厚樸揮發(fā)油納米乳凝膠的制備及其對潰瘍性結腸炎小鼠的藥效評價

張 倩，劉 芳，張芮苑，鄧鴻丹，楊璐萍，任 虹

成都中醫(yī)藥大學 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

厚樸為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.或凹葉厚樸M.officinalisRehd. et Wils.var.bilobaRehd. et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，具有下氣除滿、燥濕消痰之功[1]。厚樸主要含有木脂素、苷類、生物堿、揮發(fā)油等成分[2]，研究表明厚樸揮發(fā)油中石竹烯[3]、檸檬烯[4]、萜品烯-4-醇[5]等成分與抗?jié)冃越Y腸炎（ulcerative colitis，UC）緊密相關，課題組前期研究證明厚樸揮發(fā)油對葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導的UC 小鼠具有治療作用[6]。

然而厚樸揮發(fā)油具有易揮發(fā)、穩(wěn)定性差、無明確結腸靶向作用等特點，在口服遞送中易受肝臟首過效應及腸道黏膜的代謝而降低其療效[7]，因此如何改善厚樸揮發(fā)油穩(wěn)定性和將其有效遞送到炎癥腸道部位，成為厚樸揮發(fā)油治療UC 需解決的關鍵問題。納米乳凝膠兼具納米乳和凝膠的雙重優(yōu)點，納米乳能夠顯著改善藥物的溶解度，提高藥物穩(wěn)定性，凝膠則能提高納米乳的黏附性，增強藥物在結腸中的滯留，實現(xiàn)持續(xù)藥物釋放的作用[8]。因此，本實驗制備了厚樸揮發(fā)油納米乳（MagnoliaeOfficinalis Cortexvolatile oil nanoemulsion，MN）和厚樸揮發(fā)油納米乳凝膠（MagnoliaeOfficinalisCortexvolatile oil nanogel，MNG），并對其理化性質進行表征，同時考察了MNG 在小鼠消化道內的靶向釋藥行為，驗證了其對UC 小鼠模型的治療效果，以期為厚樸揮發(fā)油新劑型和抗UC 新藥的開發(fā)提供候選方案。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CPA225D 型電子天平，美國奧豪斯儀器有限公司；Spectra MAX Plus384 型酶標儀，美谷分子儀器有限公司；KZ-III-F 型高速低溫組織研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；UPH-Ⅱ-10T 型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司；BA410 型顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；IVIS Spectrum 型小動物三維光學活體成像儀，珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司；JEM-1400plus 型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；Axio Imagerm2 EVO10 型光電聯(lián)用成像系統(tǒng)，上海準權儀器設備有限公司。

1.2 藥材與試劑

厚樸干皮收采于四川省都江堰市虹口鄉(xiāng)，經成都中醫(yī)藥大學藥學院高級實驗師連艷老師鑒定為木蘭科厚樸屬植物厚樸M.officinalisRehd. et Wils.的干燥干皮；柳氮磺胺吡啶腸溶片，批號09220207，購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（批號20230512E19）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）試劑盒（批號20230512E11）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號20230505E03），均購自上海茁彩生物科技有限公司；Servicebio?ZO-1抗體，批號L14OC15，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Meilunbio?葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS），批號M0508D，購自大連美侖生物技術有限公司；聚山梨酯80，批號2018022801，購自成都市科龍化工試劑廠；Zenbio?Claudin-1 抗體，批號M11AP01，購自蘇州四正柏生物科技有限公司；無水乙醇（批號2023022401）、海藻酸鈉（批號2021123001）、丙三醇（批號2021110201）、聚乙二醇-400（批號 2022092901）、醋酸乙酯（批號2022033101）、正丁醇（批號2019120301），均購自成都市科隆化學品有限公司；蓖麻油聚氧乙烯醚-40（EL-40，批號109896007100）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（CO-40，批號109607008240），均購自山東優(yōu)素華工科技有限公司；細胞膜近紅外熒光探針（1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide，DiR），批號D4006，購自上海百賽生物技術股份有限公司；透明質酸鈉，批號S12034，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 動物

