基于PI3K/Akt/HIF-1α 通路探討桂枝茯苓膠囊-散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊-宮血寧膠囊聯(lián)用抑制子宮腺肌病進(jìn)展的作用機(jī)制

王楚矗，王 信，于敏敏，王 哲，曹 涵，師 偉*，劉志勇*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

子宮腺肌?。╝denomyosis，AM）是一種婦科常見疑難病，以子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)侵入子宮肌層為主要病理特征[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多證據(jù)表明AM的發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)[2-3]。主要臨床癥狀包括進(jìn)行性痛經(jīng)加重、月經(jīng)量過(guò)多及慢性盆腔疼痛等，可導(dǎo)致不孕并對(duì)輔助生殖技術(shù)助孕產(chǎn)生不利影響[4-5]，嚴(yán)重威脅女性身心健康。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用孕激素、促性腺激素類似物等控制疾病進(jìn)展[6]，但也存在明顯的不良反應(yīng)，且復(fù)發(fā)率高；手術(shù)切除子宮雖為根治性解決方案，但難以兼顧女性生育需求。因此，尋求更加安全有效的AM 治療方法是當(dāng)下亟待解決的問(wèn)題。

AM 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明。AM 雖被歸類為良性疾病，但卻表現(xiàn)出與惡性腫瘤相似的異常增殖生長(zhǎng)特點(diǎn)。已有報(bào)道表明，與正常內(nèi)膜細(xì)胞相比，AM 異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)[7]，這可能進(jìn)一步導(dǎo)致子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)（endometrial-myometrial interface，EMI）的不規(guī)則增厚并引發(fā)功能異常[8]。磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）通路是一個(gè)調(diào)控細(xì)胞增殖等生物過(guò)程的重要信號(hào)軸[9]，該通路的異常激活常在癌癥[10]及炎癥損傷相關(guān)疾病[11-12]中被熱切關(guān)注。同時(shí)，研究表明p-Akt 與HIF-1α 的表達(dá)水平在AM 中也明顯上調(diào)[13-15]。提示PI3K/Akt/HIF-1α 通路在AM 的發(fā)生、發(fā)展中可能起到關(guān)鍵作用。

與化學(xué)藥治療不良反應(yīng)較大、容易反復(fù)相比，中醫(yī)治療AM 具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如控制痛經(jīng)癥狀、調(diào)經(jīng)助孕等，被2020 年《子宮腺肌病診治中國(guó)專家共識(shí)》治療指南所推薦[16]。近年來(lái)，中醫(yī)藥療法在治療AM 中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。AM 在中醫(yī)古籍中并無(wú)病名記載，可歸于“痛經(jīng)”“癥瘕”“月經(jīng)過(guò)多”等，以“瘀血阻滯”為主要病機(jī)[17]。本課題組認(rèn)為，AM 病程長(zhǎng)、癥狀重且纏綿難愈，“久病入絡(luò)”[18]，當(dāng)行通陽(yáng)化瘀法，故治以桂枝茯苓膠囊-散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊-宮血寧膠囊聯(lián)用（簡(jiǎn)稱GSG）方案，在臨床診療中效果較好。因此，本研究基于PI3K/Akt/HIF-1α 信號(hào)通路，探究GSG 方案對(duì)AM 的改善作用，并闡釋相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料

1.1 AM 患者組織收集

選擇2019 年6 月在臨沂市中心醫(yī)院接受腹腔鏡手術(shù)的AM 患者1 例，年齡42 歲，術(shù)前3 個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行激素治療，于手術(shù)室無(wú)菌獲取AM 病灶組織。本研究方案已獲得山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2019ky061），遵循赫爾辛基宣言進(jìn)行，患者已簽署知情同意書。

