遠志細胞色素P450 家族PtCYP72A546 克隆、亞細胞定位與表達分析

羅 瑤，凈易堯，胡本祥, ，楊冰月，姬海月，顏永剛，張 崗，趙 璠，彭 亮*

1. 陜西中醫(yī)藥大學 藥學院/陜西省秦嶺中草藥應用開發(fā)工程技術研究中心/“秦藥”研發(fā)重點實驗室，陜西 咸陽 712046

2. 陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 712046

3. 榆林市第五醫(yī)院，陜西 榆林 719000

遠志是遠志科多年生草本植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠志P.sibiricaL.的干燥根，始載于《神農本草經》，味苦、辛，性溫，具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫的功效[1]。遠志為我國85 種傳統(tǒng)出口大宗藥材及42 種重點保護的三級野生品種之一，是臨床益智藥處方中名列前3 位的單味中草藥，被視為養(yǎng)命之要藥[2]。遠志廣泛分布于中國西北、華北和東北地區(qū)，以陜西、山西量大質優(yōu)，是一種適應性極強的中旱生植物耐干旱而怕水澇[3]。遠志中的主要活性成分為齊墩果烷型三萜皂苷，具有增強學習記憶、鎮(zhèn)靜、抗抑郁等藥理作用[4]。在高等植物中，齊墩果烷型三萜類化合物的生物合成歷經前體供應、骨架合成、萜類合成3 個階段。第3 階段由β-香樹脂醇合成酶（β-amyrin synthas，β-AS）催化2,3-氧化鯊烯（2,3-oxidosqualene，OS）形成β-香樹脂醇，然后β-香樹脂醇在CYP450 作用下使C-28 氧化生成齊墩果酸，最終由CYP450 和UGTs 催化產生官能化反應形成復雜多樣的三萜類成分[5-6]。細胞色素 P450（cytochrome P450，CYP450）是植物體內最大的酶家族[7]，具有半胱氨酸-亞鐵血紅素結構[8]，因其可以催化氧分子進行還原性分離從而具有廣泛的催化活性，主要參與萜類、生物堿、脂類、植物激素等的生物合成[9]，CYP450 催化的結構修飾是實現三萜皂苷多樣化和功能化的關鍵，系三萜類成分生物合成途徑的關鍵酶[10]。P450 基因在植物的生長及發(fā)育過程具有關鍵作用，可提高植物對各種生物及非生物脅迫的抗性[11]，楊杰等[12]研究表明白樺細胞色素P450 具有組織特異性以及激素誘導表達特性，可能在白樺生長發(fā)育、抵御脅迫及代謝物合成中發(fā)揮重要作用。植物激素在植物生長發(fā)育及抵御、適應逆境環(huán)境中發(fā)揮重要作用。

本實驗通過PCR 克隆得到了遠志CYP72A546基因，并對其進行生物信息學、激素和非生物脅迫響應分析，有助于深入探討CYP450 基因在遠志植株防御反應中的重要作用，為科學闡明遠志皂苷類成分生物合成途徑及調控機制提供證據及通過遺傳工程改良藥材品質奠定了基礎，可為進一步探索遠志CYP450基因功能提供依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

樣品于2021 年10 月陜西中醫(yī)藥大學藥用植物園（陜西咸陽）采集，經陜西中醫(yī)藥大學胡本祥教授鑒定為3 年生遠志P.tenuifoliaWilld.及其成熟種子。

1.2 酶和主要試劑

脫落酸（abscisic acid，ABA）、殼聚糖（chitosan，CHT）（購自上海源葉生物科技有限公司）；Trizol 總RNA 提取試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、ddH2O 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Rapid Taq Master Mix（2×）、HiPure Plasmid Micro Kit C 質粒小提試劑盒均購自諾唯贊生物科技股份有限公司（南京），PrimeScriptTMII 1st strand cDNA Synthesis Kit、TB Green?Premix Ex Taq?、T-Vector pMD?19、UEDNA 凝膠回收試盒均購自TaKaRa 公司；本實驗所用引物由武漢金開瑞生物公司合成；序列測定由楊凌奧科生物科技有限公司完成。

1.3 儀器

ZQPW-70 型全溫振蕩培養(yǎng)箱（天津市萊玻特瑞公司），HFsafe-1200LC 型超凈工作臺（上海力申公司），Centrifuge5424 型高速離心機（德國Eppendorf公司），T100TMThermal Cycler PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），DYY-6D 型電泳儀（北京六一公司），StepOnePlus? Real-Time PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司），SYNGENE GBOX 凝膠成像系統(tǒng)（基因有限公司），NanoDropTM 2000 型分光光度計（美國Thermo-Fisher 公司），K5800 型自動檢測超微量分光光度計（凱奧公司），HH-B11·360-BS 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、GR60DA 型高溫滅菌鍋（美國Zealway公司），分析天平（上海舜宇恒平公司），-80 ℃超低溫冰箱（中科美菱公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

