基于擬靶向膽汁酸代謝組學(xué)篩選柴胡抗抑郁的活性部位

高芳榮 ，王威宇 ，羅培琰，李 靜 ，秦雪梅 ，高曉霞 *

1. 山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

2. 山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006

3. 山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006

柴胡BupleuriRadix為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC. 或 狹 葉 柴 胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，辛、苦、微寒，主入肝膽，疏達(dá)經(jīng)氣，宣通內(nèi)外，發(fā)揮樞利臟腑氣血、和解少陽的功效[1-2]。臨床研究表明以其為君藥的復(fù)方如逍遙散、大柴胡湯等，常用于治療膽汁淤積的肝病和并發(fā)抑郁等疾病[3-4]，文獻(xiàn)報道中藥名方柴胡疏肝散通過調(diào)節(jié)磷脂和膽汁酸代謝緩解慢性不可預(yù)知應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）誘導(dǎo)的肝損傷，從而發(fā)揮抗抑郁作用[5-8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柴胡低極性部位有多炔類RB2、RB4 等代表性活性成分[9-10]，并對CUMS 模型大鼠肝組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，柴胡低極性部位的抗抑郁作用與膽汁酸代謝密切相關(guān)[11]，抑郁癥發(fā)病機(jī)制涉及多重因素，但具體機(jī)制尚未完全闡明。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥的發(fā)病與膽汁酸的平衡發(fā)生紊亂密切相關(guān)。研究表明抑郁癥存在膽汁酸代謝障礙[12-17]。

膽汁酸是膽汁中發(fā)現(xiàn)的一大類膽烷酸總稱，作為膽汁的主要組成成分，常以鈉或鉀的膽鹽形式存在[18]。現(xiàn)代研究表明膽汁酸是治療膽汁淤積性疾病的重要靶點(diǎn)，膽汁酸穩(wěn)態(tài)失衡可導(dǎo)致膽汁酸過度積累，引發(fā)肝臟炎癥和損傷[19-20]。大量研究發(fā)現(xiàn)貫穿腦-肝-腸代謝軸的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝出現(xiàn)紊亂很可能是肝性腦病重要的發(fā)病機(jī)制[21-22]。膽汁酸及其受體在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中獲得廣泛關(guān)注。但由于種類眾多，不易全面定量分析。擬靶向代謝組學(xué)技術(shù)是許國旺團(tuán)隊(duì)于2012 年首次提出的概念[23]，是一種定量離子選擇算法，用于對所有檢測到的代謝物進(jìn)行定量離子選擇，通過保留時間鎖定質(zhì)譜選擇離子監(jiān)測方式，樣品中的已知和未知代謝物都可以被測量，該方法結(jié)合了非靶向和靶向代謝組學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，且不需要所有標(biāo)樣來限定檢測的代謝物。由于抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的代謝狀態(tài)密切相關(guān)，因此將擬靶向代謝組學(xué)研究用于檢測膽汁酸譜的全面變化可以更好地研究疾病的發(fā)展。

本研究采用柴胡不同極性部位對CUMS 抑郁大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過監(jiān)測行為學(xué)指標(biāo)和分析血清神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化，以篩選出最佳藥效部位。通過測定肝功能指標(biāo)和總膽汁酸（total bile acid，TBA）水平，表明柴胡低極性部位可發(fā)揮肝保護(hù)作用，同時調(diào)節(jié)總膽汁酸水平。采用UPLC-MS/MS 擬靶向代謝組學(xué)建立測定膽汁酸的方法，能夠測定大鼠盲腸內(nèi)容物膽汁酸種類和相對含量，為臨床探究膽汁酸譜的具體變化提供方法，同時對柴胡通過膽汁酸代謝抗抑郁的機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級成年雄性SD 大鼠54 只，體質(zhì)量（180±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。動物飼養(yǎng)于清潔環(huán)境，溫度（23±2）℃，相對濕度（45±10）%，自由進(jìn)食飲水，12 h 光照/黑暗周期。動物實(shí)驗(yàn)均通過山西大學(xué)科學(xué)研究倫理審查委員會審查（批準(zhǔn)號SXULL2019005）。

