防己黃芪湯在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究及其對(duì)T 淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

呂春明，侯 婷，張 寧，王 冰

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué) 科技實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203

2. 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203

防己黃芪湯出自張仲景《金匱要略方論》[1]，由防己、黃芪、白術(shù)和炙甘草按4∶5∶3∶2 比例組成。防己苦寒，可除濕利水消腫，兼能辛散祛風(fēng)；黃芪補(bǔ)氣健脾補(bǔ)肺，尤能固表行水，二藥配伍共為君藥，補(bǔ)氣除濕利水，祛風(fēng)散邪固表。白術(shù)補(bǔ)脾燥濕，既助黃芪補(bǔ)氣固表，又助防己祛濕利水，為方中臣藥。甘草益氣健脾，調(diào)和諸藥，為方中佐使藥。諸藥配伍，是治療水腫之常用方，可用于治療水濕內(nèi)停及脾腎虧虛之證[2]。目前，防己黃芪湯被廣泛用于治療自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3]、腎病綜合征[4]、慢性腎炎[5]、膝骨關(guān)節(jié)炎[6]，且該復(fù)方富含生物堿類、皂苷類、黃酮類及多糖類等活性成分[7]。多成分定量分析結(jié)果表明，粉防己堿是防己黃芪湯中含量最高的成分，為該方中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]，具有抗炎[9]、抗腫瘤[10]、抗纖維化[11]等藥理作用。

自身免疫性疾病是一種局部或全身性炎癥反應(yīng)的疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，主要影響因素涉及環(huán)境、遺傳及免疫等[12]。已有研究表明，CD4+T 細(xì)胞是自身免疫性疾病中的重要影響因素[13]。在一些自身免疫性疾病進(jìn)展中，輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）的功能受到影響[14-15]；此外，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的活性也被抑制[16]。Treg 可分泌免疫抑制性的細(xì)胞因子以維持機(jī)體自身免疫耐受，因此，調(diào)控Th 和Treg 之間平衡是治療自身免疫性疾病的關(guān)鍵。提示探討防己黃芪湯對(duì)T 細(xì)胞的調(diào)控作用有助于闡明防己黃芪湯治療自身免疫性疾病的機(jī)制。

由于防己黃芪湯組方成分復(fù)雜，目前對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)方法大多選擇其中幾個(gè)成分作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，難以反映復(fù)方整體水平，而且對(duì)防己黃芪湯有效成分在體內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究不全面，但了解這些成分在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)于揭示防己黃芪湯物質(zhì)基礎(chǔ)和配方規(guī)律具有重要意義。因此，本研究擬對(duì)防己黃芪湯進(jìn)行多成分表征的質(zhì)量評(píng)價(jià)，研究防己黃芪湯在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為，以揭示其主要入血成分的體內(nèi)過(guò)程；同時(shí)，為進(jìn)一步考察防己黃芪湯的藥效基礎(chǔ)，從Th 分化層面探討該復(fù)方在免疫方面的作用，為該復(fù)方的后續(xù)研究奠定了工作基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

體質(zhì)量（270±20）g 的清潔級(jí)雄性SD 大鼠和體質(zhì)量20～23 g 的SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001，許可證號(hào)SYXK（滬）2014-0008。實(shí)驗(yàn)前在室溫（22±2）℃、相對(duì)濕度45%～60%、每天光照12 h 的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作方法遵循上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定（批準(zhǔn)號(hào)201801006）。所有動(dòng)物研究均根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。

1.2 藥材

防己、黃芪、甘草、白術(shù)飲片均購(gòu)自上海康橋中藥飲片有限公司，批號(hào)分別為120901、131025、131029、130221，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心張寧研究員分別鑒定為防己科植物粉防己StephaniatetrandraS. Moore 的干燥根、豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao 的干燥根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖、菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

對(duì)照品木蘭花堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草次酸、黃芪甲苷、粉防己堿（批號(hào)分別為130611、121224、130204、110723、130816、121127，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%）購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司；甘草苷對(duì)照品（批號(hào) 1116010-201106，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93.7%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；地西泮（批號(hào)1159302，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)12483020）、RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)11875127）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR，批號(hào)100430）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所；刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA，批號(hào)C2272）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)201608）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；肝素鈉（批號(hào)20150526）購(gòu)自國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)11814389001）購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司；抗小鼠白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、IL-2、γ-干擾素（γ-interferon，IFN-γ）捕獲抗體（批號(hào)分別為560268、554424、551309）購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences 公司；生物素化抗小鼠IL-17、IL-2、IFN-γ 檢測(cè)抗體（批號(hào)分別為BAF421、BAF402、BAF485）購(gòu)自美國(guó)R&D Systems 公司；RIPA 裂解液（批號(hào)P00138）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CD4-PE、CD25-PE-Cy7 和FoxP3-APC 流式抗體（批號(hào)分別為12004382、25025742、4303851）購(gòu)自Affymetrix eBioscience 公司；水為超純水，甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