1.2 動(dòng)物

7 周齡SPF 級(jí)ICR 雌鼠24 只及雄鼠12 只，購(gòu)自維通利華有限公司［SYXK（魯）2018-0015］，飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的SPF屏蔽環(huán)境，飼養(yǎng)條件為（22±2）℃的穩(wěn)定飼養(yǎng)溫度，12 h/12 h 晝夜循環(huán)，常規(guī)喂養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)AWE-2022-071）。

1.3 藥品與試劑

桂枝茯苓膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950005，批號(hào)220914）、散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030127，批號(hào)220909）購(gòu)自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；宮血寧膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20020087，批號(hào)ZHC2301）購(gòu)自云南白藥集團(tuán)股份有限公司；米非司酮（批號(hào)26593）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress 公司；復(fù)方米非司酮片（國(guó)藥準(zhǔn)字H20040365，批號(hào)07221001）購(gòu)自武漢九瓏人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；他莫昔芬（批號(hào)WXBD7619V）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；DMEM-F12 培養(yǎng)基（批號(hào)F3023N1）、磷酸鹽緩沖液（批號(hào)C2123N3）購(gòu)自中科邁晨（北京）科技有限責(zé)任公司；胎牛血清（批號(hào)TA01501）購(gòu)自蘇州雙洳生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶（批號(hào)J121102）、青鏈霉素混合液（批號(hào)J121004）購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；4%組織細(xì)胞固定液（批號(hào)20191217）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號(hào)1130W052）、Triton X-100（批號(hào)304L022）、2.5%結(jié)晶紫染色液（批號(hào)202111009）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2306001）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2305001）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 試劑盒（批號(hào)ECK-A362）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；kFluor488-Edu 法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20221114）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號(hào)HADGP）、DAB 顯色試劑盒（批號(hào)DUKLY）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)HPHHP）購(gòu)自山東思科捷生物技術(shù)有限公司；p-Akt 抗體（批號(hào)3523071101）購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司；p-PI3K 抗體（批號(hào)6）購(gòu)自美國(guó)CST 公司；HIF-1α抗體（批號(hào)10017918）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司。

1.4 儀器

Memmert 二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)Memmert 公司）；5424R 型高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；DK-8D 型電熱恒溫水浴鍋（上海比朗儀器制造有限公司）；Multiskan Go1510 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；Axiovert 40 型倒置相差顯微鏡（德國(guó)Carlzeiss 公司）；DHG-9070A 型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HP30 型自動(dòng)組織脫水機(jī)［達(dá)科為（深圳）醫(yī)療設(shè)備有限公司］；BM450A型包埋機(jī)、BM450 型包埋冷凍臺(tái)、PH60 型病理組織漂烘儀（常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；531CMY43 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）。

2 方法

2.1 給藥溶液的制備

參照藥品說(shuō)明書中的標(biāo)準(zhǔn)臨床用量與藥物規(guī)格，將桂枝茯苓膠囊、散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊、宮血寧膠囊以0.47∶0.80∶0.13 的比例充分混合，溶解至14 mL PBS 中，以37 ℃、50 Hz 超聲振蕩30 min 后，使用濾菌器濾過(guò)，制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的GSG母液。稱取米非司酮粉末25 mg，溶解于100 μL 二甲基亞砜中，制成250 mg/mL 的米非司酮母液。母液存于-20 ℃長(zhǎng)期避光保存，用前以培養(yǎng)基稀釋，用于體外實(shí)驗(yàn)。

