基于UPLC 多指標(biāo)含量測(cè)定和指紋圖譜的不同種質(zhì)金銀花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

王 淑，張翠翠，郭鳳丹，孫新茹，李圣波，林慧彬*，管仁偉*

1. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014

2. 山東亞特生態(tài)技術(shù)股份有限公司，山東 臨沂 276017

金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb. 的干燥花蕾或帶初開的花，屬臨床常用大宗中藥材[1]，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，可用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥。金銀花原植物分布廣泛，在長(zhǎng)期的馴化栽培過(guò)程中，形成許多不同類型的地方品種，而且引進(jìn)一些國(guó)外品種，其外觀性狀、活性成分等方面存在差異[2]，是影響其品質(zhì)的重要因素。與性狀鑒別相比，活性成分分析能更客觀、精準(zhǔn)的揭示種間、種內(nèi)的差異，近年來(lái)在金銀花質(zhì)量評(píng)價(jià)研究中得到廣泛應(yīng)用[3]。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜儀，建立一種指紋圖譜和含量測(cè)定分析方法，對(duì)41 批不同種質(zhì)不同發(fā)育期金銀花進(jìn)行指紋圖譜分析、化學(xué)模式識(shí)別分析及含量測(cè)定，從化學(xué)成分方面系統(tǒng)整體研究不同種質(zhì)金銀花之間的質(zhì)量差異，為金銀花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1290 型超高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；ME204E 型萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；XS205DU 型十萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際有限公司）；JM-30D-40 型液晶單頻超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；WGH201 型純水機(jī)（日本YAMATO 科學(xué)株式會(huì)社）。

1.2 材料

新綠原酸（批號(hào)D23GB172337）、異綠原酸A（ 批號(hào) P11D11L134209）、 隱綠原酸（批號(hào)M06GB147634）、馬錢苷（批號(hào)20120427）、咖啡酸（ 批 號(hào) M27GB143417 ）、 蘆 丁 （ 批 號(hào)T20N11Z131674）、當(dāng)藥苷（批號(hào)P31M7F12286）、木犀草苷（批號(hào)Y19A8H34394），以上對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；斷氧化馬錢子苷（批號(hào)ST20380110）、異綠原酸B（批號(hào)ST06590120）、異綠原酸C（批號(hào)ST06600120），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%，以上對(duì)照品均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；綠原酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%，批號(hào)110753-201716），對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

41 批不同種質(zhì)金銀花藥材于2022 年5 月27日采自山東亞特藥用植物生態(tài)園，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定為忍冬L.japonicaThunb.。對(duì)10 個(gè)種質(zhì)金銀花不同發(fā)育期（三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期）藥材進(jìn)行采集，共采集到41 個(gè)樣品，烘干備用。藥材來(lái)源信息見表1。

表1 金銀花樣品來(lái)源Table 1 Source of Lonicerae Japonicae Flos samples

甲醇、乙腈（product of DNK，美國(guó)，色譜純）；磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取金銀花粉末（過(guò)四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率512 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、當(dāng)藥苷、斷氧化馬錢子苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C 對(duì)照品適量，精密稱定，置量瓶中，加75%甲醇制成含0.92、2.08、1.46、1.44、2.14、1.12、2.04、2.06、0.09、0.88、0.96、2.64 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取以上12 種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加75%甲醇配制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、當(dāng)藥苷、斷氧化馬錢子苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C 分別為29.01、211.22、14.16、30.74、37.63、60.02、82.55、49.16、24.90、25.19、66.87、36.56 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

Agilent 1290 型超高效液相色譜儀；Thermo AccucoreTMC18色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），二元梯度洗脫程序：0～4 min，8% A；4～6 min，8%～10%A；6～7 min，10% A；7～10 min，10%～14% A；10～27 min，14%～15% A；27～35 min，15%～25%A；35～40 min，25% A；柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)0～13.5 min，324 nm；13.5～18 min，238 nm；18～27 min，354 nm；27～40 min，324 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下建立的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄12 個(gè)對(duì)照品色譜峰的峰面積。峰面積的RSD 為0.06%～2.03%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取金銀花藥材粉末，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算12 個(gè)對(duì)照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為0.69%～3.69%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取金銀花供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄12 個(gè)對(duì)照品色譜峰的峰面積。各對(duì)照品色譜峰峰面積RSD 為0.31%～1.72%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、當(dāng)藥苷、斷氧化馬錢子苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C 儲(chǔ)備液適量，分別用75%甲醇配制成6 個(gè)質(zhì)量濃度系列的對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得12 種成分的回歸方程與線性范圍，見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 2 Linear relationship results