UltiMate 3000 型超高效液相色譜-TSQ Quantum Access Max 型三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國(guó)Thermo 公司）；Centrifuge 5810R 型冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；CP225D 型1/10 萬(wàn)電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；PowerWave XS2 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；MicroBeta TriLux/JET 閃爍/發(fā)光計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Perkin Elmer 公司）。

2 方法

2.1 防己黃芪湯的制備

結(jié)合防己黃芪湯原方[1]，按《方劑學(xué)》第7 版（鄧中甲主編）記載，確定其處方組成為防己1 兩（12 g）、黃芪1 兩1 分（15 g）、白術(shù)七錢半（9 g）、甘草半兩（6 g）。分別稱取適量防己、黃芪、白術(shù)、甘草飲片（4∶5∶3∶2），加適量水浸泡30 min，以10 倍量蒸餾水煎煮2 次，每次1 h，煎液用3 層紗布濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至適量，于65 ℃真空干燥，粉碎過(guò)80 目篩，得防己黃芪湯粉末，置于干燥器中保存[17]。

2.2 防己黃芪湯多成分定量分析的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～1 min，20%A；1～8 min，20%～100% A；8～12 min，100% A；12～16 min，100%～20% A。體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）掃描，正、負(fù)離子切換掃描模式，正、負(fù)離子噴霧電壓分別為＋3.5 kV、-2.5 kV；去溶劑氣溫度400 ℃；離子傳輸管溫度350 ℃；鞘氣壓力和輔助氣壓力分別為45、15 psi（1 psi＝6.895 kPa）。木蘭花堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、黃芪甲苷、甘草次酸、地西泮（內(nèi)標(biāo)）和粉防己堿的m/z分別為342.15～297.10、609.33～367.10、447.16～285.00、417.29～255.10、807.46～627.40、471.44～149.20、284.99～193.00、623.35～381.10，碰撞能量分別為18、38、19、20、49、36、27、43 eV。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制 分別精密稱取木蘭花堿、防己諾林堿、粉防己堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草次酸、黃芪甲苷7 種對(duì)照品適量，置棕色10 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，4 ℃保存，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取地西泮粉末適量，加甲醇定容至10 mL，4 ℃保存，作為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。臨用前，取一定量的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成混合對(duì)照品溶液（各成分質(zhì)量濃度分別為木蘭花堿0.75、3.75、7.50、30.00 μg/L，防己諾林堿3、15、30、120 μg/L，粉防己堿7.5、37.5、75.0、300.0 μg/L，毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.75、3.75、7.50、30.00 μg/L，黃芪甲苷3、15、30、120 μg/L，甘草苷1.87、9.35、18.70、74.80μg/L，甘草次酸45、225、450、1 800 μg/L）。

2.2.4 給藥及血液樣本采集 SD 大鼠隨機(jī)分為6組，每組6 只。其中3 組大鼠分別按低、中、高劑量（2.67、4.00、6.00 g/kg）ig 防己黃芪湯混懸液。給藥前12 h 禁食，自由飲水，ig 2 h 后自由飲水和進(jìn)食，分別于給藥后0.083、0.167、0.25、0.33、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60 h眼眶靜脈采血400 μL，置于肝素鈉處理過(guò)的離心管中。另外3 組大鼠分別按低、中、高劑量（7.36、11.03、16.54 mg/kg）ig 粉防己堿混懸液，分別于給藥后0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60 h 眼眶靜脈采血400 μL，置于肝素鈉處理過(guò)的離心管中。所得血漿于1 000 r/min 離心10 min后，取上清，保存于-20 ℃冰箱。

2.2.5 樣品處理 取大鼠血漿樣品200 μL，加入200 μg/L 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液50 μL，加甲醇850 μL 渦旋混合2 min 以沉淀蛋白，4 ℃、13 200 r/min 離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移至離心管，37 ℃下氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇100 μL 復(fù)溶，渦旋3 min，離心，取上清液進(jìn)樣分析。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 分別取大鼠空白血漿＋低質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液＋內(nèi)標(biāo)溶液、給藥后45 min的血漿樣品＋內(nèi)標(biāo)溶液、空白血漿＋內(nèi)標(biāo)溶液適量，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)。

2.3.2 線性范圍及定量限考察 分別精密吸取一定量的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋，得7 種不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，精密吸取100 μL，分別加至200 μL 的空白血漿中，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)，記錄峰面積。以各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），采用加權(quán)最小二乘法，權(quán)重系數(shù)為1/χ2，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以信噪比（S/N）＝10 為定量限。