7～9 周齡雄性ICR 小鼠84 只，購自北京斯貝福生物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2019-0010，于成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心進行實驗。所有動物實驗遵循成都中醫(yī)藥大學實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

2 方法與結果

2.1 厚樸揮發(fā)油的制備

將厚樸按照前期研究[9]進行發(fā)汗處理，隨后將發(fā)汗厚樸打粉，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，大火煮沸后微火加熱至無揮發(fā)油產生為止，收集揮發(fā)油，密封后保存于4 ℃冰箱。

2.2 標準曲線的建立

以正己烷為空白參照[10]，于200～400 nm 進行紫外掃描，測定得到厚樸揮發(fā)油正己烷溶液于361 nm 處存在最大吸收，故選擇361 nm 作為厚樸揮發(fā)油紫外檢測波長。將厚樸揮發(fā)油溶液稀釋至標準系列質量濃度（48.24、24.12、12.06、6.03、3.02、1.51 mg/mL），以正己烷為空白，在厚樸揮發(fā)油最大吸收波長361 nm 處測定標準溶液的吸光度（A）值，以A值為縱坐標、厚樸揮發(fā)油質量濃度為橫坐標（C）繪制厚樸揮發(fā)油標準曲線，得回歸方程為A＝0.055 4C-0.013 1，R2＝0.999 1，結果表明厚樸揮發(fā)油在1.51～48.24 mg/mL 線性關系良好。

2.3 MN 的制備

2.3.1 厚樸揮發(fā)油在不同助乳化劑中溶解度的測定由于厚樸揮發(fā)油的溶解性較差，故以厚樸揮發(fā)油在不同輔料中的溶解度為前提篩選助乳化劑，比較溶解度的大小。取各輔料0.50 g 于2 mL 離心管中，分別加入過量厚樸揮發(fā)油，渦旋混勻5 min 后超聲4 h 助溶，靜置過夜后，5 000 r/min 離心10 min，取上清液用正己烷稀釋至適當質量濃度，在361 nm 處測定厚樸揮發(fā)油在各輔料中的平衡溶解度[11]。結果見表1，無水乙醇對揮發(fā)油的溶解能力較強，故選用無水乙醇做助乳化劑。

2.3.2 乳化劑的篩選 以無水乙醇為助乳化劑，厚樸揮發(fā)油為油相，乳化劑與助乳化劑的質量比（Km）為3∶1，分別以聚山梨酯80、CO-40、EL-40 為乳化劑，制備MN，繪制偽三元相圖。結果如圖1 所示，與聚山梨酯80 和CO-40 形成的乳區(qū)面積相比，EL-40 作為乳化劑時所形成的MN 區(qū)域面積更大，因此，選擇EL-40 作為乳化劑進行以下實驗。

圖1 乳化劑 (CO-40、EL-40、聚山梨酯80) 篩選的偽三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram for selection of emulsifier (CO-40, EL-40, polysorbate 80)

2.3.3 偽三元相圖的繪制及Km值的確定 根據(jù)“2.3.2”項乳化劑的試驗結果，將乳化劑EL-40 和助乳化劑無水乙醇按照Km分別為2∶1、3∶1、4∶1混合，再將該混合物（Smix）與厚樸揮發(fā)油以9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 的質量比配制成混合溶液，在磁力攪拌下加超純水滴定，觀察各溶液的顏色、乳光和澄明度，判斷臨界點，記錄體系由渾濁變澄清時的加水量，計算臨界點時各組分的比例。用OriginPro 8.5 軟件繪制偽三元相圖，圖中各臨界點連線下方的區(qū)域即為MN 區(qū)域，比較該區(qū)域面積大小，確定乳化劑與助乳化劑的質量比。結果如圖2 所示，Km值為3∶1 時，該體系形成的MN 面積最大，故確定EL-40 與無水乙醇的比例為3∶1。

