經(jīng)典名方養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品UPLC 指紋圖譜及含量測(cè)定研究

熊良益 ，高永堅(jiān)，林碧珊，梁浩明，楊敏娟，張 蜀 *

1. 廣東藥科大學(xué) 新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006

2. 國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

3. 廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

養(yǎng)胃湯出自《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[1]中的第68 首，源自《證治準(zhǔn)繩》（明·王肯堂）。處方記載“治外感風(fēng)寒，內(nèi)傷生冷，憎寒壯熱，頭目昏疼，不問(wèn)風(fēng)寒二證，夾食停痰，俱能治之。但感風(fēng)邪，以微汗為好?！惫δ苤髦螢橥飧酗L(fēng)寒、內(nèi)傷生冷、惡心嘔吐等。由清半夏、姜厚樸、麩炒蒼術(shù)、橘紅、廣藿香葉、草果仁、茯苓、人參、炒甘草、生姜、烏梅11 味藥味組成，各藥味之間相輔相成，共奏溫中理氣、燥濕和胃之功。臨床上，養(yǎng)胃湯常用于治療消化道[2]、慢性胃炎[3]等疾病。2021 年9月國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》指出“基準(zhǔn)樣品”[4]是橋接古代經(jīng)典名方和中藥3.1 類制劑，是還原根據(jù)古籍記載制備湯劑的參比物質(zhì)，對(duì)于經(jīng)典名方制劑的開發(fā)至關(guān)重要。

關(guān)于養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品成分和質(zhì)量控制研究相對(duì)較少，大多集中于單味藥、藥對(duì)化學(xué)成分或是化裁方的藥效研究[5-10]，較缺乏對(duì)養(yǎng)胃湯更為綜合、全面的質(zhì)量控制方法的研究。本研究采用UPLC 建立了養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜與7 種成分的含量測(cè)定方法，從定性和定量2 個(gè)方面對(duì)養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品進(jìn)行全面研究，為養(yǎng)胃湯后續(xù)藥學(xué)研究及其相關(guān)制劑的開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-40DXS 型島津高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；Waters H-Class 型超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；ME204E 型萬(wàn)分之一電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；PL203 型百萬(wàn)分之一電子分析天平，上海梅特勒-托利多公司；Unique-R202 型多功能超純水系統(tǒng)，廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司；KQ-500DE 型超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；FD.1C.50 型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 材料

對(duì)照品人參皂苷Rg1（Rg1，批號(hào)110703-202034，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.0%）、人參皂苷Re（Re，批號(hào)110754-202129，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.0%）、人參皂苷Rb1（Rb1，批號(hào)110704-202129，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.3%）、橙皮苷（批號(hào)110721-202019，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.3%）、厚樸酚（批號(hào)110729-202015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）、和厚樸酚（批號(hào)110730-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）、甘草酸（批號(hào)10731-202122，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.4%）、甘草苷（批號(hào)111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、廣藿香酮（批號(hào)111822-201904，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）、綠原酸（批號(hào)110753-035，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、6-姜辣素（批號(hào)1118-2020070，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）、奎寧酸（批號(hào)111717-20140，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.5%）、柚皮苷（批號(hào)110722-202116，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.5%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%）、川陳皮素（批號(hào)112055-202102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、橘皮素（批號(hào)112054-202102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、腺苷（批號(hào)110879-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、鳥苷（批號(hào)111977-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.6%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品蒼術(shù)苷A（批號(hào)126054-77-1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）購(gòu)自中科華檢（北京）科技有限公司；對(duì)照品兒茶素（批號(hào)Lot5878，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、芹糖甘草苷（批號(hào)74639-14-8，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；對(duì)照品新綠原酸（批號(hào)DST180130-015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）、隱綠原酸（批號(hào)DST170210-035，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）均購(gòu)自成都德思特生物科技有限公司。色譜甲醇、色譜乙腈，購(gòu)自Dikma 科技有限公司；色譜磷酸，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；分析甲醇，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