取生長一致的3 年生遠志3 株，將根、莖、葉等量混合進行全長轉錄組測序分析。在相同條件下，采集遠志不同組織（根、莖、葉）用于進一步分析。綜合課題組前期實驗結果結合相關研究，分為激素處理組：殼聚糖（CHT，200 μmol/L）、脫落酸（ABA，200 μmol/L）；非生物脅迫處理組：干旱（PEG 6000，10%）、鹽（NaCl，100 mmol/L）；噴施無菌水作為對照組（Mock），所有樣品均于處理后0、6、12、24 和48 h 進行取樣，以0 h 為空白對照，每個處理組的每個處理時間點做3 個樣本重復，經液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱。

2.2 RNA 提取及cDNA 合成

取3 株遠志植株充分混合后，液氮速凍并充分粉碎后使用Trizol 試劑盒提取總RNA，提取方法參照其說明書進行，并用使用Prime ScriptTMII 1st strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA 后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 基因克隆

以cDNA 作為模板，以CYP72A546-F/R（表1）作為引物進行PCR 擴增。25 μL 標準體系：Rapid Taq Master Mix（2×）12.5 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL 和DNA 模板 1 μL，ddH2O 9.5 μL 補齊。反應程序為95 ℃、3 min；95 ℃、15 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個循環(huán)數；72 ℃、5 min，12 ℃保溫。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，DNA 膠回收試劑盒純化回收目的片段后，與pMD19T 連接并轉化DH5α，挑取陽性克隆送楊凌奧科完成測序。

表1 PtCYP72A546 基因克隆及表達分析引物序列Table 1 Primer sequences for gene cloning and expression analyses of PtCYP72A546

2.4 生物信息學分析

利用軟件及在線工具（表2）對遠志CYP72A546進行生物信息分析預測。

表2 PtCYP72A546 基因生物信息軟件及網站Table 2 Bioinformatics software and websites for analyses of PtCYP72A546

2.5 基因表達模式

利用qPCR 檢測CYP72A546在遠志不同樣品中的相對表達量，以GAPDH為內參基因[13]，引物序列見表1。反應體系20 μL：TB Green?Premix Ex TaqTMII（TliRNaseHPlus）（2×）10 μL、Forward/Reverse Primer 各0.8 μL、DNA 模板2 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、ddH2O 6 μL。反應程序：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，60 ℃、34 s，40 個循環(huán)；之后繪制熔解曲線，條件為95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，3 次重復?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-△△Ct計算[14]，SPSS 27.0 統(tǒng)計分析，P＜0.05 代表有顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 基因克隆

基于課題組前期的遠志全長轉錄組測序及注釋結果，獲得一個PtCYP450基因，經PCR 擴增、測序分析和NCBI 比對，獲得了全長1 560 bp 的遠志基因CYP72A546，編碼519 個氨基酸，含有CYP450 的保守結構域，證實其為CYP450家族基因（圖1～3）。

圖1 PtCYP72A546 基因PCR 結果Fig.1 PCR results of PtCYP72A546

圖2 PtCYP72A546 基因cDNA 序列全長及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Complete cDNA and deduced amino acid sequences of PtCYP72A546

圖3 PtCYP72A546 蛋白的結構域分析Fig.3 Domain analysis of PtCYP72A546 protein

3.2 生物信息學分析

3.2.1 理化性質預測 從蛋白的相對分子質量、等電點、親疏水性、跨膜結構域、磷酸化位點等方面對PtCYP72A546 編碼蛋白進行多方位預測分析。結果表明，PtCYP72A546 蛋白相對分子質量為59 770，分子式為C2740H4287N713O748S18，原子總數為8 506，理論等電點為5.02，屬酸性蛋白。親疏水性預測顯示，PtCYP72A546 蛋白的親水系數為0.774，不穩(wěn)定系數為39.13，系穩(wěn)定性疏水性蛋白（圖4）。明確目標蛋白磷酸化位點及水平可為該蛋白特性研究提供重要參考[15]，PtCYP72A546 蛋白磷酸化位點預測表明其存在多個磷酸化位點，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的位點個數分別為32、28 和14（圖5）。