按人與小鼠體表面積比值換算法計(jì)算不同給藥組各藥劑量，GSG 的1/2、1、2 倍臨床劑量相當(dāng)于0.635、1.270、2.539 g/kg，復(fù)方米非司酮的1 倍臨床劑量相當(dāng)于3.25 mg/kg。根據(jù)各組劑量，將桂枝茯苓膠囊、散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊、宮血寧膠囊按比例充分混合后溶解于生理鹽水中，復(fù)方米非司酮片溶解至生理鹽水中[19]，用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 原代細(xì)胞提取及培養(yǎng) 取AM 患者新鮮子宮組織，剪切至1 mm3大小，利用膠原酶IV 在37 ℃下消化4 h，期間每隔10 min 振蕩混勻1 次，至組織呈乳糜狀，先后使用70 μm 和40 μm 的過(guò)濾器濾過(guò)，以1 000 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞沉淀后使用PBS 清洗，再次離心后加入含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照Suzuki-Kakisaka 等[20]方法對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定，確定為AM 異位內(nèi)膜衍生細(xì)胞（adenomyosis derived cells，AMDC）。取3～10 代原代培養(yǎng)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 AMDC 以3.5×103個(gè)/孔接種至96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 后，加入不同質(zhì)量濃度（1、2、4、8、16 mg/mL）的GSG溶液或不同質(zhì)量濃度（12.89、25.78、51.55、103.10、206.20 μg/mL）的米非司酮，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。干預(yù)48 h 后，更換為含10% CCK-8 試劑的完全培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度（A）值。通過(guò)GraphPad Prism 9 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算藥物處理AMDC 后的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

2.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) AMDC 以2×103個(gè)/孔接種至6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h 后，分別加入不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.8 mg/mL）的GSG 溶液，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3 天換液1 次，10 d 后終止培養(yǎng)。使用4%組織細(xì)胞固定液固定細(xì)胞30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS 沖洗2 次，待干燥后拍照并計(jì)數(shù)。

2.2.4 EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 AMDC以2×105個(gè)/孔接種至24 孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h 后，分別加入不同質(zhì)量濃度（0.4、0.8、1.6 mg/mL）的GSG溶液，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，干預(yù)48 h 后終止培養(yǎng)，按照試劑盒說(shuō)明書加入2×EdU 工作液100 μL，37 ℃孵育2 h，棄去培養(yǎng)基，使用4%組織細(xì)胞固定液、0.5% Triton X-100 固定及通透，以3%BSA 沖洗2 次，每次5 min，加入Click 反應(yīng)液均勻覆蓋各孔底部，避光孵育30 min。再次以3% BSA沖洗2 次，每次5 min，PBS 沖洗5 min，加入Hoechst 33342 溶液，避光孵育10 min，吸出后以PBS 沖洗2 次，每次5 min，最后進(jìn)行熒光拍照。

2.3 AM 發(fā)病機(jī)制的生信分析

2.3.1 AM 數(shù)據(jù)集檢索及差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）分析 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/#）中檢索“adenomyosis”、種屬為“homo sapiens”、表達(dá)類型為“expression profiling by array”的數(shù)據(jù)集。通過(guò)GEO2R 在線分析網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）對(duì)DEGs 進(jìn)行歸一化與差異分析，獲取滿足P＜0.05、|log2FC|＞1 的DEGs。利用R 4.2.1 軟件ggplot2 包對(duì)差異結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.3.2 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 對(duì)獲取的DEGs 進(jìn)行ID 轉(zhuǎn)換，導(dǎo)入R 4.2.1 軟件clusterProfiler包進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，利用ggplot2 包對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 動(dòng)物造模、分組與給藥 ICR 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，以雌雄為2∶1 的比例合籠飼養(yǎng)，獲取新生雌性ICR 小鼠48 只，通過(guò)隨機(jī)法將小鼠分為對(duì)照組、模型組、復(fù)方米非司酮（3.25 mg/kg）組和GSG低、中、高劑量（0.635、1.270、2.539 g/kg）組，每組8 只。對(duì)照組小鼠于出生第2～5 天滴喂5 μL/g的花生油-卵磷脂-煉乳混合液（2∶0.2∶3），每天1次。除對(duì)照組外，其余小鼠于出生第2～5 天滴喂5 μL/g 花生油-卵磷脂-煉乳＋2.7 μmol/kg 他莫昔芬，每天1 次。造模后常規(guī)飼養(yǎng)90 d，各給藥組小鼠每日ig 100 μL 給藥溶液，對(duì)照組和模型組ig 等體積生理鹽水，連續(xù)干預(yù)30 d。小鼠ip 150 mg/kg 戊巴比妥鈉處死，獲取子宮、肝、脾、腎組織和血液樣本，置于4%組織細(xì)胞固定液中固定過(guò)夜。