11 味藥材均購(gòu)于其道地產(chǎn)地或主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司質(zhì)量部劉國(guó)慧副主任中藥師鑒定，各藥材基原如下：人參為五加科人參屬植物人參PanaxginsengC. A. Mey.的干燥根和根莖，半夏為天南星科半夏屬植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，厚樸為木蘭科厚樸屬植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd. et Wils 的干燥干皮及枝皮，蒼術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.) DC.的干燥根莖，橘紅為蕓香科柑橘屬植物橘CitrusreticulataBlanco 及其栽培變種的干燥外層果皮，廣藿香為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.的干燥葉，草果為姜科豆蔻屬植物草果Amomumtsao-koCrevost et Lemaire 的干燥成熟果實(shí)，茯苓為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核，甘草為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.干燥根和根莖，生姜為姜科姜屬多年生草本植物姜ZingiberofficinaleRoscoe 的新鮮根狀莖，烏梅為薔薇科李屬木本植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的近成熟果實(shí)。各藥材按《中國(guó)藥典》2020年版一部項(xiàng)下檢測(cè)均合格。本研究參考《中國(guó)藥典》2020 年版藥材項(xiàng)下炮制方法，對(duì)藥材進(jìn)行炮制及檢測(cè)，在檢測(cè)合格的基礎(chǔ)上采用隨機(jī)數(shù)表法將不同批次藥材進(jìn)行組合，藥材批號(hào)及產(chǎn)地組合信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 基準(zhǔn)樣品的制備

原方記載：半夏（湯洗七次）、厚樸（去粗皮、姜汁炒）、蒼術(shù)（米泔浸一宿，洗切，炒）各一兩，橘紅七錢半，藿香葉（洗去土）、草果（去皮膜）、茯苓（去黑皮）、人參（去蘆）各半兩，炙甘草二錢半。右?咀，每服四錢，水一盞半，姜七片，烏梅一個(gè)，煎六分，熱服。按照《中國(guó)科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》[11]記載，明代衡量單位量值小于元代，1 斤量值在596.8 g。而1 斤為16 兩，因此1 兩折合為37.3 g；1 錢折合為3.73 g?！夺t(yī)學(xué)正傳》[12]凡例：“凡云用水一盞，即今之白茶盞也，約計(jì)半斤之?dāng)?shù)，余仿此”。明朝1 斤重596.8 g[13]，則所述“一盞水”重298.4 g，約300 g，即300 mL。因此，本實(shí)驗(yàn)采取1 盞等于300 mL 來(lái)折算，再看煎煮方法，本方為煮散劑，參考文獻(xiàn)查閱[14]，即得養(yǎng)胃湯處方為清半夏37.30 g，姜厚樸37.30 g，麩炒蒼術(shù)37.30 g，橘紅27.98 g，廣藿香葉18.65 g，草果仁18.65 g，茯苓18.65 g，人參18.65 g，炒甘草9.33 g，粉碎成粗粉，生姜7 g，烏梅2.65 g，加水450 mL，武火煮沸后文火煎至270 mL，趁熱濾過(guò)。分裝至西林瓶，-50 ℃預(yù)冷凍3 h 后冷凍干燥72 h，壓蓋密塞，即得到養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品凍干粉。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取奎寧酸、腺苷、鳥苷、新綠原酸、蒼術(shù)苷A、綠原酸、隱綠原酸、兒茶素、甘草苷、芹糖甘草苷、柚皮苷、橙皮苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為21.3、25.6、24.0、22.1、28.7、25.2、29.8、20.5、23.1、20.3、21.0、22.3 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液1。取毛蕊花糖苷、甘草酸、6-姜辣素、川陳皮素、橘皮素、和厚樸酚、廣藿香酮、厚樸酚對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為21.0、24.3、28.2、20.3、26.8、23.2、21.5、22.7 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液2。

2.2.2 供試品溶液 取基準(zhǔn)樣品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按“2.1”項(xiàng)下制備方法，分別制備缺清半夏、缺姜厚樸、缺麩炒蒼術(shù)、缺橘紅、缺廣藿香葉、缺草果仁、缺茯苓、缺人參、缺炒甘草、缺生姜、缺烏梅的陰性基準(zhǔn)樣品。取陰性基準(zhǔn)樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法分別制備各陰性供試品溶液，即得。