圖4 PtCYP72A546 氨基酸疏水性預測Fig.4 Hydrophobicity prediction analysis of amino acid sequence of PtCYP72A546

圖5 PtCYP72A546 磷酸化位點預測Fig.5 Prediction of phosphorylation sites of PtCYP72A546

3.2.2 PtCYP72A546 蛋白跨膜區(qū)及信號肽分析蛋白跨膜結構域在細胞轉運、胞內信號轉導、生長調節(jié)等方面具有重要作用，信號肽則是引導新合成的蛋白質分泌通路轉移的短肽鏈，序列長度多數含有 5～30 個氨基酸[13,16]，結果表明，PtCYP72A546 蛋白僅有1 個跨膜結構域且不存在信號肽（圖6、7）。

圖6 PtCYP72A546 編碼蛋白跨膜結構域預測分析Fig.6 Prediction analysis of the transmembrane domain of protein encoded by gene PtCYP72A546

圖7 PtCYP72A546 蛋白信號肽預測結果Fig.7 Prediction of a signal peptide for PtCYP72A546 protein

3.2.3 CYP72A546 蛋白二級結構及分析 蛋白二級結構為多肽主鏈骨架原子沿一定的軸盤旋或折疊而形成的特定構象，有α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲等幾種主要形式，二級結構的預測可為研究蛋白質功能與結構關系提供參考依據[17]。PtCYP72A546 蛋白的二級結構預測結果見圖8，結合表3 分析可知，PtCYP72A546 蛋白α-螺旋結構、延伸主鏈結構、無規(guī)則卷曲結構和β-轉角氨基酸數目分別為271、59、155、34 個，占比依次為52.20%、11.37%、29.87%和6.55%。

圖8 PtCYP72A546 蛋白的二級結構預測Fig.8 Secondary structure prediction of PtCYP72A546 protein

3.2.4 CYP72A546 蛋白三級結構及分析 使用SWISS-MODEL 在線軟件預測分析PtCYP72A546蛋白三維結構，用Cytochrome P4504B1（SMTL ID：6c94.1）為模板，蛋白覆蓋率為100%，預測結果見圖9。

圖9 PtCYP72A546 蛋白的三級結構預測Fig.9 Prediction of tertiary structure of PtCYP72A546 protein

3.3 系統(tǒng)進化分析

從NCBI 數據庫中下載擬南芥（模式植物）及與遠志CYP72A546 氨基酸序列具有一定同源性的細胞色素P450 家族的氨基酸序列[甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、大豆Glycinemax(L.) Merr.、百脈根Lotuscorniculatus Linn.、豆科植物Gastrolobium bilobum、苜蓿MedicagosativaL.、擬南芥Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.、喜樹CamptothecaacuminataDecne.、芝麻SesamumindicumL.、煙草Nicotiana tabacumL.]共11 條。利用MEGA11 中的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，見圖10。本研究中所有CYP72A 亞家族基因編碼的蛋白聚為一大支，遠志和大豆、甘草、苜蓿、百脈根聚為一個分支，同源性較高。

3.4 PtCYP72A546 蛋白亞細胞定位分析

為研究PtCYP72A546 蛋白在細胞中的作用位置，構建pBWA(V)HS-PtCYP72A546-GLOSGFP 質粒瞬時轉化煙草葉片觀察其亞細胞定位情況。通過激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片表皮細胞發(fā)現，PtCYP72A546-GFP 融合蛋白在內質網上具有明顯信號（圖11）。

圖11 PtCYP72A546 蛋白在煙草葉片下表皮細胞中的亞細胞定位Fig.11 Subcellular localization of PtCYP72A546 protein in lower epidermal cells of tobacco leaves

3.5 PtCYP72A546 的表達模式

以遠志葉為參考樣本，qPCR 檢測CYP72A546基因在遠志根、莖和葉中的表達情況（圖12）。結果顯示，CYP72A546 在根中的表達顯著高于其他組織，分別為莖、葉的6.61、3.52 倍，說明PtCYP72A546主要在根中發(fā)揮生物學功能。

圖12 PtCYP72A546 在不同組織部位表達分析Fig.12 Expression analysis of PtCYP72A546 in different tissues