2.4.2 HE 染色觀察子宮及肝脾腎病理形態(tài) 將經(jīng)固定的各組小鼠子宮、肝、脾、腎組織脫水包埋，放入切片機(jī)中切片，將切片展開并黏附于載玻片上，晾干。對(duì)切片進(jìn)行脫蠟水化，蘇木素染色20 s、伊紅復(fù)染30 s 并流水沖洗，再對(duì)切片進(jìn)行脫水透明處理，用封片劑封片，對(duì)切片進(jìn)行鏡下觀察與拍照，子宮組織切片以20、40 倍鏡分別拍攝，肝、脾、腎組織切片均以20 倍鏡拍攝。請(qǐng)經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科于敏敏醫(yī)師對(duì)切片的形態(tài)學(xué)改變情況進(jìn)行判斷。

2.4.3 免疫組化檢測(cè)子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 蛋白表達(dá) 將子宮組織切片進(jìn)行脫蠟水化，再通過(guò)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉液封閉去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。將切片置于稀釋后的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中，95 ℃水浴條件下修復(fù)25 min，用山羊血清封閉液封閉30 min，滴加一抗孵育過(guò)夜（p-Akt 抗體稀釋比為1∶150、p-PI3K 抗體稀釋比為1∶100、HIF-1α 抗體稀釋比為1∶200），滴加二抗孵育40 min（稀釋比為1∶200），加入DAB 工作液后根據(jù)顯微鏡下觀察的情況終止顯色。蘇木素染色液復(fù)染30 s，進(jìn)行脫水透明處理后封片，觀察p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 免疫組化染色情況。使用Image J 軟件IHC Profiler 插件根據(jù)染色強(qiáng)度與染色面積統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性面積比。

2.4.4 血清ALT 活性和BUN 含量的檢測(cè) 取各組小鼠血液，3 200 r/min 離心15 min 后，獲得上清液，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定ALT 活性和BUN 含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間數(shù)據(jù)采用 One-way ANOVA 分析。

3 結(jié)果

3.1 體外實(shí)驗(yàn)

3.1.1 GSG 和米非司酮對(duì)AMDC 活力的影響 為探究細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，利用梯度質(zhì)量濃度的GSG 溶液及陽(yáng)性對(duì)照藥米非司酮分別干預(yù)AMDC 48 h 后，采用CCK-8 法對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)。如圖1 所示，GSG 和米非司酮均能有效抑制AMDC 活力，GSG 和米非司酮的IC50值分別為（1.59±0.04）mg/mL、（47.94±2.73）μg/mL，表明GSG 對(duì)AMDC活力的具有較強(qiáng)的抑制作用。因此，后續(xù)采用梯度質(zhì)量濃度（0.4、0.8、1.6 mg/mL）的GSG 溶液處理AMDC，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)改變。

圖1 GSG (A) 和米非司酮 (B) 對(duì)AMDC 活力的影響 (±s, n = 3)Fig.1 Effects of GSG (A) and mifepristone (B) on viability of AMDC (±s, n = 3)

3.1.2 GSG 抑制AMDC 的克隆形成能力 AM 具有惡性腫瘤的特征，利用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GSG 對(duì)AMDC 克隆能力的影響。由于以1.6 mg/mL 的GSG溶液干預(yù)細(xì)胞后無(wú)法產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)，故以梯度質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.8 mg/mL）的GSG 溶液干預(yù)AMDC 10 d，4%組織細(xì)胞固定液固定染色后晾干，拍照并統(tǒng)計(jì)各孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量＞50 個(gè)的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量。如圖2所示，與對(duì)照組比較，GSG（0.4、0.8 mg/mL）組細(xì)胞克隆形成數(shù)目均顯著降低（P＜0.001），表明GSG能夠有效抑制AMDC 的克隆形成能力。