1.2 藥材

柴胡飲片（批號1805215131）購自安國市吉騰達(dá)藥材有限公司，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定為傘形科植物柴胡B.chinenseDC.的干燥根或根莖，符合《中國藥典》2020 年版規(guī)定，留樣于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。

1.3 藥品與試劑

鹽酸文拉法辛膠囊（批號171203）購自成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；內(nèi)標(biāo)3,4-二羥基芐胺·氫溴酸（3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide，DHBA，批號MKBS7646V）購自美國Sigma 公司；95%乙醇、石油醚、醋酸乙酯均為分析純，購自北京化工試劑公司；蔗糖、羧甲基纖維素鈉、聚山梨酯-80 購自北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，質(zhì)譜級甲酸購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；對照品膽酸（cholic acid，CA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%，批號201-337-8）、去氧膽酸（deoxycholic acid，DCA，批號201-478-5）、鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA，批號207-481-8）、豬去氧膽酸（hyodeoxycholic acid，HDCA ， 批號 203-358-6 ）、 熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA，批號204-879-3）、牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA，批號 204-695-4）、牛磺鵝去氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA，批號207-457-6）、?；悄懰幔╰aurocholic acid，TCA，批號205-653-7）均購自上海源葉生物科技有限公司，以上對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98% ； 18β- 甘草次酸（ 18βglycyrrhetinic acid，18β-GA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自四川永健醫(yī)藥有限公司；TBA ELISA 試劑盒（批號20160910）購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器

1290 II 型超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；3200Q-TRAP 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）；UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀及Xcalibur 工作站；Neofuge13R 型高速冷凍離心機(jī)（力康公司）；MX-S型可調(diào)式混勻儀（美國Scilogex 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore 公司）；Legend Micro17R 型高速低溫離心機(jī)；PRIME60i 型全自動生化儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國艾卡公司）；DHFSTPRP-24 型高通量組織研磨儀（寧波洛尚智能科技有限公司）；大鼠曠場實(shí)驗(yàn)測試箱（自制的無頂長方盒，長100 cm、寬100 cm、高70 cm，盒中四壁及底面涂黑，底部白線劃分成25 個邊長20 cm 的正方形格）。

2 方法

2.1 柴胡不同部位的提取

稱取柴胡飲片適量，用8 倍量95%乙醇浸泡12 h，回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，濾過，回收溶劑至干，加水分散，混懸液用等體積的石油醚萃取至無色，將上層萃取液回收溶劑至干即得柴胡石油醚低極性部位（出膏率1.6%）；下層混懸液用等體積的醋酸乙酯萃取至無色，將上層萃取液回收溶劑至干，即得柴胡醋酸乙酯中極性部位（出膏率1.98%）。將藥渣用8 倍量的水回流提取2 次，每次2 h，合并提取液與醋酸乙酯萃取后的下層混懸液，回收溶劑，得到柴胡水提物高極性部位（出膏率17.8%）。

2.2 分組、造模及給藥

54 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，根據(jù)體質(zhì)量、糖水偏愛率、曠場實(shí)驗(yàn)的基線結(jié)果，隨機(jī)分為對照組、模型組、鹽酸文拉法辛（35 mg/kg）組、柴胡低極性部位（15 g/kg）組、柴胡中極性部位（15 g/kg）和柴胡高極性部位（15 g/kg）組，每組9 只。使用課題組前期CUMS 模型復(fù)制方法[24]，均采用單籠飼養(yǎng)，連續(xù)28 d，大鼠每日給藥后1 h 給予刺激，且每種刺激的實(shí)施隨機(jī)不連續(xù)。刺激包括禁水，禁食24 h，夾尾刺激2 min，超聲刺激3 h，束縛3 h，50 ℃熱刺激5 min，電擊刺激（36 V、10 次），晝夜顛倒12 h，4 ℃游泳5 min。對照組大鼠正常飼養(yǎng)，每籠9 只，且不給予任何刺激。造模同時各給藥組ig 相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積溶劑（0.5%羧甲基纖維素鈉-0.5%聚山梨酯80 水溶液），1 次/d，連續(xù)28 d。

2.3 生物樣本收集

給藥結(jié)束后，通過股動脈取血的方式采集血液，置于EP 管中，靜置30 min 后4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，分離血清并分裝；同時收集新鮮的盲腸內(nèi)容物，放入液氮快速冷凍后儲存于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 抑郁癥大鼠行為學(xué)評價