PtCYP72A546 響應外源激素（CHT、ABA）處理不同時間點（6、12、24、48 h）的表達情況見圖13-A，以0 h（CK）為空白對照：Mock 在處理6 h內迅速上調并達到峰值（為CK 的2.60 倍），后開始下調，處理48 h 后為CK 的0.18 倍；CHT 處理組與Mock 變化趨勢一致，處理6 h 上調至峰值（為CK 的5.49 倍），為同時間點Mock 和ABA 的2.11 和1.12倍。ABA 處理下PtCYP72A546 的相對表達量隨時間推移呈現先上升后下降的變化趨勢，在12 h 達到最高（為CK 的7.45 倍），為同時間點下Mock 和CHT 的4.86 和1.50 倍。PtCYP72A546 響應脅迫處理不同時間點的表達見圖13-B。CYP721A546 在PEG6000 處理下，相對表達量于12 h 達峰值（為CK 的4.98 倍），為同時間點Mock 和NaCl 的3.25 和1.30 倍；NaCl 處理24 h 顯著誘導（為CK 的5.14 倍），為同時間點Mock 和PEG 的19.61 和2.87 倍。

圖13 PtCYP72A546 響應激素 (A) 和非生物脅迫處理 (B) 的表達模式Fig.13 Expression pattern of PtCYP72A546 in response to hormones (A) and abiotic stress treatments (B)

4 討論

細胞色素P450 家族基因參與多種內源、外源物質的代謝途徑，廣泛存在于生物體內，目前已在植物中發(fā)現127 個CYP450 家族，在系統(tǒng)發(fā)生樹上被分為11 個具有明顯進化枝的簇[18]。相關研究表明，細胞色素P450 基因除了參與萜類及甾醇類化合物的合成，還可以催化生物體的生長發(fā)育[16]。近年來，關于P450 家族基因的篩選和挖掘，尤其是在藥用植物三萜皂苷生物合成途徑中的功能解析引發(fā)強烈關注[19]。

本實驗利用 PCR 技術克隆得到遠志CYP72A546 基因的全cDNA 序列，并對其進行了相關生物信息學分析。結果表明，PtCYP72A546 基因具有完整的ORF，并具有P450 家族的保守結構域，確定其為P450 家族基因；PtCYP72A546 蛋白具有1 個跨膜區(qū)但不存在信號肽，系疏水性穩(wěn)定蛋白；亞細胞定位結果顯示該蛋白主要位于內質網中。進化樹分析主要用于研究基因家族成員分類和進化關，有助于推測親緣關系密切相關的蛋白家族成員的生物學功能[20]，PtCYP72A546 與其他9 種植物CYP72 亞家族的分子進化關系分析表明，PtCYP72A546 編碼的蛋白屬于CYP72A 亞家族，主要與豆科植物 GuCYP72A153、LjCYP72A68、GmCYP72A68、GbCYP72A68、MtCYP72A68 聚為一支，推測可能具有相似的生物學功能。研究表明，遠志[21]、苜蓿[22]和大豆[23]等都含有齊墩果烷型三萜皂苷成分，且根據Biazzi 等[24]的報道，齊墩果烷型三萜皂苷物質的合成通常由CYP72 和/或CYP85 家族簇參與，如苜蓿 CYP72A61、CYP72A63、CYP72A67、CYP72A6 和甘草CYP72A154 都參與齊墩果烷三萜骨架的催化合成[25]，推測遠志CYP72A546基因可能具有參與齊墩果烷型三萜皂苷生物合成相關的生物學功能。

P450基因參與調控植物體內的多種新陳代謝反應，在維持植物的正常生長發(fā)育及脅迫響應調控生理機制中具有主導作用。P450基因的表達調控主要在轉錄水平，并具有組織器官的特異性，葉片直接暴露于大氣中，主要受環(huán)境變化影，而根主要受土壤微生態(tài)的影響較為顯著，這勢必導致P450基因在表達水平做出一定響應，從而可能在植物適應環(huán)境和介導次生代謝產物合成等方面發(fā)揮重要作用[26]。PtCYP72A546 主要在根中高表達，推測其可能通過調控遠志藥用部位根的生長發(fā)育及次生代謝進而影響遠志藥材品質。內源激素在調節(jié)植物體生理生化反應中起重要信號轉導的作用，而植物CYP450基因表達也與激素密切相關。PtCYP72A546 響應ABA及CHT 誘導，受激素誘導后表達量有明顯升高，旱、鹽脅迫均提高了PtCYP72A546 表達水平，表明它們可能通過參與多種生物學過程的調節(jié)影響遠志的生理和代謝。

本實驗通過基因克隆和生物信息學研究，初步判斷CYP72A546基因可能與合成遠志齊墩果烷型三萜皂苷下游反應有關，但其具體調控途徑和作用機制有待進一步研究。本究發(fā)現有助于進一步對參與遠志齊墩果烷型三萜皂苷合成的CYP450基因進行功能鑒定，也為遠志三萜皂苷類成分合成調控及遺傳改良提供科學支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突