2.3.3 精密度和準(zhǔn)確度考察 分別精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下4 種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液100 μL，加至200 μL 的空白血漿中，每個(gè)質(zhì)量濃度平行5 份，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)，1 d 內(nèi)連續(xù)測(cè)定3 次，評(píng)價(jià)日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，評(píng)價(jià)日間精密度。

2.3.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)考察 取生理鹽水200 μL，加入4 種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液100μL 和200 μg/L 內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)，測(cè)定各成分峰面積，記為A。取空白血漿200 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，加甲醇850 μL 渦旋混合2 min，離心，取上清液，加入4 種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液100 μL，37 ℃下氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇100 μL復(fù)溶，渦旋3 min，離心，吸取上清液，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)各成分峰面積，記為B。取空白血漿200 μL，加入4 種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液100 μL 和內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)，測(cè)定各待測(cè)物的峰面積，記為C。計(jì)算提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)。

提取回收率＝C/B

基質(zhì)效應(yīng)＝C/A

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取大鼠空白血漿200 μL，分別加入4 種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液100 μL，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)，考察不同儲(chǔ)存條件下（4 ℃放置24 h、25 ℃放置12 h、-20 ℃放置15 d、3 次凍融循環(huán)）樣品的穩(wěn)定性。

2.4 藥動(dòng)學(xué)研究

按“2.2.4”項(xiàng)下方法給藥、收集樣品，測(cè)定前于室溫溶解血漿樣品，渦旋，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)采用Kinetica 4.4 軟件非房室模型分析，計(jì)算各成分的達(dá)峰時(shí)間（tmax）、達(dá)峰濃度（Cmax）、消除半衰期（t1/2）、藥時(shí)曲線下面積（AUC）、平均駐留時(shí)間（MRT）、清除率（CL）和表觀分布容積（Vz）。

2.5 防己黃芪湯對(duì)Th 分化的調(diào)節(jié)作用

2.5.1 給藥溶液的配制 精密稱取防己黃芪湯粉末10 mg，用RPMI 1640 培養(yǎng)基溶解并稀釋成不同質(zhì)量濃度的防己黃芪湯藥液，使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)。精密稱取粉防己堿5 mg，加1 mol/L HCl 充分溶解并定容至0.1 mg/L，精密吸取一定量于量瓶中，加1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 7.2，加RPMI 1640 培養(yǎng)基定容成0.6 mg/L 粉防己堿溶液，使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)。

2.5.2 小鼠脾臟單細(xì)胞懸液的制備 BALB/c 小鼠脊椎脫臼處死，置于75%乙醇中消毒滅菌，在生物安全柜中取出脾臟。用玻璃片將脾臟磨碎，200 目尼龍網(wǎng)濾過(guò)，得到的細(xì)胞懸液于4 ℃、1 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），棄去上清液。向沉淀細(xì)胞中加入一定量的紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫靜置3 min，離心，棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）重懸，200 目尼龍網(wǎng)濾過(guò)，離心，棄上清液，加入一定量含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，混勻，在倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.5.3 防己黃芪湯對(duì)T 淋巴細(xì)胞毒性的影響 將T細(xì)胞懸液用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋至3×105個(gè)/mL，按100 μL/孔接種于96 孔板中，空白組僅加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，給藥組按50 μL/孔加入不同質(zhì)量濃度（100、10、1、0.1、0.01、0.001、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mg/mL）的防己黃芪湯藥液，空白組和對(duì)照組均按50 μL/孔加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)92 h，按20 μL/孔加入MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，按150 μL/孔加入DMSO，搖床振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀于570 nm 處測(cè)定吸光度（A）值，計(jì)算抑制率。

抑制率＝1-(A給藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)

2.5.4 防己黃芪湯對(duì)T 淋巴細(xì)胞增殖的影響 將T細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，平行6 個(gè)復(fù)孔，按100 μL/孔加入細(xì)胞混懸液，空白組僅加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，對(duì)照組和給藥組先按50 μL/孔加入8 mg/L ConA 溶液，給藥組再按50 μL/孔加入不同質(zhì)量濃度（100、10、1、0.1、0.01、0.001、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mg/mL）的防己黃芪湯藥液，空白組按50 μL/孔加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)56 h，在終止培養(yǎng)前16 h，每孔加入3H-TdR 20 μL，使其終濃度為1 μCi/mL，繼續(xù)培養(yǎng)16 h。等標(biāo)記反應(yīng)完成后將標(biāo)記的細(xì)胞收集至玻璃纖維膜上濾過(guò)，用蒸餾水多次洗滌，把濾紙片放在80 ℃烘箱內(nèi)烘干后，放入含有脂溶性閃爍液10 mL 的閃爍杯中，采用閃爍/發(fā)光計(jì)數(shù)儀測(cè)定樣品的每分鐘脈沖數(shù)（cpm）。