圖2 GSG 抑制AMDC 的克隆形成能力 (±s, n = 3)Fig.2 GSG inhibits clonal formation ability of AMDC (±s, n = 3)

3.1.3 GSG 抑制AMDC 的增殖能力 克隆形成與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，為了更直觀地評(píng)估藥物對(duì)AMDC 增殖能力的影響，采用EdU 增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)GSG 對(duì)AMDC 增殖能力的影響。以梯度質(zhì)量濃度的GSG 溶液干預(yù)AMDC 48 h 后，使用EdU工作液孵育處理2 h，4%組織細(xì)胞固定液固定染色，檢測(cè)其在2 h 內(nèi)的細(xì)胞增殖情況。如圖3 所示，與對(duì)照組比較，GSG（0.4、0.8、1.6 mg/mL）組細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.001），表明GSG 對(duì)AMDC增殖能力具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖3 GSG 抑制AMDC 的增殖能力 (±s, n = 3)Fig.3 GSG inhibits proliferation ability of AMDC (±s, n = 3)

3.2 AM 發(fā)病機(jī)制的生信分析

為探究AM 發(fā)病相關(guān)分子機(jī)制，在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取鑒定AM DEGs 的數(shù)據(jù)集GSE68870（包括4 個(gè)AM 組織樣本和4 個(gè)正常組織樣本）。通過(guò)GEO2R 在線分析網(wǎng)站對(duì)本數(shù)據(jù)集包含的70 523 個(gè)基因進(jìn)行歸一化及差異分析，共獲得來(lái)自GSE68870 數(shù)據(jù)集的266 個(gè)DEGs，其中包括111 個(gè)上調(diào)基因和155 個(gè)下調(diào)基因（圖4-A）。

圖4 AM 發(fā)病機(jī)制的生信分析Fig.4 Bioinformatics analysis of pathogenesis of AM

基于DEGs 在疾病的起源與進(jìn)展中扮演重要角色，進(jìn)一步分析了其主要影響的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路。對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，結(jié)果顯示，缺氧反應(yīng)相關(guān)條目在GO 分析中富集（圖4-B），PI3K/Akt 信號(hào)通路則在KEGG 分析中富集（圖4-C）。已有報(bào)道表明，AM 異位內(nèi)膜組織中可能存在缺氧環(huán)境，并促進(jìn)疾病進(jìn)展，引起異常增殖[21]，PI3K/Akt 信號(hào)通路在AM 異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，并且低氧環(huán)境中HIF-1α 穩(wěn)定表達(dá)，是PI3K/Akt 通路下游重要的調(diào)控因子[22]，并對(duì)缺氧環(huán)境做出應(yīng)答[23]。以上結(jié)果提示PI3K/Akt 通路介導(dǎo)的HIF-1α 激活是缺氧環(huán)境下AM 異位內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖的驅(qū)動(dòng)因素。因此，進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GSG 方案是否通過(guò)該通路發(fā)揮作用。