圖2 Km 值篩選的偽三元相圖Fig.2 Pseudo-ternary phase diagram for selection of Km

2.3.4 MN 的制備 按照最優(yōu)Km值制備Smix，分別以Smix與油相比例為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 的質量比配制成混合溶液，使其總質量為1 g，于磁力攪拌下加超純水滴定，觀察不同比例的油相形成的MN 放置7 d 后乳液的形態(tài)，選取形成的乳液最穩(wěn)定、不出現(xiàn)分層的MN，記錄各組分的比例。結果見表2，Smix與厚樸揮發(fā)油的比例為8∶2 時，形成的乳液更加穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)分層、絮凝或粒徑增大的情況，最終確定MN的最佳處方為EL-40-無水乙醇-厚樸揮發(fā)油的質量比為6∶2∶2。

表2 Smix 與油相比例篩選結果Table 2 Ratio screening result of Smix and oil

2.4 MN 的質量評價

2.4.1 宏觀和微觀形態(tài)觀察 采用透射電子顯微鏡對MN 的微觀形態(tài)進行表征，取適量制備好的MN，用去離子水適當稀釋，滴在覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上，滴加質量分數(shù)為1%的磷鎢酸溶液進行負染2 min，用濾紙吸取多余的溶液，自然晾干后在透射電子顯微鏡下觀察納米乳液的形態(tài)。結果如圖3 所示，MN經透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，納米乳外觀澄清、透明、微泛藍光，符合納米乳的制劑特征。

圖3 納米乳的宏觀和微觀形態(tài)Fig.3 Macroscopic and microscopic morphology of nanoemulsion

2.4.2 粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）和ζ 電位 按優(yōu)化后處方制備MN 3 批，取0.1 mL MN 并稀釋100 倍，在室溫下使用納米粒度儀測量納米乳液的平均粒徑、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）以及ζ 電位。結果如圖4、5 所示，MN平均粒徑為（61.56±1.67）nm，PDI 為0.16±0.37，ζ 電位為（-21.37±0.45）mV，呈正態(tài)分布。

圖4 MN 的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of MN

圖5 MN 的ζ 電位分布Fig.5 ζ potential distribution of MN

2.4.3 pH 值及黏度 按最優(yōu)處方平行制備3 批MN，使用pH 計和旋轉黏度計于室溫條件下測定其pH 值，各平行3 次。測量結果表明，最優(yōu)處方MN的pH 值為6.07±0.07，黏度為（54.49±0.99）mPa·s。

2.4.4 包封率的測定 參照文獻方法[12]，測定了MN 中游離油和總油的含量，并根據(jù)以下方程計算納米乳的包封率。將2 mL MN 加入5 mL 正己烷中，振蕩1 min，靜置分層后取上層有機相，在361 nm 處測定其A值，所得值為游離油含量；取4 mL MN 在400 W 超聲破碎10 min，使其破乳，加入10 mL 正己烷后振蕩1 min，靜置分層，取上層有機相在361 nm 處測定其A值[13]，所得值為總油含量。將游離油含量和總油含量代入標準曲線，用公式計算得到MN 的包封率為（85.25±0.50）%。

包封率＝(總油量-游離油量)/總油量

2.5 MNG 的制備

2.5.1 成膠時間的測定 采用傾斜法測定成膠時間，海藻酸鈉和透明質酸溶液接觸后開始計時，然后傾斜西林瓶，觀察溶液的流動情況，待傾斜西林瓶時體系不再流動則停止計時，該時間即為成膠時間。

2.5.2 空白水凝膠基質的選擇 以成膠時間為評價指標，優(yōu)化水凝膠的處方比例。取透明質酸溶解在蒸餾水中，形成質量濃度為10、20、30 mg/mL 的均勻溶液；海藻酸鈉溶解在蒸餾水中，形成質量濃度為10、20、30、40 mg/mL 的均勻溶液。