2.5.5 防己黃芪湯對(duì)ConA 誘導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞炎癥因子水平的影響 將T 淋巴細(xì)胞以2×106個(gè)/孔接種于6 孔板中，設(shè)置對(duì)照組、模型組和各給藥組，對(duì)照組加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，其余各組加入2 mg/L ConA，各給藥組再加入不同質(zhì)量濃度（0.2、1.0、5.0 mg/L）的防己黃芪湯或0.6 mg/L 粉防己堿，培養(yǎng)96 h，于給藥后48 h 收集細(xì)胞上清液，采用ELISA 法測(cè)定IL-2 和IL-17 水平；于給藥后96 h 收集細(xì)胞上清液，測(cè)定IFN-γ 水平。

2.5.6 防己黃芪湯對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+Treg 數(shù)目的影響 將T 淋巴細(xì)胞懸液以2×106個(gè)/孔接種于6 孔板中，按“2.5.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組與給藥，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞。加入具有熒光標(biāo)記的CD4-PE 和CD25-PE-Cy7 抗體用于標(biāo)記細(xì)胞表面，F(xiàn)oxP3-APC 抗體用于細(xì)胞內(nèi)染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，使用CellQuestTM軟件進(jìn)行分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS Statistics 18.0 和GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)和One-way ANOVA 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性 大鼠ig 防己黃芪湯后血漿樣品的UPLC-MS/MS 圖譜見(jiàn)圖1，表明該方法具有良好的專屬性。

3.1.2 線性范圍及定量限 如表1 所示，該方法滿足血漿樣品的測(cè)定要求。

表1 大鼠血漿中7 種成分的線性范圍和定量限Table 1 Linear ranges and quantification limits of seven components in plasma of rats

3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度 如表2 所示，7 個(gè)成分的日間、日內(nèi)準(zhǔn)確度為85.14%～105.50%，日間精密度和日內(nèi)精密度的RSD 為0.2%～10.9%，符合生物樣品的檢測(cè)要求。

表2 大鼠血漿中7 種成分的精密度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Precision, recovery rate and matrix effect of seven components in plasma of rats

3.1.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 如表2 所示，各成分的提取回收率為86.90%～113.04%，基質(zhì)效應(yīng)為52.33%～112.50%，其中粉防己堿受基質(zhì)效應(yīng)影響較大（52.33%～64.76%），但粉防己堿的回收率較高（103.49%～111.68%），表明血漿中物質(zhì)只對(duì)粉防己堿在質(zhì)譜中的響應(yīng)有抑制，因4 個(gè)不同質(zhì)量濃度的粉防己堿基質(zhì)效應(yīng)RSD＜15%，說(shuō)明這種抑制作用可通過(guò)建立隨行標(biāo)曲計(jì)算濃度抵消，滿足分析要求。各成分回收率良好。

3.1.5 穩(wěn)定性 如表3 所示，7 個(gè)成分的準(zhǔn)確度為84.70%～115.65%，滿足生物樣品的分析要求。

表3 大鼠血漿中7 種成分的穩(wěn)定性 (±s, n = 5)Table 3 Stability of seven components in plasma of rats (±s, n = 5)

表3 大鼠血漿中7 種成分的穩(wěn)定性 (±s, n = 5)Table 3 Stability of seven components in plasma of rats (±s, n = 5)