3.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

3.3.1 GSG 改善AM 小鼠模型中腺體向肌層侵襲基于AM 是以子宮內(nèi)膜的腺體、間質(zhì)侵入肌層為病理特征的疾病，利用滴喂他莫昔芬法構(gòu)建小鼠AM模型，采用HE 染色法觀察各組小鼠子宮的病理學(xué)改變。如圖5 所示，對(duì)照組小鼠子宮內(nèi)膜與肌層邊界清晰，無(wú)子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)侵入子宮肌層表現(xiàn)；模型組小鼠子宮內(nèi)膜與肌層邊界模糊，可見多處子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)侵入肌層深部，腺體增多；GSG低劑量組子宮內(nèi)膜與肌層邊界欠清晰，可見子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)侵入肌層，較模型組浸潤(rùn)深度減輕、數(shù)量較少；復(fù)方米非司酮組和GSG 中劑量組子宮內(nèi)膜與肌層邊界較清晰，偶見腺體與間質(zhì)侵入肌層，較模型組浸潤(rùn)深度明顯減輕、數(shù)量減少；GSG 高劑量組子宮內(nèi)膜與肌層邊界清晰，肌層連續(xù)，少見明顯子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)侵入肌層。表明GSG 能夠改善AM 的病理進(jìn)展，以高劑量組改善效果最為明顯，子宮肌層結(jié)構(gòu)恢復(fù)最接近對(duì)照組，腺體侵入肌層數(shù)量明顯減少；GSG 中劑量組和復(fù)方米非司酮組改善效果相似，即中劑量的GSG 與米非司酮藥效基本相同。

圖5 各組小鼠子宮組織HE 染色Fig.5 HE staining of uterine tissue of mice in each group

3.3.2 GSG 抑制AM 小鼠模型子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 的表達(dá) 生信分析結(jié)果提示PI3K/Akt 通路及HIF-1α 表達(dá)與AM 發(fā)病密切相關(guān)，采用免疫組化法檢測(cè)各組小鼠子宮組織中p-PI3K、p-Akt和HIF-1α 的表達(dá)，如圖6 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，各給藥組子宮組織p-PI3K、p-Akt 表達(dá)均顯著降低（P＜0.01、0.001），復(fù)方米非司酮組和GSG 中、高劑量組HIF-1α 表達(dá)顯著降低（P＜0.05、0.01）。綜合以上結(jié)果，GSG 能夠降低AM 小鼠子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 的表達(dá)，抑制PI3K/Akt/HIF-1α 通路。

圖6 免疫組化檢測(cè)各組小鼠子宮組織中p-PI3K、p-Akt 和HIF-1α 的表達(dá) (±s, n = 3)Fig.6 p-PI3K, p-Akt and HIF-1α expressions in uterine tissue of mice in each group by immunohistochemistry (±s, n = 3)

3.3.3 GSG 對(duì)AM 模型小鼠肝、脾、腎組織病理變化的影響 為觀察GSG 對(duì)肝、脾和腎組織是否具有損傷性，采用HE 染色觀察各組小鼠肝、脾和腎組織的形態(tài)學(xué)改變。如圖7 所示，各組小鼠肝、脾和腎組織病理形態(tài)均未見明顯改變，表明GSG 處理未引起AM 模型小鼠肝、脾和腎的病理性變化。

圖7 各組小鼠肝、脾和腎組織HE 染色 (×20)Fig.7 HE staining of liver, spleen and kidney tissues of mice in each group (× 20)

3.3.4 GSG 對(duì)AM 模型小鼠血清ALT 活性和BUN水平的影響 ALT 是一種指示肝功能的常規(guī)指標(biāo)，其活性升高提示肝功能受損。BUN 是由腎臟排出的代謝廢物，其水平升高通常提示腎功能異常。如圖8 所示，各給藥組血清ALT 活性和BUN 水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明GSG 處理未引起AM 模型小鼠明顯肝、腎功能損傷。

圖8 GSG 對(duì)AM 模型小鼠血清ALT 活性和BUN 水平的影響 (±s, n = 4)Fig.8 Effect of GSG on ALT activity and BUN level in serum of AM model mice (±s, n = 4)