將等體積的海藻酸鈉和透明質酸溶液混合均勻，并直至成膠。形成的空白水凝膠基質根據(jù)組成基質的初溶液質量濃度進行命名（例如20 mg/mL 的海藻酸鈉溶液和30 mg/mL 的透明質酸溶液形成的空白基質命名為S2H3），優(yōu)選最優(yōu)成膠比。各組水凝膠混合1 min 時的成膠狀態(tài)見圖6，可以發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉和透明質酸的質量濃度均對水凝膠的成膠狀態(tài)有顯著影響，隨著二者質量濃度的增大，1 min 時水凝膠越來越穩(wěn)定。

當海藻酸鈉質量濃度和透明質酸質量濃度均為10 mg/mL 時，無法形成穩(wěn)定的水凝膠。當海藻酸鈉質量濃度為10 mg/mL 時，隨著透明質酸的質量濃度由20 mg/mL 增大到40 mg/mL，成膠時間由301.67 s 縮短至216.17 s，水凝膠趨于穩(wěn)定。當海藻酸鈉質量濃度為30 mg/mL 時，隨著透明質酸的質量濃度由10 mg/mL 增大至40 mg/mL，成膠時間進一步由172.34 s 縮短至26.91 s，水凝膠趨于穩(wěn)定且在透明質酸質量濃度為40 mg/mL 時達到最佳水凝膠狀態(tài)。

2.5.3 載藥納米乳水凝膠的制備 取最優(yōu)比透明質酸和海藻酸鈉粉末用MN 溶解，并繼續(xù)攪拌15 min，即得MNG。

2.6 MNG 的質量評價

2.6.1 微觀形態(tài)特征 將凍干后的樣品進行噴金處理，通過光電聯(lián)用成像系統(tǒng)觀察其表面形態(tài)、支架結構。結果如圖7 所示，水凝膠的孔隙與孔隙之間相互貫通，結構整齊，形成的三維網(wǎng)格孔洞結構均勻分布。

圖7 掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron image

2.6.2 pH 值及黏度測定 按最優(yōu)處方平行制備3 批MNG，應用pH 計和旋轉黏度計于室溫條件下測定其pH 值，各平行3 次。測量結果表明，MNG 的pH值為6.07±0.07，黏度為（54 392.33±809.52）mPa·s。

2.6.3 體外模擬藥物釋放度測定 參考《中國藥典》2020 年版中的方法[14]配制人工模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）、人工模擬小腸液（simulated intestinal fluid，SIF）和人工模擬結腸液（simulated colonic fluid，SCF）來模擬人體消化。分別取MN和MNG 各1.0 g 置于透析袋中，放入SGF 中2 h，取出水洗后接著放入SIF 中消化4 h，最后放入SCF中42 h。前6 h 每隔0.5 h 取樣，后42 h 每隔1 h 取樣[15]，整個過程中溶液放置在37 ℃恒溫水浴鍋中并以100 r/min 振蕩，每次吸取5 mL 模擬液測定1次厚樸揮發(fā)油的含量，同時補足對應的新鮮模擬液5 mL。使用正己烷萃取厚樸揮發(fā)油并根據(jù)A值計算出厚樸揮發(fā)油的含量，計算釋放率（R），R的計算公式如下。