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定12 種成分含量的金銀花樣品6 份，每份約0.25 g，按對(duì)照品與樣品含量比為1∶1 的比例加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、當(dāng)藥苷、斷氧化馬錢子苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、當(dāng)藥苷、斷氧化馬錢子苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C的加樣回收率分別為101.8%、100.2%、101.7%、101.5%、100.8%、96.36%、98.99%、97.60%、98.79%、103.1%、98.12%、99.85%，RSD 值分別為2.83%、2.44%、2.34%、1.29%、2.13%、2.07%、2.54%、2.69%、2.49%、2.78%、1.86%、2.62%。

2.5 樣品含量測(cè)定

取41 批不同種質(zhì)金銀花藥材粉末，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。由表可知，41 批不同種質(zhì)金銀花的不同發(fā)育期藥材中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、當(dāng)藥苷、斷氧化馬錢子苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 12 種化學(xué)成分的含量變化范圍分別為0.35～1.20 mg/g、8.60～50.21 mg/g、0.16～1.01 mg/g、0.16～0.31 mg/g、0.50～2.58 mg/g、0.13～3.19 mg/g、1.4～45.57 mg/g、0.23～1.79 mg/g、0.18～1.23 mg/g、0.16～0.88 mg/g、3.78～30.62 mg/g、0.29～4.97 mg/g。表明12種化學(xué)成分的含量與不同種質(zhì)金銀花藥材密切相關(guān)，隨金銀花不同發(fā)育期而明顯變化，具有顯著差異，見圖1。

圖1 不同種質(zhì)金銀花不同發(fā)育期藥材的12 種化學(xué)成分含量測(cè)定折線圖Fig.1 Line chart for determination of 12 chemical components of different germplasm of Lonicerae Japonicae Flos at different development stages

表3 不同種質(zhì)金銀花不同發(fā)育期藥材的12 種化學(xué)成分含量測(cè)定Table 3 Determination of 12 chemical components in different germplasm of Lonicerae Japonicae Flos at different development stages

2.6 指紋圖譜的構(gòu)建及相似度分析

2.6.1 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)方法參考“2.4.1”“2.4.2”“2.4.3”項(xiàng)。精密度試驗(yàn)各對(duì)照品色譜相對(duì)峰面積RSD 在0.61%～2.77%，重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)峰面積RSD 為0.46%～2.81%，穩(wěn)定性試驗(yàn)相對(duì)峰面積RSD 為0.31%～1.72%，均符合要求。

2.6.2 指紋圖譜的構(gòu)建 取41 批不同種質(zhì)金銀花的不同發(fā)育期藥材粉末，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄UPLC 色譜圖，并導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》軟件，以S1 樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，對(duì)41 批樣品色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正和全峰匹配，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，以平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，41 批不同種質(zhì)金銀花的不同發(fā)育期藥材指紋圖譜共有模式見圖2。

圖2 不同種質(zhì)金銀花藥材指紋圖譜 (A) 和共有模式 (B)Fig.2 Fingerprint of different germplasm (A) and common pattern (B) of Lonicerae Japonicae Flos

指紋圖譜中共標(biāo)定共有峰11 個(gè)，其中指認(rèn)化學(xué)成分9 個(gè)，分別為新綠原酸（1 號(hào)峰）、綠原酸（2號(hào)峰）、隱綠原酸（3 號(hào)峰）、馬錢苷（4 號(hào)峰）、斷氧化馬錢子苷（5 號(hào)峰）、木犀草苷（7 號(hào)峰）、異綠原酸B（8 號(hào)峰）、異綠原酸A（9 號(hào)峰）、異綠原酸C（11 號(hào)峰）。