參照文獻(xiàn)報道方法[25]，通過大鼠的體質(zhì)量變化、糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)（水平穿越格數(shù)和直立次數(shù)）的測定數(shù)據(jù)，觀察大鼠28 d 內(nèi)行為學(xué)變化。

2.5 血清中9 種神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定

采用課題組前期建立的LC-MS 法[26]，同時測定血清中的色氨酸（tryptophane，Trp）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、5-羥基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）、去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）、多巴胺（dopamine，DA）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、γ-氨基丁酸（γaminobutyricacid，GABA）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）9 種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。

2.6 生化指標(biāo)的測定

采用全自動生化分析儀測定γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和血清總膽紅素（serum bilirubin，TBIL）含量。

2.7 盲腸內(nèi)容物TBA 水平的測定

按照ELISA 試劑盒說明書測定各組大鼠TBA水平。

2.8 UPLC-MS 測定盲腸內(nèi)容物膽汁酸譜

2.8.1 對照品溶液的制備 分別稱取8 種膽汁酸（CA、DCA、CDCA、HDCA、UDCA、TUDCA、

TCDCA、TCA）對照品適量，結(jié)合型的水溶性膽汁酸對照品用超純水溶解，其他膽汁酸對照品以甲醇為溶劑溶解，均配成1.0 mmol/L 的對照品儲備液，置于-80 ℃的超低溫冰箱中儲藏備用，用于盲腸內(nèi)容物膽汁酸檢測的輔助鑒定。內(nèi)標(biāo)18β-GA 以甲醇為溶劑，配成1.0 mmol/L 的對照品儲備液備用。

2.8.2 樣品制備 從-80 ℃冰箱取出盲腸內(nèi)容物樣本，于4 ℃下解凍，精密稱定500 mg 置于5 mL EP 管，加入含內(nèi)標(biāo)的乙腈3 mL，渦旋2 min，4 ℃、13 000 r/min 離心15 min，取上清，取50 μL 進(jìn)樣分析。分別取樣本10 μL 混合作為質(zhì)控樣本。取8 種膽汁酸對照品均稀釋1 μmol/L，分別取50 μL 進(jìn)樣分析。

2.8.3 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，2% B；2～3 min，2%～35% B；3～17 min，35%～70% B；17～18 min，70% B；18～29 min，70%～98% B；29～31 min，98% B；31～33 min，98%～2% B。體積流量0.3 mL/min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.8.4 質(zhì)譜條件 選擇FullScan 掃描模式，正、負(fù)離子切換同時掃描及Target 掃描模式，使用Xcalibur 3.0 軟件對樣品進(jìn)行一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，儀器參數(shù)為ESI 源，噴霧電壓＋3.0 kV；噴霧電壓-2.7 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；加熱器溫度300 ℃；鞘氣壓力3 546.38 kPa；輔助氣壓力1 013.25 kPa；分辨率70 000；分辨率（dd-MS2）17 500，歸一化碰撞能量為12.5、25.0、37.5 eV；掃描范圍m/z50～1 200。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS statistics 16.0、Graphpad Prism 7.0、Excel 2016 等軟件處理。結(jié)果以±s表示。針對兩組數(shù)據(jù)間差異性比較采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，作圖軟件為GraphPad Prism 7.0。

3 結(jié)果

3.1 柴胡抗抑郁最佳部位篩選

3.1.1 柴胡不同極性部位對CUMS 大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響 如圖1 所示，與對照組比較，模型組大鼠的基礎(chǔ)生存狀態(tài)下降，活躍程度及對四周環(huán)境的好奇心降低、快感缺失，提示抑郁模型復(fù)制成功。在實(shí)驗(yàn)開始時，各組大鼠體質(zhì)量、糖水偏愛率、穿越格數(shù)、直立次數(shù)均無顯著差異。造模21、28 d，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05、0.001）；與模型組比較，造模28 d 各給藥組大鼠體質(zhì)量均升高。造模21、28 d，與對照組比較，模型組大鼠糖水偏愛率顯著降低（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠糖水偏愛率顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。造模7、21、28 d，與對照組比較，模型組大鼠水平穿越格數(shù)顯著降低（P＜0.05、0.001）；與模型組比較，造模14 d 柴胡高極性部位組大鼠水平穿越格數(shù)顯著升高（P＜0.05），造模28 d 鹽酸文拉法辛組、柴胡低極性部位組和柴胡中極性部位組大鼠水平穿越格數(shù)顯著升高（P＜0.05、0.01）。造模7、14、21、28 d，與對照組比較，模型組大鼠直立次數(shù)顯著降低（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，造模28 d 各給藥組大鼠直立次數(shù)均顯著升高（P＜0.05、0.01）。