2.2.4 單味藥對(duì)照溶液 按“2.1”項(xiàng)下制備方法，分別制備清半夏、姜厚樸、麩炒蒼術(shù)、橘紅、廣藿香葉、草果仁、茯苓、人參、炒甘草、生姜、烏梅單味藥基準(zhǔn)樣品。取單味藥基準(zhǔn)樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法分別制備各單味藥供試品溶液。

2.3 養(yǎng)胃湯UPLC 指紋圖譜研究

2.3.1 色譜條件

（1）指紋圖譜I：色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，8%乙腈；15～40 min，8%～15%乙腈；40～65 min，15%～21%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm；體積流量為0.30 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

（2）指紋圖譜II：色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～5 min，25%乙腈；5～60 min，25%～50%乙腈；60～70 min，50%～75%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；體積流量為0.30 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果2 張指紋圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜1.2%，相對(duì)峰面積的RSD 均＜7.0%，結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果2 張指紋圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜0.7%，相對(duì)峰面積的RSD 均＜4.7%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果2 張指紋圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜1.0%，相對(duì)峰面積的RSD 均＜4.8%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.5 耐用性考察 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，考察不同儀器Waters H-Class UPLC TUV、Waters H-Class UPLC PDA；不同色譜柱選擇同一廠家不同生產(chǎn)批次的Waters UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；不同柱溫33、35、37 ℃；不同體積流量0.27、0.30、0.33 mL/min 下，2 張指紋圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜3.0%，相對(duì)峰面積的RSD 均＜5.0%，結(jié)果表明該指紋圖譜方法在不同儀器、色譜柱、柱溫、流動(dòng)相體積流量下，該方法耐用性良好。

2.4 UPLC 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取15 批基準(zhǔn)樣品（S1～S15）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。將上述數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（2012 版），以S1 為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行峰多點(diǎn)校正和mark 峰匹配，其中指紋圖譜I 匹配了24 個(gè)共有峰（圖1），指紋圖譜II 匹配了21 個(gè)共有峰（圖1）。15 批基準(zhǔn)樣品（S1～S15）2 張指紋圖譜相似度均＞0.9（表2），結(jié)果表明，不同產(chǎn)地飲片制備所得養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品的物質(zhì)基礎(chǔ)成分組成較接近。

圖1 15 批養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品 (S1～S15) 的UPLC 指紋圖譜I、II 疊加圖及其共有模式圖譜 (RI、RII)Fig.1 UPLC fingerprint I, II overlays of 15 batches of Yangwei Decoction benchmark samples (S1-S15) and common pattern maps (RI, RII)

表2 15 批養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品 (S1～S15) 指紋圖譜I、II 的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Similarity evaluation results of fingerprints I, II of 15 batches of Yangwei Decoction benchmark samples (S1-S15)

2.5 共有峰歸屬

按“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)下方法制備陰性、單味藥對(duì)照溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。根據(jù)2 套指紋圖譜的相似度匹配結(jié)果對(duì)共有峰進(jìn)行編號(hào)，經(jīng)對(duì)照品、基準(zhǔn)樣品、單味藥樣品、各單味藥陰性樣品相關(guān)圖譜色譜峰比對(duì)。

圖譜結(jié)果顯示：（1）指紋圖譜I：1、2、5、9～11、14 號(hào)峰歸屬烏梅；2 號(hào)峰歸屬清半夏；1、2、6 號(hào)峰歸屬麩炒蒼術(shù)；3、4 號(hào)峰歸屬茯苓；6～8、10、12、15、17、22～24 號(hào)峰歸屬橘紅；13 號(hào)峰歸屬草果仁；14、16、18、19 號(hào)峰歸屬姜厚樸；20、21 號(hào)峰歸屬炒甘草（圖2）；（2）指紋圖譜II：1、5、6、12、18、21 號(hào)峰歸屬姜厚樸；2、3、5、7、10、13～15 號(hào)峰歸屬橘紅；8、9、12、17、19 號(hào)峰歸屬炒甘草；11 號(hào)峰歸屬生姜；15～17、20 號(hào)峰歸屬?gòu)V藿香葉（圖3）。其中，指紋圖譜II 中11 號(hào)峰（6-姜辣素）在生姜、姜厚樸單味藥中均具有明顯色譜峰，但在厚樸單味藥基準(zhǔn)樣品中未有響應(yīng)，即姜厚樸單味藥中6-姜辣素是因?yàn)楹駱闩c姜汁一起炮制而引入，所以生姜是6-姜辣素（11 號(hào)峰）的唯一來(lái)源[15]。