R＝Rt/Mi

Rt為厚樸揮發(fā)油在t時刻的累積釋放量，Mi為最開始加入的厚樸揮發(fā)油的原始質量

結果從圖8 中可得MN 和MNG 的最終累積釋放率分別為（89.83±0.50）%和（61.68±1.15）%，其結果表明，這2 種制劑最終釋放度有顯著性差異，MN 在SGF 消化過程中釋放較為明顯，累積釋放率為（34.32±0.89）%，MNG 在SGF 中釋放減少，累積釋放率為（19.37±1.39）%（0～2 h），其結果表明，這2 種制劑在0～2 h 釋放度有顯著性差異；MN 在SIF 消化過程中釋放率為（53.48±0.13）%，MNG 在SIF 中釋放較少，釋放率為（32.85±0.89）%（2～6 h），其結果表明，這2 種制劑在2～6 h 釋放度有顯著性差異；MN 在SCF 消化過程中釋放明顯，消化至24 h 釋放率為（89.05±0.20）%，而MNG在SCF 消化過程中呈緩慢逐漸釋放趨勢，至24 h 釋放率為（50.16±0.80）%，其結果表明，這2 種制劑在24 h 釋放度有顯著性差異。結果顯示，MN 在口服遞藥中易在胃和小腸中釋放，使其遞送至結腸部位時含量降低，而MNG 在胃和小腸內相對穩(wěn)定，可以減少揮發(fā)油受胃和小腸侵蝕，達到結腸靶向的作用。

圖8 體外緩釋累積釋放曲線Fig.8 Cumulative release curve of sustained release in vitro

2.6.4 小鼠活體生物分布評價 24 只ICR 小鼠通過在7 d 內自由飲用3% DSS 來誘導UC 小鼠模型，而后將其隨機分為MN 組、MNG 組、Free-DiR 組，每組8 只。制備含有相同質量濃度DiR 的各組制劑，使用酶標儀檢測其DiR 熒光含量，分別以DiR 0.5 mg/kg 的劑量給小鼠ig，小鼠分別在ig 給藥后4 個不同時間點（3、6、12、24 h），使用活體成像系統(tǒng)對小鼠進行成像，并在24 h 處死剩余全部小鼠，從體內分離結腸后立即檢測熒光。

結果如圖9 所示，給藥3 h 或6 h 后，各組熒光差異非常小。在12 h 時，MNG 組的結腸部位熒光強度最強，其次是MN 組和Free-DiR 組，這種狀態(tài)一直持續(xù)到24 h 結束，且在24 h 解剖小鼠后結腸中凝膠組的熒光強度依然很強，如圖10 所示。然而，MN 組和Free-DiR 組的熒光值趨勢非常相似，可能由于沒有凝膠外層保護的情況下而過早降解，繼而不能再體內凸顯納米乳凝膠的靶向作用。因此，小鼠全身熒光變化的結果突出了納米乳凝膠可以在口服遞送中保護揮發(fā)油減少胃和小腸侵蝕的優(yōu)勢。

圖9 活體生物分布圖Fig.9 Living organisms distribution maps

圖10 熒光結腸分布圖Fig.10 Fluorescent colon distribution maps

2.7 MNG 對UC 的治療作用

2.7.1 分組與造模 60 只小鼠適應性喂養(yǎng)7 d，稱定質量并標號，隨機分為空白組（10 只）以及造模組（50 只）?？瞻捉M給予自由飲用蒸餾水，造模組自由飲用配制的3% DSS 水溶液，飲用3 d，隔天更換新鮮DSS 溶液。在第3 天造模結束后，根據(jù)疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分對模型進行評價，DAI 評分＞1 分為造模成功[16]。50 只小鼠均造模成功，再將其隨機分為模型組、柳氮磺吡啶組、空白揮發(fā)油組、MN 組、MNG 組，每組10只，繼續(xù)給予3% DSS 水溶液自由飲用4 d。

2.7.2 藥物處理 依據(jù)《中國藥典》2020 年版[14]，規(guī)定厚樸飲片用量為3～10 g，以成人體質量70 kg 用藥劑量為10 g 計，參照《中藥藥理研究方法學》[17]，結合厚樸揮發(fā)油得率（約為0.25%），根據(jù)預試驗結果，按照厚樸揮發(fā)油最高給藥劑量為26 mg/kg，使制得的MN、MNG 中發(fā)汗厚樸揮發(fā)油的含藥量為26 mg/kg，從造模第3 天開始，分別給予小鼠ig，柳氮磺吡啶組ig 給予柳氮磺吡啶混懸液（200 mg/kg），空白組和模型組ig 給予等體積的蒸餾水，所有小鼠ig 體積均為10 mL/kg，每天1 次，連續(xù)給藥7 d，每天早晨觀察小鼠一般情況，記錄DAI 評分。