圖1 柴胡不同極性部位對CUMS 大鼠體質(zhì)量、糖水偏愛率、穿越格數(shù)和直立次數(shù)的影響 (±s, n = 9)Fig.1 Effects of different polar parts of Bupleuri Radix on body weight, sucrose preference rate, number of crossing grids and rearing times in CUMS rats (±s, n = 9)

以上結(jié)果表明柴胡不同極性部位可提高CUMS模型大鼠的活動能力以及對新奇事物的探索能力，體質(zhì)量和糖水偏愛率顯著回調(diào)，但其中柴胡低極性部位效果最好。

3.1.2 柴胡不同極性部位對CUMS 大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響 如圖2 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中Trp、5-HT、GABA、Tyr 的含量明顯下降（P＜0.05、0.01），5-HIAA、Glu、ACH、DA、NE 的含量也有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，經(jīng)不同極性部位給藥處理后，柴胡中極性部位組的Trp、GABA、Glu、ACH、Tyr、NE水平明顯升高（P＜0.01、0.001），DA 水平升高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；柴胡高極性部位組的Trp、5-HT、5-HIAA、GABA、ACH、Tyr、DA 和NE 水平明顯升高（P＜0.01、0.001）；鹽酸文拉法辛組Trp、GABA、Tyr 和NE 水平顯著升高（P＜0.05、0.01），5-HT 水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；柴胡低極性部位組的Trp、5-HT、GABA、Tyr、和NE 的水平明顯升高（P＜0.01、0.001），DA 水平升高，且與對照組相比更接近。

圖2 柴胡不同極性部位對CUMS 大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響 (±s, n = 9)Fig.2 Effects of different polar parts of Bupleuri Radix on contents of neurotransmitters in serum of CUMS rats(±s, n = 9)

不同極性組分的聯(lián)合應(yīng)用可能會對多個靶點(diǎn)的作用起到一定的表征作用，而柴胡低極性部位可能具有最佳的抗抑郁效果。因此，被用于進(jìn)一步研究。

3.2 柴胡低極性部位改善抑郁大鼠肝功能指標(biāo)

如圖3 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中γ-GT 活性顯著升高（P＜0.05），TBIL 含量呈升高趨勢，提示模型大鼠的肝功能異常，存在輕微的肝損傷。給予柴胡低極性部位后，大鼠血清中γ-GT活性和TBIL 含量均顯著降低（P＜0.05），ALP 活性有回調(diào)趨勢，表明柴胡低極性部位可改善抑郁大鼠肝功能。

圖3 柴胡低極性部位對CUMS 大鼠血清中γ-GT、ALP 活性和TBIL 的含量的影響 (±s, n = 8)Fig.3 Effect of low polarity part of Bupleuri Radix on activities of γ-GT, ALP and content of TBIL in serum of CUMS rats(±s, n = 8)

3.3 柴胡低極性部位對CUMS 大鼠盲腸內(nèi)容物TBA 水平的影響

如圖4 所示，與對照組比較，模型組大鼠盲腸中TBA 水平顯著降低（P＜0.01），提示抑郁模型膽汁酸代謝存在障礙。給予柴胡低極性部位后，大鼠盲腸中TBA 含量顯著回調(diào)（P＜0.01），表明柴胡低極性部位可以緩解抑郁模型導(dǎo)致的TBA 水平紊亂，其發(fā)揮抗抑郁作用可能與調(diào)節(jié)膽汁酸的代謝有關(guān)。

