勢(shì)，表明綠原酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)? 種成分總含量可作為3 產(chǎn)地甘松相互區(qū)分的指標(biāo)成分。

表7 16 批次甘松中5 個(gè)化學(xué)成分的含量 (n＝3)Table 7 Contents of five chemical components in 16 batches of N. jatamansi (n＝3)

通過(guò)分析含量測(cè)定結(jié)果柱形圖（圖8），可以看到VIP＞1 的4 個(gè)差異性成分（綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)┑暮吭诓煌a(chǎn)地間存在顯著差異，且均為青海產(chǎn)甘松平均含量最高，且在平均含量水平上，綠原酸和丁香酸呈現(xiàn)青海＞甘肅＞四川的趨勢(shì)，甘松新酮和馬兜鈴?fù)尸F(xiàn)青海＞四川＞甘肅的趨勢(shì)，蒙花苷在不同產(chǎn)地批次樣本間也存在顯著差異，平均含量為四川＞青海＞甘肅，但其VIP＜1，故基于本研究結(jié)果，可將綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)? 種指標(biāo)成分作為評(píng)價(jià)甘松質(zhì)量差異潛在的標(biāo)志成分。

圖8 5 個(gè)指標(biāo)成分含量測(cè)定柱形圖Fig.8 Content determination bar graph of five index components

將綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)? 種指標(biāo)成分含量進(jìn)行min-max 歸一化處理后，采用組間聯(lián)接、歐式距離法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見(jiàn)圖9，可知不同樣本間，當(dāng)歐氏距離為15 時(shí)，16 批甘肅樣本可分為2 類，其中S4、S5、S7～S14、S16 聚為第1 類，此類含萜類（甘松新酮、馬兜鈴?fù)⒈奖仡悾ňG原酸）、酚類（丁香酸）成分含量均較高，其中綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)孔罡叩姆謩e為S16、S12、S4 樣本。S1～S3、S6 及S15 聚為第2 類，此類含上述4 種成分含量均較少，其中綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)孔畹偷姆謩e為S2、S6、S15 樣本，此聚類結(jié)果與60 個(gè)共有峰聚類結(jié)果完全相同。而在不同成分間，甘松新酮、馬兜鈴?fù)鶎儆谳祁惓煞?，聚為一類，綠原酸、丁香酸分別屬于苯丙素類、酚類，各自聚為一類。依據(jù)4 種成分含量聚類結(jié)果，可將不同產(chǎn)地甘松進(jìn)行有效區(qū)分，進(jìn)一步驗(yàn)證了這4 種指標(biāo)成分作為甘松的潛在質(zhì)量標(biāo)志物的合理性。

圖9 4 種指標(biāo)成分聚類分析熱圖Fig.9 Heat map of cluster analysis of four index components

4 討論

本研究以甘松為研究對(duì)象，收集了16 批不同產(chǎn)地甘松樣品進(jìn)行指紋圖譜和多成分含量測(cè)定研究，并通過(guò)相似度分析、HCA、PCA 以及OPLSDA 綜合評(píng)價(jià)甘松的質(zhì)量。通過(guò)考察提取方法（95%乙醇回流提取、95%乙醇超聲提取）、提取時(shí)間（15、30、45 min）對(duì)提取結(jié)果的影響，最終確定以95%乙醇超聲提取30 min 作為供試品溶液提取方法?？疾觳煌ㄩL(zhǎng)（254、275、326 nm）下指紋圖譜色譜峰數(shù)量、峰型和分離度，同時(shí)對(duì)各波長(zhǎng)下綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴?fù)? 種成分進(jìn)行含量檢測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)275 nm 下各色譜峰的響應(yīng)較高且分離度較好，因此選用275 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究對(duì)16 批次不同產(chǎn)地甘松指紋圖譜進(jìn)行研究，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法分析，首次對(duì)甘松中丁香酸和馬兜鈴?fù)? 種化學(xué)成分于同一HPLC 色譜條件下進(jìn)行指認(rèn)并定量分析，對(duì)甘松的多成分控制藥材質(zhì)量進(jìn)行了補(bǔ)充，使其質(zhì)量評(píng)價(jià)更為全面客觀。在指紋圖譜相似度分析中，16 批次樣品相似度均高于0.943，表明采集到的16 批甘松的化學(xué)成分組成較為相似，但各批次樣品之間化學(xué)成分含量存在一定差異，指紋圖譜相似度結(jié)果將青海甘松分別與四川、甘肅甘松進(jìn)行區(qū)分，而甘肅甘松未能通過(guò)指紋圖譜相似度與四川甘松進(jìn)行有效區(qū)分，可能是因?yàn)楦仕芍胁煌煞址迕娣e對(duì)應(yīng)的含量變化對(duì)相似度結(jié)果有抵消作用[29]，進(jìn)一步分析不同產(chǎn)地甘松平均相似度，呈現(xiàn)青海＞甘肅＞四川的趨勢(shì)。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，16 批樣品中5 種成分含量差異較大，綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.046 5～4.975 3 mg/g、丁香酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.028 4～0.108 7 mg/g、蒙花苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.016 7～0.157 4 mg/g、甘松新酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.442 1～37.869 1 mg/g、馬兜鈴?fù)馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.673 7～4.306 5 mg/g。5 種成分在不同產(chǎn)地間均呈現(xiàn)顯著性差異，且平均含量從高到低依次為甘松新酮＞馬兜鈴?fù)揪G原酸＞丁香酸＞蒙花苷。