圖2 養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品與單味飲片和陰性樣品的UPLC 指紋圖譜IFig.2 UPLC fingerprint I of Yangwei Decoction benchmark samples and single herbal pieces and negative samples

圖3 養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品與單味飲片和陰性樣品的UPLC 指紋圖譜IIFig.3 UPLC fingerprint II of Yangwei Decoction benchmark samples and single herbal pieces and negative samples

2.6 色譜峰指認(rèn)

養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜共標(biāo)定了45 個(gè)特征峰，通過(guò)與對(duì)照品色譜峰進(jìn)行比對(duì)指認(rèn)出20 個(gè)色譜峰。其中，指紋圖譜I 中1 號(hào)峰為奎寧酸、3 號(hào)峰為腺苷、4 號(hào)峰為鳥苷、5 號(hào)峰為新綠原酸、6 號(hào)峰為蒼術(shù)苷A、9 號(hào)峰為綠原酸、11 號(hào)峰為隱綠原酸、13 號(hào)峰為兒茶素、20 號(hào)峰為甘草苷、21 號(hào)峰為芹糖甘草苷、23 號(hào)峰為柚皮苷、24 號(hào)峰為橙皮苷（圖4）；指紋圖譜II 中4 號(hào)峰為毛蕊花糖苷、9 號(hào)峰為甘草酸、11 號(hào)峰為6-姜辣素、13 號(hào)峰為川陳皮素、15 號(hào)峰為橘皮素、18 號(hào)峰為和厚樸酚、20 號(hào)峰為廣藿香酮、21 為號(hào)峰為厚樸酚（圖5）。

圖4 混合對(duì)照品 (A)、養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品 (B) 和空白溶劑(C) 的UPLC 指紋圖譜IFig.4 UPLC fingerprint I of mixed reference solution (A),Yangwei Decoction benchmark sample (B) and blank solution (C)

圖5 混合對(duì)照品 (A)、養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品 (B) 和空白溶劑(C) 的UPLC 指紋圖譜IIFig.5 UPLC fingerprint II of mixed reference solution (A),Yangwei Decoction benchmark sample (B) and blank solution (C)

2.7 養(yǎng)胃湯中多指標(biāo)成分定量測(cè)定

2.7.1 色譜條件

（1）Rg1、Re、Rb1：色譜柱為Waters Cortecs C18柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水；梯度洗脫：0～7.0 min，19%乙腈；7.0～10.5 min，19%～25%乙腈；10.5～22.0 min，25%～29%乙腈；22.0～31.0 min，29%～47%乙腈；31.0～39.0 min，47%～80%乙腈；體積流量0.30 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)器：ELSD，漂移管溫度85 ℃；氣體體積流量1.5 L/min。理論塔板數(shù)按Rb1峰計(jì)算不低于5 000。

（2）橙皮苷：色譜柱為Waters HSS T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（40∶60）；等度洗脫；體積流量0.30 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm。理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算不低于4 000。

（3）和厚樸酚、厚樸酚：色譜柱為Waters HSS T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（78∶22）；等度洗脫；體積流量0.30 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm。理論塔板數(shù)按厚樸酚峰計(jì)算不低于10 000。

（4）甘草酸：色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液（31∶69）；等度洗脫；體積流量0.30 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。理論塔板數(shù)按甘草酸峰計(jì)算不低于6 000。

2.7.2 對(duì)照品溶液的制備 取Rg1、Re、Rb1對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為98.5、97.0、99.8 μg/mL 的混合溶液，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

取橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚、甘草酸對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇分別制成含橙皮苷40.3 μg/mL 對(duì)照品溶液，含厚樸酚22.4 μg/mL、和厚樸酚22.5 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，含甘草酸20.2 μg/mL 的對(duì)照品溶液，即得。