圖4 柴胡低極性部位對CUMS 大鼠盲腸內(nèi)容物TBA 水平的影響 (±s, n = 8)Fig.4 Effect of low polarity part of Bupleuri Radix on TBA level in CUMS rats (±s, n = 8)

3.4 膽汁酸譜測定方法建立

3.4.1 UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 儀器系統(tǒng)穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果 每個質(zhì)控樣本分別提取的36 個提取離子的tR的RSD 均在0.5%以下，m/z的RSD 在4.02×10-7以內(nèi)，相對峰面積的RSD 均小于16%，表明儀器穩(wěn)定性較好，建立的UPLC-MS 測定的代謝組數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，滿足后續(xù)代謝組分析的要求。

3.4.2 質(zhì)譜色譜專屬性試驗(yàn) 在本實(shí)驗(yàn)條件下，所有膽汁酸有較大的質(zhì)譜峰和較好的分離度，經(jīng)處理的盲腸內(nèi)容物中其他雜質(zhì)不干擾樣品的分離測定。圖5 為不同通道下36 種膽汁酸加內(nèi)標(biāo)液色譜圖。初級的膽汁酸類多為鼠膽酸和異構(gòu)膽酸編號CA-1～CA-3，脫氧膽酸類未知的為D-1～D-3，石膽酸類未知的編號為L-1，牛磺脫氧膽酸類標(biāo)號為TD-1，甘氨脫氧膽酸類GD-1，甘氨膽酸類G-1～G-4，共包括8 個離子通道的17 種非結(jié)合型膽汁酸和19種結(jié)合型膽汁酸。

圖5 大鼠盲腸內(nèi)容物36 種膽汁酸及內(nèi)標(biāo)提取離子流圖Fig.5 Extracted ion chromatogram of 36 bile acids and internal standard in cecal contents of rats

3.5 盲腸內(nèi)容物中差異膽汁酸分析

采用擬靶向代謝組的方法對對照組、模型組和柴胡低極性部位組大鼠盲腸內(nèi)容物中的膽汁酸進(jìn)行研究，如圖6 所示，共檢測到36 種膽汁酸，總體趨勢與TCA 結(jié)果一致。模型組膽酸類α-MCA、ω-MCA、CA-2、CA、CA-3 含量均顯著下降（P＜0.05），給藥后CA 含量顯著回調(diào)，α-MCA、CA-3 呈回調(diào)趨勢；模型組脫氧膽酸類UDCA、D-3、CDCA 的含量顯著下降，給藥后UDCA 顯著上調(diào)，其他有上調(diào)趨勢：模型組?；墙Y(jié)合型膽汁酸均顯著下降，給藥后TLCA、TUDCA、TCDCA、TDCA 的含量顯著回調(diào)；模型組GLCA、GCA 等甘氨類膽酸都有下降趨勢，給藥后顯回調(diào)趨勢，但無顯著性差異。

圖6 大鼠盲腸內(nèi)容物的膽汁酸譜結(jié)果 (±s, n = 9)Fig.6 Results of bile acid spectrum of cecal contents in rats (±s, n = 9)

將鑒定出來的36 種膽汁酸類型按照分組進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）見圖7-A，結(jié)果顯示不同組之間有明顯的聚類和分離趨勢。隨后將測定出來的36 種膽汁酸按照模型組和給藥組進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（ orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）見圖7-B，可見兩者具有一定分離趨勢，進(jìn)一步設(shè)置變量重要性投影（variable importance projection，VIP）≥1 和t檢驗(yàn)（P＜0.05）進(jìn)行差異代謝物的篩選，篩選出2 組的5 種差異膽汁酸（TUDCA、UDCA、TDCA、TCDCA、TLCA），表明柴胡低極性部位主要通過回調(diào)這5 種差異膽汁酸的含量來發(fā)揮抗抑郁作用。

圖7 各組膽汁酸類型PCA 得分圖 (A)、模型組和柴胡低極性部位組OPLS-DA 得分圖 (B)Fig.7 PCA score map of bile acid types in each group (A), OPLS-DA score map in model group and low polarity part of Bupleuri Radix group (B)