2.6.3 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件，計(jì)算金銀花指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，41 批不同種質(zhì)不同發(fā)育期金銀花的相似度在0.723～0.996，除S23 的相似度為0.723 以外，其余金銀花相似度均大于0.91。結(jié)果表明相同種質(zhì)金銀花不同發(fā)育期的藥材之間化學(xué)成分存在差異；除極少數(shù)發(fā)育期外，不同種質(zhì)金銀花相同發(fā)育期的藥材存在一定差異，但質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

表4 不同種質(zhì)金銀花不同發(fā)育期藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)Table 4 Similarity of fingerprint of different germplasm of Lonicerae Japonicae Flos at different development stages

2.7 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.7.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA 是一種無(wú)監(jiān)督化學(xué)模式識(shí)別，可使數(shù)據(jù)矩陣簡(jiǎn)化，降低維數(shù)，通過(guò)少數(shù)幾個(gè)主成分揭示數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征[4]。由于41 批不同種質(zhì)不同發(fā)育期金銀花的樣品中超過(guò)一半未檢測(cè)到咖啡酸，因此將41批樣品中除咖啡酸外的11 個(gè)化學(xué)成分峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，結(jié)果見圖3-A，亞特8 號(hào)美國(guó)忍冬、亞特4 號(hào)意大利忍冬與其他樣品顯著區(qū)分，表明不同種質(zhì)金銀花之間存在一定差異。不同發(fā)育期金銀花樣品也相互區(qū)分明顯，表明不同發(fā)育期金銀花藥材之間質(zhì)量存在差異。根據(jù)41 批不同種質(zhì)金銀花PCA分析結(jié)果、指紋圖譜分析結(jié)果、預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及樣品來(lái)源特點(diǎn)，從41 批不同種質(zhì)金銀花藥材中篩選區(qū)別較大且比較有研究意義的6 批金銀花亞特2 號(hào)、亞特立本、亞特4 號(hào)、亞特8 號(hào)、雞爪花、北花1號(hào)樣品進(jìn)一步進(jìn)行重點(diǎn)分析。將6 批不同種質(zhì)不同發(fā)育期金銀花的11 個(gè)化學(xué)成分峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果見圖3-B，6 批不同種質(zhì)金銀花樣品可以被區(qū)分。

圖3 PCA 得分圖Fig.3 PCA Score chart

2.7.2 正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLSDA） 進(jìn)一步采用OPLS-DA 對(duì)6 批不同種質(zhì)金銀花樣品進(jìn)行分析。將6 批不同種質(zhì)金銀花各發(fā)育期11 種化學(xué)成分含量進(jìn)行OPLS-DA，相同種質(zhì)金銀花樣品作為1 組，篩選不同種質(zhì)金銀花藥材的差異標(biāo)志物。結(jié)果如圖4-A 所示，OPLS-DA 得分圖表明各種質(zhì)被區(qū)分，并對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)定檢驗(yàn)數(shù)為200 次，如圖4-B 所示，左邊的R2點(diǎn)和Q2點(diǎn)均低于右邊，Q2點(diǎn)的回歸線與縱軸相交于原點(diǎn)以下，表明未產(chǎn)生過(guò)分?jǐn)M合，模型可靠。如圖4-C 所示，根據(jù)VIP 值＞1 篩選出4 種差異標(biāo)志物，分別為斷氧化馬錢子苷、新綠原酸、馬錢苷、隱綠原酸?？梢哉J(rèn)為這4 種差異標(biāo)志物是不同種質(zhì)金銀花質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)性成分。另外，木犀草苷、蘆丁、當(dāng)藥苷的VIP 值分別為0.999、0.991、0.988，均接近于1，可作為不同種質(zhì)金銀花質(zhì)量評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)性成分。

圖4 6 批不同種質(zhì)金銀花的OPLS-DA 圖Fig.4 OPLS-DA maps of six batches of Lonicerae Japonicae Flos with different germplasm