2.7.3 供試品溶液的制備

（1）Rg1、Re、Rb1：精密稱取基準(zhǔn)樣品1.0 g，加水20 mL 使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次40 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

（2）和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷和甘草酸：精密稱取基準(zhǔn)樣品0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 Hz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.7.4 陰性、單味藥供試品溶液的制備 按照“2.7.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，分別制備缺人參、橘紅、姜厚樸、炒甘草的陰性供試品溶液及單味藥供試品溶液。

2.7.5 專屬性考察 分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液、單味藥供試品溶液，按照“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。各指標(biāo)成分在陰性下無(wú)干擾，分離度、理論板數(shù)均較好，專屬性強(qiáng)，色譜圖見(jiàn)圖6～9。

圖6 養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品中Rg1、Re 及Rb1 含量測(cè)定色譜圖Fig.6 Chromatogram of Rg1, Re and Rb1 content determination in Yangwei Decoction benchmark samples

圖7 養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品中橙皮苷含量測(cè)定色譜圖Fig.7 Chromatogram of hesperidin content determination in Yangwei Decoction benchmark samples

圖8 養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品中和厚樸酚、厚樸酚含量測(cè)定色譜Fig.8 Chromatogram of honokiol and magnolol content determination in Yangwei Decoction benchmark samples

圖9 養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品中甘草酸含量測(cè)定色譜圖Fig.9 Chromatogram of glycyrrhizinic acid content determination in Yangwei Decoction benchmark samples

2.7.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.7.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用相應(yīng)溶劑分別稀釋配制成7 個(gè)不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品溶液。按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度或進(jìn)樣質(zhì)量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），測(cè)定的峰面積或其對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程及線性范圍分別為Rg1Y＝15 800X＋67 900，r＝0.999 2，線性范圍24.21～484.23 μg/mL；ReY＝15 700X＋67 900，r＝0.999 7，線性范圍22.79～455.81 μg/mL；Rb1Y＝15 700X＋67 600，r＝0.999 3，線性范圍23.51～470.17 μg/mL；橙皮苷Y＝60 900X-77 300，r＝1.000 0，線性范圍7.24～362.14 μg/mL；和厚樸酚Y＝52 000X＋33 000，r＝0.999 8，線性范圍2.52～252.25 μg/mL；厚樸酚Y＝44 300X＋33 800，r＝0.999 8，線性范圍2.20～220.16 μg/mL；甘草酸Y＝5 810X＋7 760，r＝0.999 5，線性范圍4.59～229.73 μg/mL。

2.7.7 精密度考察 按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1 份，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸峰面積的RSD 分別為2.2%、2.0%、1.8%、0.3%、0.5%、0.4%、1.1%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7.8 穩(wěn)定性考察 按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1 份，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 后，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸峰面積的RSD 分別為3.7%、4.5%、3.6%、1.2%、0.8%、1.1%、1.7%，結(jié)果表明該供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.9 重復(fù)性考察 按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.099、0.081、0.094、0.691、0.047、0.057、0.093 mg/g，RSD 分別為3.3%、3.0%、2.9%、1.9%、3.9%、3.2%、1.8%，表明建立的方法重復(fù)性良好。

2.7.10 準(zhǔn)確度考察 取養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品共9 份，按1∶0.5、1∶1、1∶1.5 比例加入對(duì)照品，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸的平均加樣回收率分別為102.9%、101.3%、102.6%、94.8%、95.0%、107.0%、98.5%，RSD 依次為3.7%、3.4%、4.2%、3.2%、4.2%、2.1%、1.3%，結(jié)果表明建立的方法準(zhǔn)確度良好。

2.7.11 耐用性考察 按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，考察不同液相儀器、不同色譜柱、柱溫、體積流量對(duì)Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸7 種指標(biāo)成分含量的影響。

（1）不同儀器的影響：Waters H-Class UPLC TUV、Waters H-Class UPLC PDA、島津UPLC-40 DXS 3 種儀器對(duì)7 種指標(biāo)成分Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量測(cè)定的RSD 分別為3.0%、2.3%、2.4%、2.9%、1.7%、1.9%、3.1%。