成分 質(zhì)量濃度/(μg·L-1)4 ℃放置24 h 25 ℃放置12 h -20 ℃放置15 d 3 次凍融循環(huán)實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度/(μg·L-1) 準(zhǔn)確度/% 實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度/(μg·L-1) 準(zhǔn)確度/% 實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度/(μg·L-1) 準(zhǔn)確度/% 實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度/(μg·L-1) 準(zhǔn)確度/%木蘭花堿 0.75 0.64±0.02 85.31 0.82±0.04 109.10 0.76±0.03 101.75 0.79±0.03 105.76 3.75 3.21±0.16 85.47 4.23±0.17 112.74 4.21±0.14 112.19 4.31±0.15 114.98 7.50 6.64±0.52 88.49 8.62±0.16 114.87 7.90±0.12 105.28 8.38±0.17 111.77 30.00 25.87±0.22 86.25 32.94±1.21 109.78 30.84±1.32 102.79 32.94±1.68 109.81防己諾林堿 3 2.77±0.09 92.42 3.47±0.09 115.57 3.43±0.02 114.27 3.38±0.06 112.73 15 12.71±0.70 84.70 17.06±0.25 113.75 15.94±1.44 106.28 17.11±0.37 114.08 30 26.56±2.05 88.53 34.48±0.16 114.94 33.32±0.70 111.06 32.81±1.41 109.35 120 102.76±2.82 85.64 135.04±2.95 112.53 129.21±3.83 107.68 127.14±3.94 105.95粉防己堿 7.5 6.66±0.34 88.76 8.63±0.66 115.04 8.46±0.38 112.76 8.60±0.30 114.67 37.5 34.00±1.51 90.68 37.83±8.75 100.87 42.24±0.89 112.65 38.27±2.23 102.06 75.0 69.05±2.82 92.06 85.82±4.99 114.42 83.82±0.85 111.76 83.47±0.59 111.29 300.0 255.02±1.21 85.01 312.38±5.99 104.13 306.54±11.80 102.18 313.58±4.66 104.53毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.75 0.66±0.06 87.36 0.65±0.03 86.34 0.64±0.03 85.48 0.66±0.02 88.11 3.75 3.28±0.14 87.48 3.24±0.03 86.28 3.20±0.09 85.43 3.49±0.23 92.97 7.50 6.93±0.16 92.37 6.39±0.61 85.15 6.68±0.14 89.09 6.56±0.48 87.47 30.00 26.84±0.29 89.48 28.89±1.17 96.30 26.22±0.96 87.41 28.44±0.46 94.79甘草苷 1.87 1.68±0.59 89.71 1.66±0.14 88.77 1.62±0.09 86.63 1.65±0.08 88.24 9.35 9.15±0.74 97.85 8.04±0.22 86.04 8.25±0.28 88.21 8.80±0.36 94.09 18.70 19.01±0.92 101.67 16.30±0.90 87.14 16.70±0.54 89.29 16.22±0.79 86.73 74.80 65.16±0.84 87.11 63.61±3.05 85.04 63.99±2.95 85.54 63.70±1.14 85.16黃芪甲苷 3 2.74±0.11 91.31 2.86±0.07 95.30 2.74±0.09 91.29 2.83±0.06 94.18 15 13.80±0.34 92.01 16.64±0.31 110.90 15.80±0.47 105.36 16.84±0.43 112.25 30 28.40±0.56 94.65 31.14±0.44 103.81 29.80±0.28 99.32 29.90±2.18 99.66 120 105.71±1.77 88.09 120.02±2.72 100.01 116.41±2.50 97.01 119.84±3.28 99.87甘草次酸 45 42.92±1.45 95.38 50.93±1.73 113.18 51.85±1.30 115.23 51.71±2.14 114.92 225 223.84±4.89 99.49 257.72±9.09 114.54 260.20±11.10 115.65 240.61±8.53 106.94 450 445.53±14.17 99.01 515.83±7.71 114.63 498.92±5.14 110.87 499.64±19.47 111.03 1 800 1 588.55±23.73 88.25 1 819.79±69.77 101.10 1 832.85±84.19 101.82 1 813.87±43.66 100.77

3.2 藥動(dòng)學(xué)研究

各成分的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。木蘭花堿、粉防己堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、黃芪甲苷和甘草次酸的AUC0～t和AUC0～∞具有劑量相關(guān)性趨勢(shì)；木蘭花堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷在體內(nèi)可被快速吸收并消除[tmax＜1 h、CL＞50 L/(h·kg)]；粉防己堿、防己諾林堿和甘草次酸在大鼠體內(nèi)消除緩慢[CL＜8 L/(h·kg)]，體內(nèi)駐留時(shí)時(shí)間較長(zhǎng)（MRT＞10 h），表明其在體內(nèi)具有吸收時(shí)間長(zhǎng)、消除速度慢、駐留時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)。黃芪甲苷的藥時(shí)曲線呈雙峰現(xiàn)象，第1 個(gè)峰的tmax為0.5 h，第2 個(gè)峰的tmax為4 h；第1 個(gè)峰的吸收和消除速率均比第2 個(gè)快，在其他含有黃芪的中藥復(fù)方中也出現(xiàn)了此現(xiàn)象[18]，但黃芪甲苷單體和黃芪提取物中黃芪甲苷的藥動(dòng)學(xué)研究并未發(fā)現(xiàn)有雙峰現(xiàn)象[19-20]，推測(cè)黃芪甲苷的吸收、消除等過(guò)程易受復(fù)方中其他成分的影響。粉防己堿是防己黃芪湯入血最多的生物堿，ig 不同劑量的粉防己堿是為了對(duì)比單一給藥和復(fù)方給藥時(shí)粉防己堿藥動(dòng)學(xué)的區(qū)別，探索復(fù)方是否有增進(jìn)粉防己堿入血的作用。實(shí)驗(yàn)中采用的粉防己堿給藥劑量根據(jù)防己黃芪湯給藥劑量折算。與單一成分給藥相比，防己黃芪湯中的粉防己堿的吸收程度明顯增加，而消除速率明顯降低。

表4 大鼠ig 防己黃芪湯和粉防己堿后7 種成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s, n = 6)Table 4 Pharmacokinetic parameters of seven ingredients in rats after ig Fangji Huangqi Decoction and tetradrine(±s, n = 6)

表4 大鼠ig 防己黃芪湯和粉防己堿后7 種成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s, n = 6)Table 4 Pharmacokinetic parameters of seven ingredients in rats after ig Fangji Huangqi Decoction and tetradrine(±s, n = 6)

與同等級(jí)別劑量粉防己堿比較：*P＜0.05 **P＜0.01。*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs same level of dosage of tetrandrine.