HCA、PCA、OPLS-DA 結(jié)果均顯示，四川阿壩州產(chǎn)甘松（S1～S3）聚為第1 類，青海河南縣、甘肅瑪曲縣產(chǎn)甘松（S6、S15）聚為第2 類，青海河南縣產(chǎn)甘松（S4、S5、S7～S14、S16）聚為第3 類。本研究S6 與S15 無(wú)法區(qū)分的原因可能是因?yàn)? 批樣品各共有峰代表的化學(xué)成分相對(duì)含量均較低，且較為接近，導(dǎo)致兩者無(wú)法區(qū)分；也可能是生長(zhǎng)年限不同，由于本研究甘松樣本均為野生采挖，且甘松為多年草本植物，《中國(guó)藥典》2020 年版對(duì)其生長(zhǎng)年限并未作出明確規(guī)定，文獻(xiàn)研究表明其生長(zhǎng)年限的不同會(huì)對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響[25,30]，生長(zhǎng)年限等信息的不明確，亦會(huì)影響聚類分析的結(jié)果；另氣候環(huán)境、經(jīng)緯度、海拔等的影響，也會(huì)導(dǎo)致對(duì)樣本的區(qū)分能力較弱。

本研究結(jié)果表明，青海甘松中綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)钠骄|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.123 5、0.077 9、29.038 2、2.887 5 mg/g，整體高于其他產(chǎn)區(qū)，特別是甘松新酮作為《中國(guó)藥典》2020年版甘松項(xiàng)下限定質(zhì)控指標(biāo)成分，在四川甘松中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.900 6～13.817 1 mg/g，青海甘松中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.570 2～37.869 1 mg/g，甘肅甘松中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.442 1 mg/g，甘松新酮可將3 產(chǎn)地甘松完全區(qū)分；另OPLS-DA 這4 種成分均屬于VIP＞1 的差異成分，顯著性分析也顯示4 種成分的含量在不同產(chǎn)地間存在顯著差異，表明本研究確定綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)鳛楦仕傻馁|(zhì)量差異的特異性標(biāo)志成分是合理的。

本研究采用HPLC 法對(duì)收集到的16 批次甘松藥材建立指紋圖譜，并對(duì)其中綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮和馬兜鈴?fù)暮窟M(jìn)行比較分析，運(yùn)用PCA 和HCA，對(duì)其共有峰進(jìn)行分析，構(gòu)建甘松藥材的主成分綜合評(píng)價(jià)模型，結(jié)合OPLS-DA 篩選不同批次甘松藥材的差異成分，為甘松藥材的質(zhì)量控制全面化、規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化提供參考依據(jù)。本研究建立的甘松指紋圖譜及5 種成分含量測(cè)定方法可為甘松原料藥材的質(zhì)量差異性評(píng)價(jià)提供科學(xué)方法，可為甘松藥材市場(chǎng)流通的等級(jí)劃分提供參考依據(jù)，以保障優(yōu)質(zhì)的甘松藥材能夠應(yīng)用于中醫(yī)藥臨床。

本課題組前期已開展了基于“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接-藥效學(xué)驗(yàn)證”的甘松“理氣止痛、開郁醒脾”功效質(zhì)量標(biāo)志物研究，為確定綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴?fù)茸鳛楦仕少|(zhì)量標(biāo)志成分提供了有效支撐，相關(guān)研究結(jié)果另行發(fā)表。另由于甘松藥材資源多為野生，且生長(zhǎng)環(huán)境多為藏區(qū)，分布區(qū)域有限，資源相對(duì)匱乏，樣本獲取難度較大，課題組近半年通過(guò)努力采集收集了甘肅、四川等地產(chǎn)甘松，但樣本持有量仍非常有限。但為了盡快推進(jìn)甘松藥材研究，課題組對(duì)有限的樣本進(jìn)行了多成分定量及指紋圖譜研究，以期為甘松藥材的資源整合、有效開發(fā)利用提供有益參考。另本課題組后續(xù)研究將考慮在HPLC 指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)GC-MS測(cè)定甘松揮發(fā)性成分、ICP-MS 測(cè)定無(wú)機(jī)元素等，結(jié)合甘松藥理藥效，實(shí)現(xiàn)基于甘松揮發(fā)性成分、無(wú)機(jī)元素指紋圖譜的譜效相關(guān)研究，為甘松產(chǎn)地區(qū)分及質(zhì)量標(biāo)志物的確立提供更為全面的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突