4 討論

神經(jīng)遞質(zhì)假說是普遍公認(rèn)的抑郁癥發(fā)病機(jī)制，認(rèn)為抑郁癥與神經(jīng)突觸間隙單胺類遞質(zhì)水平減少有關(guān)[27]。研究表明，體內(nèi)神經(jīng)突觸間隙NE、5-HT 或DA 相對或絕對不足是引起抑郁癥發(fā)生的重要原因，且5-HT 水平受其合成前體Trp 和其代謝物5-HIAA 含量的影響[28]，模型組Trp、5-HT 含量降低，柴胡低極性部位組可回調(diào)Trp、5-HT、5-HIAA 水平，調(diào)控5-HT 的代謝途徑。研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激性生活事件使Glu 濃度升高，GABA 濃度降低，引起Glu 能系統(tǒng)過度激活，而GABA 神經(jīng)傳遞活動減退，Glu 和GABA 的平衡失調(diào)導(dǎo)致抑郁等情感障礙疾病的發(fā)生[29]。模型組GABA、GABA/Glu 含量降低，給藥后柴胡低極性部位組可顯著升高GABA 的水平，調(diào)節(jié)氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)比例的平衡。

本研究中模型組血清γ-GT 活性和TBIL 含量均有不同程度的升高，表明CUMS 大鼠肝細(xì)胞可能存在一定程度的損傷，與許多文獻(xiàn)報道一致[30-31]。而ALP 的下調(diào)趨勢與肝細(xì)胞損傷的結(jié)果相反，臨床上ALP 活性下降見于貧血或者營養(yǎng)不良，推測可能與抑郁大鼠飲食量降低造成的營養(yǎng)不良有關(guān)。而臨床研究報道，肝功能指標(biāo)γ-GT、TBIL、ALP 均可在疾病的不同嚴(yán)重程度檢測到升高，但是ALP 的升高呈不規(guī)則性，個體差異較大[27]，這也可能是本研究ALP 活性下降的另一個原因。給予柴胡低極性部位干預(yù)后，生化指標(biāo)均有不同程度的回調(diào)，說明柴胡低極性部位具有肝保護(hù)作用。

通過對盲腸內(nèi)容物的TBA 水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)TBA 發(fā)生了顯著變化，而TBA 水平改變說明整個膽汁酸循環(huán)代謝出現(xiàn)障礙。給藥后盲腸內(nèi)容物總膽汁酸水平顯著回調(diào)，提示柴胡低極性部位可能促進(jìn)膽汁排泄、調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、合成等途徑改善抑郁癥。擬靶向代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，柴胡低極性部位給藥后，體內(nèi)膽汁酸代謝發(fā)生了變化。文獻(xiàn)研究表明，重度抑郁障礙患者TLCA 顯著下降[32]，這與本研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，UDCA 可通過改變膽汁酸池，抑制小腸吸收毒性膽汁酸等，從而發(fā)揮肝保護(hù)作用[33-34]，最近許多研究報道也發(fā)現(xiàn)UDCA 具有神經(jīng)保護(hù)作用[35-36]。因此UDCA 的下調(diào)可能是疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素。已有研究表明TUDCA 可以發(fā)揮抗抑郁樣作用[37]。柴胡疏肝散抗抑郁作用研究中發(fā)現(xiàn)CUMS 大鼠肝組織中TUDCA 水平顯著下降，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[38]。提示UDCA 與TUDCA 水平的降低可能與疾病的發(fā)生密切相關(guān)，表明柴胡低極性部位可能通過調(diào)節(jié)膽汁酸譜從而治療抑郁癥，具體代謝通路和機(jī)制仍需繼續(xù)驗(yàn)證。此外，課題組前期鑒定了柴胡低極性部位的入血成分，具有代表性的10種活性成分為柴胡皂苷元A、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、槲皮素、異鼠李素、多炔類RB2、RB4、RB6、RB9[9-10]。

綜上，本研究篩選出柴胡低極性部位為最佳抗抑郁部位，具有較好的抗抑郁作用和保肝作用。同時具有調(diào)節(jié)膽汁酸譜的作用，基于UPLC-MS 建立了擬靶向代謝組學(xué)測定方法，可同時測定36 種膽汁酸的相對含量，能夠用于大鼠膽汁酸譜的測定。該方法前處理操作方便快捷，靈敏度和特異性較高，對某些疾病的早期無創(chuàng)診斷和深入的研究具有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突