成分 劑量/(g·kg-1) tmax/h Cmax/(μg·L-1) AUC0～t/(h·μg·L-1) AUC0～∞/(h·μg·L-1) t1/2/h MRT/h CL/(L·h-1·kg-1) Vz/(L·kg-1)木蘭花堿 2.67 0.50±0.31 3.09±1.51 4.36±2.07 4.80±2.13 1.58±0.61 2.26±0.81 89.69±50.69 203.33±155.92 4.00 0.71±0.70 3.04±1.41 6.89±1.58 9.06±2.64 3.53±1.03 5.10±1.17 62.12±15.56 302.42±64.38 6.00 0.32±0.12 6.91±4.11 12.78±6.63 15.42±8.56 2.90±0.98 3.89±1.55 58.81±28.21 220.06±162.58防己諾林堿 2.67 12.00±0.00 20.92±7.73 650.18±234.14 764.81±295.77 17.51±4.54 34.57±5.19 5.84±2.32 145.36±62.24 4.00 19.43±15.90 30.44±8.39 1 020.12±275.1 1 345.94±415.18 23.51±8.32 41.95±13.71 4.77±1.59 148.94±28.19 6.00 9.67±0.82 30.59±5.22 950.77±272.58 1 259.92±542.32 22.44±9.74 39.60±12.90 7.82±2.37 231.96±57.86毛蕊異黃酮葡萄糖苷2.67 0.25±0.07 2.09±1.54 0.84±0.72 0.92±0.72 0.29±0.15 0.54±0.17 1 594.95±1 457.71 731.36±844.50 4.00 0.29±0.04 2.37±1.43 1.73±0.80 2.12±0.95 1.08±0.87 1.70±1.31 640.98±406.27 718.42±412.19 6.00 0.24±0.06 7.77±6.13 3.54±2.69 3.94±2.79 1.21±0.27 1.50±0.32 538.44±263.86 969.95±594.93甘草苷 2.67 0.33±0.13 15.38±8.33 12.28±7.97 14.80±8.08 0.72±0.21 1.13±0.28 350.99±179.62 335.18±139.21 4.00 0.36±0.28 23.31±10.89 28.72±8.04 37.72±10.78 1.62±0.71 2.50±1.13 173.43±54.43 382.30±135.10 6.00 0.24±0.03 41.37±8.78 43.01±8.54 51.70±8.61 1.59±0.51 2.16±0.40 180.21±32.18 414.71±148.57黃芪甲苷 2.67 4.75±3.37 12.11±6.96 57.73±25.22 59.62±16.51 2.04±0.79 5.33±1.81 1.97±0.61 5.49±1.48 4.00 4.43±4.07 22.44±6.93 154.74±59.68 161.96±64.56 3.14±1.39 6.57±1.84 1.29±0.80 5.69±3.88 6.00 3.36±3.00 47.21±21.10 347.80±169.09 443.93±190.02 5.05±5.39 9.55±6.85 0.70±0.43 4.36±3.89甘草次酸 2.67 14.00±7.90 353.24±54.55 3 840.88±934.84 3 425.07±1 841.45 3.36±1.77 10.38±5.32 0.01±0.00 0.02±0.01 4.00 13.00±5.62 804.01±217.18 15 072.44±8 022.39 15 265.82±8 227.71 5.06±0.91 16.51±5.47 0.00±0.00 0.01±0.01 6.00 9.00±2.76 1 063.86±257.49 24 245.92±10 980.03 25 559.35±13 392.71 7.37±2.61 20.30±6.77 0.00±0.00 0.02±0.01粉防己堿 0.007 36 8.00±1.15 38.30±12.10 783.11±192.82 1 167.25±371.63 30.68±7.66 48.98±11.80 7.04±2.84 291.92±62.74 2.670 00 12.00±0.00 87.58±45.61 2 327.39±1 239.91* 2 770.02±1 569.78* 19.88±3.24** 33.20±3.78 3.38±1.71* 94.47±51.51*粉防己堿 0.011 03 7.67±2.94 45.18±9.85 1 147.25±365.13 1 546.48±490.51 24.77±3.20 41.78±3.21 7.92±3.08 274.19±80.34 4.000 00 12.57±5.38 133.34±42.24** 4 081.93±1 016.07** 5 742.23±3 419.01** 16.25±5.05** 31.60±6.88 2.38±1.00** 64.03±21.18**粉防己堿 0.016 54 7.20±3.03 90.22±20.93 1 941.03±463.97 2 436.85±569.34 21.27±1.47 36.27±3.29 7.10±1.69 219.96±64.39 6.000 00 9.33±1.03 373.64±85.62** 9 671.86±1 291.46** 11 523.07±2 171.49** 19.07±7.53 33.07±10.99 1.48±0.28** 38.97±11.22**