（2）不同色譜柱的影響：Waters HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters Cortecs C18柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）、Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）對(duì)7 種指標(biāo)成分Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量測(cè)定的RSD 分別為3.6%、1.4%、4.2%、3.9%、2.4%、2.3%、3.7%。

（3）不同體積流量的影響：考察0.27、0.30、0.33 mL/min 3 種不同體積流量對(duì)7 種指標(biāo)成分Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量測(cè)定的RSD 分別為3.1%、3.4%、2.3%、3.2%、2.8%、3.0%、3.4%。

（4）不同柱溫的影響：考察28、30、32 ℃ 3 種不同柱溫對(duì)7 種指標(biāo)成分Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量測(cè)定的RSD 分別為3.6%、2.4%、1.9%、1.7%、1.6%、1.8%、2.2%。結(jié)果表明，以上考察因素測(cè)定的各指標(biāo)成分含量的RSD 均小于5%，表明各考察因素對(duì)Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量的測(cè)定影響較小。

2.7.12 樣品測(cè)定 取15 批養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品（S1～S15），按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以含量測(cè)定均值上下浮動(dòng)30%規(guī)定出各指標(biāo)成分的含量范圍，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明：（1）Rg1的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.120 mg/g，波動(dòng)范圍0.081～0.163 mg/g，均值的±30%為0.084～0.155 mg/g，S5、S8 不在范圍內(nèi)；Re 的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.093 mg/g，波動(dòng)范圍0.053～0.175 mg/g，均值的±30%為0.065～0.120 mg/g，S5、S10不在范圍內(nèi)；Rb1的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.352 mg/g，波動(dòng)范圍0.225～0.554 mg/g，均值的±30%為0.246～0.457 mg/g，S5、S8、S13 不在范圍內(nèi)；（2）橙皮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.015 mg/g，波動(dòng)范圍5.778～8.926 mg/g，均值的±30%為4.911～9.120 mg/g，均在范圍內(nèi)；（3）和厚樸酚＋厚樸酚的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.387 mg/g，波動(dòng)范圍0.834～2.865 mg/g，均值的±30%為0.971～1.804 mg/g，S1、S3、S5 不在范圍內(nèi)；（4）甘草酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.414 mg/g，波動(dòng)范圍 1.060～1.825 mg/g，均值的±30%為0.990～1.838 mg/g。

表3 15 批基準(zhǔn)樣品中7 種指標(biāo)性成分含量測(cè)定Table 3 Determination of seven index components in 15 batches of benchmark samples

3 討論

3.1 色譜條件的考察

本研究考察了不同流動(dòng)相體系（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液）對(duì)養(yǎng)胃湯色譜峰的影響，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液體系時(shí)，各色譜峰響應(yīng)良好，對(duì)稱性好，分離度好。在上述色譜條件下，采用全波長(zhǎng)（200～400 nm）掃描，在前期建立的一套指紋圖譜方法中，由于各色譜峰分離度差、響應(yīng)較低，因此根據(jù)化合物成分特點(diǎn)與極性大小[16]，篩選2 種不同的色譜條件，其中指紋圖譜I 波長(zhǎng)為300 nm 時(shí)能夠得到有機(jī)酸類、核苷類、酚酸類、黃酮類成分；指紋圖譜II波長(zhǎng)為203 nm 時(shí)能夠得到苯乙醇類、糖苷類、黃酮苷元、酚類以及揮發(fā)性成分，建立的2 套指紋圖譜分析方法，其色譜峰豐富，響應(yīng)高，能較全面表征養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品內(nèi)在質(zhì)量。

在含量測(cè)定方法中考察了不同流動(dòng)相（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液），不同漂移管溫度（85、105 ℃）及不同載氣流量（1.5、2.0 L/min）對(duì)養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品中人參皂苷類成分含量的影響，結(jié)果表明在流動(dòng)相為乙腈-水，漂移管溫度85 ℃，氣體體積流量1.5 L/min 時(shí)各色譜峰響應(yīng)良好，分離度好。

對(duì)建立的指紋圖譜與7 種指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)考察，均符合要求，表明所建立的方法穩(wěn)定可行，可用于養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品的測(cè)定。