2.7.3 標本制備與采集 第9 天完成給藥，第10 天脫頸處死小鼠，再將小鼠的結腸從腹腔中完整取出，測量結腸長度拍照后取出腸內容物，稱取結腸質量，注意不要將結腸弄破，將其分為兩端段，一段用冰PBS 漂洗后用錫箔紙包裹，凍存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于Elisa 實驗；另一段置于4%多聚甲醛溶液中固定，常溫放置，用于結腸組織HE 染色和免疫熒光實驗。

2.7.4 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，各組間比較采用單因素方差分析比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.7.5 小鼠的糞便性狀、便血情況及DAI 評分的影響 自實驗第1 天起，每天于相同時間段內，觀察記錄小鼠的體質量、腹瀉、便血、活動狀態(tài)和死亡情況。結腸炎小鼠的疾病活動指數(shù)評分標準見表3。

表3 DSS 小鼠DAI 評分標準Table 3 DAI scoring standard of DSS mice

DAI＝(體質量丟失評分＋腹瀉評分＋便血評分)/3

結果如圖11 顯示，在第10 天治療結束時，空白組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)有光澤，大便正常，肛門無出血。與空白組相比，模型組小鼠DAI 評分明顯升高（P＜0.001），精神萎靡，食欲減退，毛發(fā)暗淡，出現(xiàn)腹瀉、血便。與模型組相比，柳氮磺吡啶組的小鼠DAI 評分顯著降低（P＜0.001），MNG組的小鼠DAI 評分明顯降低（P＜0.01），小鼠精神狀態(tài)良好，食欲有增加，毛發(fā)更有光澤，腹瀉及血便情況好轉。結果表明，相比于空白揮發(fā)油及MN組，MNG 具有更好的治療效果，藥效更佳。

圖11 DAI 評分的影響 (±s, n = 10)Fig.11 Effect on DAI score (±s, n = 10)

2.7.6 對小鼠結腸長度、結腸單位長度質量和脾臟系數(shù)的影響 末次給藥后處死小鼠，取小鼠結腸和脾臟。直尺測量結腸自然長度，并拍照。濾紙吸干結腸及脾臟外表面血液，稱量并記錄小鼠結腸及脾臟質量。

脾臟系數(shù)＝小鼠脾臟質量/小鼠體質量

結腸單位長度質量＝結腸質量/結腸長度

結果如圖12 和表4 顯示，與正常組相比，模型組小鼠結腸長度顯著縮短（P＜0.001），脾臟系數(shù)和單位長度結腸質量顯著升高（P＜0.001）。與模型組比較，柳氮磺吡啶組及MNG 組的小鼠結腸長度顯著增加（P＜0.01、0.001）；MNG 組及柳氮磺吡啶組脾臟系數(shù)顯著降低（P＜0.001），MN 組及空白揮發(fā)油組脾臟系數(shù)明顯降低（P＜0.05、0.01）；柳氮磺吡啶及MNG組單位結腸質量系數(shù)顯著降低（P＜0.01、0.001）。結果表明，相比于空白揮發(fā)油及MN 組，MNG 組具有更好的治療效果，藥效更佳。

圖12 對結腸長度的影響Fig.12 Effect on colon length

表4 對結腸長度、結腸單位長度質量和脾臟指數(shù)的影響(±s, n = 10)Table 4 Effect on colon length, colon unit length weight and spleen index (±s, n = 10)

表4 對結腸長度、結腸單位長度質量和脾臟指數(shù)的影響(±s, n = 10)Table 4 Effect on colon length, colon unit length weight and spleen index (±s, n = 10)

與空白組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01***P＜0.001；表5 同。###P ＜ 0.001 vs blank group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs model group; same as table 5.