4 討論

AM 是一種易反復(fù)的婦科常見疑難病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。近年來(lái)，隨著生育需求的增加，現(xiàn)有醫(yī)學(xué)方法難以同時(shí)滿足AM 患者的癥狀控制與生育問(wèn)題。然而，中醫(yī)藥在改善癥狀、調(diào)經(jīng)助孕方面顯示出潛在優(yōu)勢(shì)，中成藥因應(yīng)用便捷和對(duì)控制癥狀的積極效果廣泛應(yīng)用于臨床?！吨谐伤幹委熗唇?jīng)臨床應(yīng)用指南（2021 年）》[24]明確推薦，在AM 的治療中，桂枝茯苓膠囊可以縮小異位病灶，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊可緩解痛經(jīng)、降低復(fù)發(fā)率?！秾m血寧膠囊婦產(chǎn)科臨床應(yīng)用指導(dǎo)建議》[25]也明確指出宮血寧膠囊能夠減少異常子宮出血患者的出血量。此3 藥針對(duì)AM的癥狀各有所長(zhǎng)，且有研究表明，中成藥聯(lián)用可打破單用的局限性，減毒增效，更貼合中醫(yī)辨證論治的特點(diǎn)[26]。本課題組常以GSG 方案用于臨床，收效甚佳，但其作用機(jī)制尚不明確，故本研究結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)此展開深入探討。

在中醫(yī)理論中，AM 的主要病理因素為“瘀血”。《臨證指南醫(yī)案》曰：“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)”，氣滯血停，久病入絡(luò)，瘀血膠著阻滯絡(luò)脈，則易積聚為癥瘕，纏綿難愈[27]。故以“通陽(yáng)化瘀”法通利脈絡(luò)、祛瘀消癥，治以GSG 方案。桂枝茯苓膠囊源于經(jīng)方桂枝茯苓丸，是治療“癥瘕”的基礎(chǔ)用方。其中桂枝溫經(jīng)通陽(yáng)，可以辛散之性引諸藥于營(yíng)衛(wèi)絡(luò)脈之中；茯苓甘淡，利水滲濕；桃仁辛潤(rùn)入絡(luò)、丹皮辛寒入血、赤芍苦平除血痹，三者入絡(luò)消癥、清熱涼血；諸藥合用可通陽(yáng)化瘀、清熱利濕。散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊藥簡(jiǎn)力繁，其中血竭味咸，可入絡(luò)搜邪，破癥祛瘀止痛；三七通脈行瘀，和營(yíng)止血；浙貝、薏苡仁清熱散結(jié)，通利絡(luò)脈；諸藥合用可破癥祛瘀、化痰散結(jié)。宮血寧膠囊由重樓單味藥組成，長(zhǎng)于清熱解毒、散腫止痛、化瘀止血[28]?，F(xiàn)代藥理研究表明，重樓還具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗病毒、止血鎮(zhèn)痛的作用[29]。GSG 方案基于消癥化瘀，以辛散溫通之品引諸藥入絡(luò)，直達(dá)病所，同時(shí)避免苦寒之品凝滯氣血，多藥協(xié)同，辯證靈活。

子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)異位并侵入肌層是AM 的病理基礎(chǔ)，異位內(nèi)膜細(xì)胞的異常增殖可加重AM 進(jìn)展[30]。Xu 等[31]研究顯示，槲皮素可以通過(guò)抑制子宮異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，影響細(xì)胞遷移與侵襲能力，進(jìn)而改善AM。因此，抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖是干預(yù)AM 發(fā)生過(guò)程的重要措施。本研究發(fā)現(xiàn)，GSG 可抑制AMDC 活力，0.8 mg/mL GSG 溶液可有效抑制AMDC 克隆形成和增殖能力。