3.2 供試品溶液的考察

本研究考察了不同比例的甲醇（50%、70%、100%甲醇），不同提取方式（超聲處理、加熱回流）及不同提取時(shí)間（30、45、60 min）對(duì)指紋圖譜色譜峰的影響，在提取溶劑為50%甲醇、超聲處理30 min時(shí)色譜峰較豐富，各色譜峰響應(yīng)良好。

本研究考察了不同提取溶劑（甲醇、水飽和正丁醇萃?。?，不同取樣量（0.5、1.0、1.5 g）對(duì)養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品中人參皂苷類成分含量的影響，結(jié)果表明在取樣量為1.0 g 采用水飽和正丁醇萃取時(shí)人參皂苷類成分提取率較高。

3.3 指紋圖譜結(jié)果分析

15 批基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的相似度均大于0.9，表明15 批養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品物質(zhì)基礎(chǔ)組成較穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)共指認(rèn)出20 個(gè)色譜峰。指紋圖譜表征了10 味藥，由于人參中主要皂苷類成分為紫外末端吸收[17]，指紋圖譜中無(wú)共有峰歸屬于人參，但建立了人參皂苷的含量測(cè)定方法，綜合2 種方法，養(yǎng)胃湯中11 味藥都得以表征。

3.4 定量指標(biāo)成分的選擇與限度范圍

養(yǎng)胃湯所含藥味眾多，化學(xué)成分復(fù)雜。在前期研究中，臣藥廣藿香葉專屬性成分百秋李醇、廣藿香酮為揮發(fā)性成分且含量較低，不適宜作為含量測(cè)定指標(biāo)[18]；佐藥草果仁主要化學(xué)成分包括揮發(fā)油、酚類等，在前期研究中，對(duì)草果仁藥材中專屬性成分兒茶素進(jìn)行含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)其含量較低，兒茶素為脂溶性成分，水溶性較差，不適宜作為含量測(cè)定指標(biāo)[19]；佐藥烏梅專屬性成分為新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸，含量相對(duì)較高，但由于很多中藥材均含有該3 種成分，專屬性較差，故上述3 種成分不適宜作為含量測(cè)定指標(biāo)[20-23]；茯苓主要成分為多糖和三萜類成分[24]，半夏中主要有效成分為氨基酸、生物堿、核苷等[25]，含量較低，暫未建立質(zhì)量分析方法，后續(xù)本課題組將做進(jìn)一步研究。

養(yǎng)胃湯中人參為君藥，人參皂苷是其主要活性成分[26]，通過(guò)ELSD 建立了人參含量測(cè)定分析方法，其中Rg1的含量波動(dòng)范圍0.081～0.163 mg/g，均值的±30%為0.084～0.155 mg/g，S5、S8 的Rg1含量分別高于上限和低于下限；Re 含量波動(dòng)范圍0.053～0.175 mg/g，均值的±30%為0.065～0.120 mg/g，S5、S10 的Re 含量分別高于上限和低于下限；Rb1含量波動(dòng)范圍0.225～0.554 mg/g，均值的±30%為0.246～0.457 mg/g，S5、S8、S13 的Rb1含量分別高于上限和低于下限，可能是取樣時(shí)參須和參身比例的差異使其離群[27-28]。佐藥姜厚樸專屬性成分和厚樸酚＋厚樸酚總量波動(dòng)范圍 0.834～2.865 mg/g，均值的±30%為0.971～1.804 mg/g，S1、S3、S5 的和厚樸酚與厚樸酚總含量不在范圍內(nèi)，可能是飲片中有根皮、枝皮或2 個(gè)混合等用藥部位的差異使其離群[29-30]。佐藥橘紅專屬性成分橙皮苷波動(dòng)范圍5.778～8.926 mg/g，均值的±30%為4.911～9.120 mg/g，均在范圍內(nèi)；使藥炒甘草專屬性成分甘草酸波動(dòng)范圍1.060～1.825 mg/g，均值的±30%為0.990～1.838 mg/g，所有批次均在范圍內(nèi)。上述結(jié)果表明養(yǎng)胃湯基準(zhǔn)樣品各批次間指標(biāo)性成分含量差異較小。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突