圖2 大鼠ig 防己黃芪湯后7 種成分的藥時(shí)曲線 (±s, n = 6)Fig.2 Drug-time curve of seven compounds in rats after ig Fangji Huangqi Decoction (±s, n = 6)

3.3 防己黃芪湯對(duì)Th 分化的調(diào)節(jié)作用

3.3.1 防己黃芪湯對(duì)T 淋巴細(xì)胞毒性的影響 如表5 所示，防己黃芪湯在1×10-7～100 mg/L 對(duì)T 淋巴細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用。

表5 防己黃芪湯對(duì)T 淋巴細(xì)胞毒性的影響 ( ± s, n = 6)Table 5 Effect of Fangji Huangqi Decoction on cytotoxicity of T lymphocytes (±s, n = 6)

表5 防己黃芪湯對(duì)T 淋巴細(xì)胞毒性的影響 ( ± s, n = 6)Table 5 Effect of Fangji Huangqi Decoction on cytotoxicity of T lymphocytes (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·L-1) A 抑制率/%空白 — 0.167±0.003 —對(duì)照 — 0.300±0.013 —防己黃芪湯 100 0.246±0.008 41 10 0.265±0.006 26 1 0.314±0.028 1 0.1 0.296±0.012 3 0.01 0.292±0.022 6 0.001 0.304±0.017 -3 1×10-4 0.304±0.017 -3 1×10-5 0.298±0.017 1 1×10-6 0.282±0.005 13 1×10-7 0.288±0.005 9

3.3.2 防己黃芪湯對(duì)T 淋巴細(xì)胞增殖的影響 如表6 所示，防己黃芪湯在1×10-7～100 mg/L 對(duì)T 淋巴細(xì)胞的增殖具有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為1.76 mg/L。

表6 防己黃芪湯對(duì)T 淋巴細(xì)胞增殖的影響 (±s, n = 6)Table 6 Effect of Fangji Huangqi Decoction on proliferation of T lymphocytes (±s, n = 6)

表6 防己黃芪湯對(duì)T 淋巴細(xì)胞增殖的影響 (±s, n = 6)Table 6 Effect of Fangji Huangqi Decoction on proliferation of T lymphocytes (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·L-1) 每分鐘脈沖數(shù)/cpm 抑制率/%空白 — 125±8 —對(duì)照 — 4 640±406 —防己黃芪湯 100 68±10 101 10 219±39 98 1 2 841±708 40 0.1 3 471±540 26 0.01 3 694±685 21 0.001 4 106±581 12 1×10-4 4 162±543 11 1×10-5 4 369±884 6 1×10-6 4 474±623 4 1×10-7 4 523±1 286 3

3.3.3 防己黃芪湯對(duì)ConA 誘導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞炎癥因水平的影響 如表7 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中IL-2、IFN-γ 和IL-17 水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，防己黃芪湯高劑量組細(xì)胞上清液中IL-2、IFN-γ 和IL-17 水平均明顯降低（P＜0.05、0.01），防己黃芪湯中劑量組IL-17 水平明顯降低（P＜0.01），防己黃芪湯低劑量組IL-2和IL-17 水平明顯降低（P＜0.05、0.01），粉防己堿組IL-17 水平顯著降低（P＜0.01）。

表7 防己黃芪湯對(duì)ConA 誘導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞炎癥因子水平和Treg 數(shù)目的影響 (±s, n = 3)Table 7 Effect of Fangji Huangqi Decoction on inflammatory cytokine levels and Treg count of ConA-induced T lymphocytes (±s, n = 3)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01。##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group.

組別 劑量/(mg·L-1) IL-2/(ng·mL-1) IL-17/(ng·mL-1) IFN-γ/(ng·mL-1) CD4+ CD25+ FoxP3+/%對(duì)照 — 1.215 9±0.023 5 0.101 6±0.008 1 0.096 2±0.003 8 22.333 3±17.897 9模型 — 8.637 5±0.072 1## 0.966 7±0.041 0## 0.120 0±0.004 1## 107.666 7±26.539 3##防己黃芪湯 0.2 7.184 7±0.522 4* 0.848 3±0.015 9** 0.107 3±0.000 0 151.000 0±48.041 6 1.0 7.477 1±0.180 1 0.669 7±0.019 7** 0.106 2±0.002 0 306.333 3±81.512 8*5.0 6.847 1±0.319 6** 0.709 5±0.015 3** 0.101 7±0.001 9* 343.666 7±64.127 5**粉防己堿 0.6 8.955 1±0.845 2 0.608 4±0.006 7** 0.114 4±0.013 8 280.333 3±61.808 8*