組別 脾臟系數(shù) 結腸長度/cm 結腸單位長度質量/(μg·cm-1)空白 3.02±0.67 8.33±0.44 26.65±5.78模型 7.04±0.70### 5.69±1.00### 43.12±2.10###空白揮發(fā)油 5.76±1.05* 6.22±0.90 38.71±2.10 MN 5.49±0.83** 6.32±0.90 38.13±4.38 MNG 3.98±0.98*** 6.95±0.38** 33.06±5.44**陽性 3.85±0.55*** 7.45±0.91*** 30.90±4.91***

2.7.7 HE 染色觀察小鼠結腸黏膜病理變化 取多聚甲醛固定的結腸組織，經脫水、石蠟包埋和組織切片后，HE 染色。光學顯微鏡下觀察小鼠結腸組織結構、黏膜、杯狀細胞、絨毛排列和炎性細胞浸潤等形態(tài)表現(xiàn)并拍照。結果如圖13 顯示，空白組小鼠腸道組織細胞飽滿且排列整齊，黏膜完整，杯狀細胞明顯，腺體排列規(guī)則，隱窩結構清晰可見。與空白組相比，模型組小鼠腸道組織細胞出現(xiàn)上皮細胞破損且排列紊亂，腸道黏膜受損，腺體排列紊亂，隱窩有不同程度的損壞，存在有大量的炎性細胞浸潤現(xiàn)象。與模型組相比，各給藥組小鼠的結腸黏膜受損情況有所改善，炎性細胞浸潤減少，腺體排列規(guī)則，杯狀細胞明顯增多，隱窩結構恢復，且MNG組恢復情況優(yōu)于空白揮發(fā)油及MN 組。

圖13 對小鼠結腸組織病理的影響 (HE 染色)Fig.13 Effect on colon histopathology of mice (HE staining)

2.7.8 對小鼠結腸組織中炎癥因子水平的影響取各組小鼠結腸組織，稱定質量，加適量PBS，勻漿，離心，收集上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測IL-6、IL-10、TNF-α 水平。結果表5 顯示，與空白組比較，模型組小鼠結腸組織中的TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.001），IL-10 的水平顯著降低（P＜0.001）。與模型組比較，柳氮磺吡啶組及MNG 組小鼠結腸組織中的TNF-α、IL-6 水平顯著降低（P＜0.001），IL-10 水平明顯升高（P＜0.05、0.01）；MN 組TNF-α、IL-6 水平明顯降低（P＜0.01）。結果表明，MNG 可有效抑制促炎因子分泌、增強抗炎因子的分泌來抑制腸道炎癥。

表5 各組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10 含量(±s, n = 10)Table 5 Contents of TNF-α, IL-6 and IL-10 in colon tissue of mice in each group (±s, n = 10)

表5 各組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10 含量(±s, n = 10)Table 5 Contents of TNF-α, IL-6 and IL-10 in colon tissue of mice in each group (±s, n = 10)

組別 IL-6/(pg·mL-1) IL-10/(pg·mL-1) TNF-α/(pg·mL-1)空白 19.84±1.76 67.89±6.85 87.44±8.04模型 30.71±3.40### 44.85±10.09### 127.59±20.14###空白揮發(fā)油 28.90±4.00 52.01±5.25 113.65±13.50 MN 26.05±2.30** 53.76±9.87 103.07±9.73**MNG 22.86±2.04*** 57.64±8.13* 100.07±10.68***陽性 22.37±2.05*** 59.67±8.71** 100.98±10.68***

2.7.9 免疫熒光法觀察小鼠結腸組織中claudin-1 和ZO-1 蛋白的表達 取結腸組織石蠟切片脫蠟至水；檸檬酸鹽緩沖液80 ℃修復抗原20 min，PBS 沖洗5 min×3；滴加山羊血清室溫封閉20 min，PBS 沖洗5 min×3；滴加一抗claudin-1 和ZO-1，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS 沖洗5 min×3，滴加對應二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗5 min×3；滴加DAPI室溫孵育10 min，PBS 沖洗5 min×3 后，使用抗熒光衰減封片劑進行封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