在表觀遺傳學(xué)研究中，疾病的DEGs 富集情況常指示疾病潛在的分子機(jī)制。本研究對(duì)AM的DEGs進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，GO 分析中與缺氧相關(guān)的條目被富集，這與AM 組織中可能存在缺氧微環(huán)境相一致，PI3K/Akt 信號(hào)通路則富集在KEGG 分析中。PI3K作為脂質(zhì)激酶家族成員[32]，可以通過(guò)誘導(dǎo)磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2 ） 向 磷 脂 酰 肌 醇 3,4,5- 三 磷 酸（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）的轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)Akt 磷酸化，介導(dǎo)下游重要效應(yīng)因子的表達(dá)[33-34]，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。研究提出，在AM發(fā)生過(guò)程中，異位內(nèi)膜細(xì)胞的快速增殖與炎性反應(yīng)的發(fā)生通常導(dǎo)致了氧氣快速消耗并造成組織缺血缺氧狀態(tài)[35]。此時(shí)，具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能能力的PI3K/Akt 通路可通過(guò)調(diào)節(jié)促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白參與對(duì)缺血缺氧狀態(tài)的抗性反應(yīng)，并誘導(dǎo)HIF-1α 表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)下游蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性改變。在缺氧條件下，AM 異位內(nèi)膜中的HIF-1α 與p-Akt 表達(dá)增加，且p-Akt 表達(dá)峰值早于HIF-1α[35]。因此，PI3K/Akt/HIF-1α 通路是參與AM 發(fā)生發(fā)展的重要通路。

基于PI3K/Akt/HIF-1α 通路在AM 中的重要作用，本研究進(jìn)行了GSG 的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，以評(píng)估藥物在真實(shí)生理環(huán)境中的治療效果。結(jié)果表明，在子宮病理學(xué)形態(tài)改變上，低、中、高劑量的GSG 均能減輕AM 病灶腺體浸潤(rùn)深度，減少腺體數(shù)量，且中劑量的GSG 與米非司酮顯示出大致相同的療效。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GSG 可降低子宮組織中p-Akt、p-PI3K和HIF-1α 蛋白表達(dá)，顯示出對(duì)PI3K/Akt/HIF-1α 通路的下調(diào)作用。提示GSG 對(duì)AM 小鼠的改善作用可能與抑制PI3K/Akt/HIF-1α 通路相關(guān)。而中劑量的GSG 和米非司酮之所以能夠達(dá)到相似的療效，可能是由于兩藥通過(guò)影響不同的生物學(xué)過(guò)程，但導(dǎo)致了相似的治療結(jié)果。米非司酮作為孕激素受體拮抗劑，可阻斷孕酮，抑制腺體分泌，縮小病灶，并改善臨床癥狀[36]。而中劑量的GSG 可能是通過(guò)PI3K/Akt/HIF-1α 通路抑制AMDC 增殖、減輕腺體和間質(zhì)侵入肌層的傾向從而改善AM。這也說(shuō)明AM的發(fā)病機(jī)制具有多樣性和復(fù)雜性，不同的治療方法間可能存在協(xié)同作用。

桂枝茯苓膠囊-散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊-宮血寧膠囊聯(lián)用中的3 種中成藥分別經(jīng)安全性分析，顯示總體安全性較好[37-39]。鑒于聯(lián)合用藥可能增加肝、腎損傷風(fēng)險(xiǎn)，本研究進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以對(duì)GSG 方案進(jìn)行藥物安全性評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，AM 小鼠經(jīng)GSG 連續(xù)干預(yù)30 d 后，各組肝、脾和腎形態(tài)學(xué)均未見明顯改變，血清ALT 活性和BUN 水平無(wú)顯著性差異。即使在2.539 g/kg 藥物劑量下，即相當(dāng)于2 倍人的臨床用量，在動(dòng)物體內(nèi)也未見明顯不良反應(yīng)，這些初步結(jié)果提示，GSG 方案是安全的治療選擇。但目前研究?jī)H集中于體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，尚未進(jìn)行廣泛的臨床試驗(yàn)，接下來(lái)可將聯(lián)用方案進(jìn)行臨床研究拓展，以驗(yàn)證其安全性與有效性。

綜上，GSG 方案可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/HIF-1α 通路來(lái)降低AMDC 增殖，阻斷AM 模型小鼠疾病進(jìn)展，且不良反應(yīng)有限，提示其是針對(duì)AM 臨床治療的潛在可用方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突