3.3.4 防己黃芪湯對(duì)ConA 誘導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞Treg數(shù)目的影響 如表7 所示，與對(duì)照組比較，模型組CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，粉防己堿組和防己黃芪湯中、高劑量組CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05、0.01）。

4 討論

目前關(guān)于防己黃芪湯中黃酮類和皂苷類成分的藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)道較少，本研究建立了同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中木蘭花堿、防己諾林堿和粉防己堿等7 個(gè)成分含量的UPLC-MS/MS 分析方法。通常情況下，進(jìn)入體循環(huán)的成分才有可能是中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)。研究表明，防己諾林堿、木蘭花堿、黃芪甲苷、甘草次酸和粉防己堿具有抗炎作用[21-24]，這些成分可能是防己黃芪湯發(fā)揮抗炎作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，防己黃芪湯中木蘭花堿、黃芪甲苷、甘草次酸和粉防己堿的吸收表現(xiàn)出了劑量相關(guān)性，這與防己黃芪湯產(chǎn)生劑量相關(guān)性的抗炎藥效相關(guān)[25]。

中藥復(fù)方中活性成分的藥時(shí)曲線呈現(xiàn)雙峰是較為普遍的現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的原因可能有以下幾種：①肝腸循環(huán)，經(jīng)膽汁排入腸道的原型藥物或者代謝物被腸黏膜重新吸收，由肝門靜脈進(jìn)入肝臟[26]；②胃排空和小腸轉(zhuǎn)運(yùn)異常[27]；③特定吸收位置[28]；④藥物劑型因素[29]。黃芪甲苷的藥時(shí)曲線呈雙峰現(xiàn)象，這種現(xiàn)象也同樣發(fā)生在其他含有黃芪的中藥復(fù)方中[17]，但關(guān)于黃芪甲苷單體和黃芪提取物中黃芪甲苷的藥動(dòng)學(xué)研究并未發(fā)現(xiàn)有雙峰現(xiàn)象[30]，推測(cè)黃芪甲苷的藥動(dòng)學(xué)行為易受復(fù)方中其他成分的影響。除黃芪甲苷外，防己黃芪湯中的其他成分也會(huì)相互影響。細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A是人體肝臟和小腸中最豐富的CYP 酶之一，其代謝介導(dǎo)的化合物的藥動(dòng)學(xué)特性會(huì)因藥物相互作用而發(fā)生改變[31]。研究表明，粉防己堿的代謝過(guò)程需要CYP3A4 和CYP3A5 的參與[32]。粉防己堿水溶性較差、生物利用度較低[33]，而本研究表明防己黃芪湯給藥時(shí)能夠提高粉防己堿的生物利用度，此現(xiàn)象表明粉防己堿與復(fù)方中其他成分可能存在協(xié)同作用。甘草次酸是甘草酸具有藥理活性的主要代謝物，研究顯示，甘草次酸是CYP3A4 的抑制劑[34]，因此，推測(cè)甘草次酸可能會(huì)通過(guò)CYP3A4 抑制粉防己堿的代謝過(guò)程，減緩其消除速率，增加其在體循環(huán)中的暴露量，從而增加防己黃芪湯中粉防己堿的生物利用度。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)防己黃芪湯可以抑制T 淋巴細(xì)胞增殖，并下調(diào)炎性細(xì)胞因子水平，對(duì)于免疫疾病的臨床應(yīng)用具有重要意義。FoxP3 是Treg 的關(guān)鍵和特異性轉(zhuǎn)錄因子，是增加Treg 活性的先決條件[35-37]。本研究結(jié)果顯示防己黃芪湯可以促進(jìn)CD4+CD25+FoxP3+Treg 的分化，表明防己黃芪湯可能通過(guò)促進(jìn)Treg 的分化，從而抑制ConA 誘導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞的增殖。因此，Treg 可能是防己黃芪湯治療疾病的關(guān)鍵。防己黃芪湯主要入血成分粉防己堿可在體外誘導(dǎo)Treg 分化，這與其他研究者的結(jié)論一致[38]，因此，粉防己堿可能是防己黃芪湯發(fā)揮疾病治療的關(guān)鍵藥效物質(zhì)。

綜上，大鼠ig 防己黃芪湯后血液中的主要成分有木蘭花堿、防己諾林堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、黃芪甲苷、甘草次酸和粉防己堿，且粉防己堿與復(fù)方中的其他成分存在著協(xié)同作用，可提高該成分的生物利用度，體現(xiàn)了中藥配伍的合理性和科學(xué)性。另外，本研究還考察了防己黃芪湯及其主要入血成分粉防己堿對(duì)T 淋巴細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)Treg 可能是防己黃芪湯治療免疫性疾病的關(guān)鍵免疫細(xì)胞，而粉防己堿在其中發(fā)揮重要作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突