結果如圖14 顯示，空白組小鼠結腸組織中claudin-1 和ZO-1 蛋白在結腸黏膜呈連續(xù)性高表達，充滿整個視野，模型組小鼠組織中claudin-1 和ZO-1 蛋白在結腸黏膜的表達呈間斷性，熒光強度明顯下降；與模型組相比，空白揮發(fā)油組和MN 組小鼠結腸組織緊密連接蛋白claudin-1 和ZO-1 表達范圍增加，但熒光強度較弱，MNG 組和陽性組小鼠結腸組織緊密連接蛋白claudin-1 和ZO-1 在結腸熒光強度明顯增加，熒光較強。結果表明，MNG 可以提高claudin-1、ZO-1 緊密連接蛋白的表達改善結腸黏膜屏障損傷。

圖14 各組中claudin-1 和ZO-1 蛋白表達Fig.14 Expression of claudin-1 and ZO-1 proteins in each group

3 討論

厚樸主要化學成分包括生物堿類、木脂素類、揮發(fā)油等，現(xiàn)代藥理學研究表明厚樸揮發(fā)油具有明顯的抗炎[18]、抗氧化[19]、抗菌[20]等生物活性，具有廣闊的應用前景。但厚樸揮發(fā)油理化性質不穩(wěn)定，遇光、氧氣、高溫會發(fā)生活性成分的降解、揮發(fā)現(xiàn)象，這與其所含主要活性成分倍半萜、萜烯及含氧衍生物[21]等有關。與此同時，口服遞送厚樸揮發(fā)油受胃腸道pH 值、首過效應及在腸道代謝的影響，會降低其療效，因此，如何提高厚樸揮發(fā)油穩(wěn)定性并將其有效遞送到炎癥部位，成為利用厚樸揮發(fā)油治療UC 亟待解決的關鍵問題。為改善揮發(fā)油理化性質穩(wěn)定性差、易降解的問題，本實驗將揮發(fā)油制成納米乳，增加其穩(wěn)定性和溶解度，外層用海藻酸鈉和透明質酸制備了一層水凝膠，調控藥物在結腸釋放。透明質酸[22]是一種表面帶負電荷的理想的結腸靶向藥物遞送材料，它可以通過靜電吸附粘附在炎癥粘膜上，提高納米乳的黏附性，增強藥物在結腸中的滯留；同時，海藻酸鈉[23]是一種對酸敏感的天然多糖材料，可以將更多的藥物遞送到結腸部位，大大提高藥物的生物利用度，實現(xiàn)局部、持續(xù)的藥物釋放作用。

在體外模擬胃腸道pH 值環(huán)境的藥物釋放結果表明，外層水凝膠的包裹能有效減少在胃和小腸的藥物突釋，并在結腸下持續(xù)釋放藥物。小動物活體成像實驗證明了MNG 具有結腸靶向的趨勢，提示外層水凝膠可以保護藥物過早釋放，并達到藥物緩釋作用。藥效學等結果表明，MNG 能調節(jié)炎癥因子的分泌，提高claudin-1、ZO-1 緊密連接蛋白的表達改善結腸黏膜屏障損傷。

綜上，本實驗制備的MNG 不僅制備簡單、工藝成熟，解決厚樸揮發(fā)油易揮發(fā)、穩(wěn)定性差的制劑難題的同時，可以增強了藥物在胃腸道穩(wěn)定性，實現(xiàn)結腸靶向釋放，其緩釋作用可使藥物延長治療結腸黏膜炎癥的時間，因而賦予MNG 具有緩釋與靶向的雙重功能，為厚樸揮發(fā)油綜合開發(fā)利用和抗UC 新藥的開發(fā)提供解決候選方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突