3 討論

3.1 UPLC 含量測(cè)定條件的優(yōu)化

超高液相色譜分析法是一種高效的液相技術(shù)[5]，具有分析速度快、分離度好、檢驗(yàn)準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)[6]，對(duì)中藥的成分分析、中藥鑒定等具有重要意義[7]。金銀花成分含量多以普通高效液相色譜儀單波長(zhǎng)檢測(cè)為主[8-9]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超高效液相色譜儀全波長(zhǎng)掃描，選擇12 種化學(xué)成分的最大吸收波長(zhǎng)，分波段檢測(cè)，可有效避免雜質(zhì)峰的影響，提高有效成分含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 不同發(fā)育期化學(xué)成分含量變化分析

本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)UPLC 分段波長(zhǎng)測(cè)得亞特2 號(hào)、亞特立本、亞特4 號(hào)、亞特5 號(hào)、亞特6 號(hào)、亞特7號(hào)、亞特8 號(hào)、雞爪花、小毛花、北花1 號(hào)不同發(fā)育期中12 種成分的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)不同發(fā)育期的化學(xué)成分含量存在較大變化。首先綠原酸含量變化特點(diǎn)為，亞特2 號(hào)、亞特4 號(hào)、亞特6 號(hào)、亞特8號(hào)、小毛花、北花1 號(hào)在未開花期含量較高，雞爪花在開花期含量較高，亞特立本、亞特7 號(hào)各發(fā)育期的綠原酸含量相差不大；其次，酚酸類成分綠原酸、異綠原酸A 和異綠原酸C 的總含量變化特點(diǎn)為，亞特2號(hào)、亞特4 號(hào)、亞特6 號(hào)、亞特7 號(hào)、亞特8 號(hào)、小毛花、北花1 號(hào)未開花期酚酸類成分含量較高，雞爪花開花期酚酸類成分含量較高，亞特立本各發(fā)育期酚酸類成分含量相差不大。

3.3 指紋圖譜的建立與相似度分析

中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，可以反映中藥的整體化學(xué)特征[10]。目前，金銀花指紋圖譜主要是不同產(chǎn)地[11]、不同采收期[12]的研究，不同種質(zhì)金銀花的研究種類多為2～5種。本實(shí)驗(yàn)首次建立了對(duì)10 種不同種質(zhì)金銀花不同發(fā)育期藥材的指紋圖譜，種質(zhì)豐富，且涵蓋了國(guó)外引進(jìn)的品種。

相似度分析結(jié)果顯示，除亞特8 號(hào)三青時(shí)期的相似度為0.723 外，其余金銀花樣品相似度均大于0.91，表明不同種質(zhì)金銀花存在差異，但質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。亞特8 號(hào)原產(chǎn)地為美國(guó)，該品種金銀花具有特殊香氣，且一年開花茬數(shù)較多，表明該種質(zhì)具有一定的特殊性。

3.4 化學(xué)模式識(shí)別研究

化學(xué)模式識(shí)別將中藥的復(fù)雜成分轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)數(shù)據(jù)的解析，更有利于從整體上對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)與控制，在中藥質(zhì)量控制中的運(yùn)用越來(lái)越廣泛[13-14]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)10 種金銀花進(jìn)行PCA，亞特4 號(hào)、亞特8 號(hào)被顯著區(qū)分，且亞特8 號(hào)的PCA 結(jié)果與指紋圖譜分析結(jié)果一致，均被明顯區(qū)分。通過(guò)前期的PCA分析結(jié)果及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從上述10 種金銀花中篩選出亞特2 號(hào)、亞特立本、亞特4 號(hào)、亞特8 號(hào)、雞爪花、北花1 號(hào)6 種，6 種不同種質(zhì)不同發(fā)育期金銀花通過(guò)PCA、OPLS-DA 被明顯區(qū)分，并根據(jù)VIP 值＞1 篩選獲得斷氧化馬錢子苷、新綠原酸、馬錢苷、隱綠原酸4 種質(zhì)量差異標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UPLC 指紋圖譜與多成分化學(xué)模式識(shí)別研究相結(jié)合的方式，可有效評(píng)價(jià)不同種質(zhì)金銀花藥材的質(zhì)量差異性，為不同種質(zhì)金銀花鑒別提供新思路，為不同種質(zhì)不同發(fā)育期金銀花的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突