基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術(shù)的腎康注射液在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定及代謝途徑分析

楊彥濤 ，李卓倫 ，周 霖 ，康 建 ，程 旭，孫 志 *

1. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院 藥學部，河南 鄭州 450052

2. 河南省精準醫(yī)學臨床質(zhì)譜工程研究中心，河南 鄭州 450052

3. 復旦大學藥學院，上海 201203

腎康注射液（Shenkang Injection，SKI）是由丹參、大黃、紅花、黃芪4 味中藥提取加工制成的中藥復方，具有降逆泄?jié)帷⒁鏆饣钛屯ǜ估麧竦裙π?，臨床應用已20 余年，療效顯著且應用廣泛。研究表明，腎康注射液在治療糖尿病腎病方面，可顯著改善多項腎功能指標，如降低尿白蛋白排泄率、24 h 尿蛋白、血肌酐和尿素氮等，從而減輕糖尿病對腎臟的損傷作用，提高腎功能[1]。慢性腎功能衰竭是由各種病因引起腎臟損害和進行性加重的結(jié)果，腎康注射液可使該病患者內(nèi)生肌酐清除率升高，降低血肌酐，有效率達73.05%[2]。在造影劑腎病防治方面，腎康注射液亦表現(xiàn)出良好的改善腎功能指標的作用，大大減少了造影劑腎病的發(fā)生[3]。研究表明SKI 治療糖尿病腎病的機制可能與減輕高糖誘導的腎小管細胞衰老和腎小管間質(zhì)損傷、抑制腎系膜細胞增殖和誘導細胞凋亡有關(guān)[4-6]。然而，目前關(guān)于SKI 體內(nèi)代謝物的研究尚不系統(tǒng)全面[7]，這限制了SKI 的藥理學、毒理學和作用機制的進一步研究。因此亟需一種具有高通量、高分辨率和高靈敏度且能準確鑒定其在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物的方法，以對SKI 進行進一步的分析探索。

超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）具有高通量、高分辨率和高靈敏度的特點，可用于快速準確鑒定中藥藥效成分在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物；其可在一個分析周期內(nèi)獲得大量高精度的一級、二級質(zhì)譜信息，為人體內(nèi)微量乃至痕量的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的確定提供了客觀可靠的數(shù)據(jù)支持。Compound Discoverer（CD）代謝平臺是一種基于LC-MS 獲得代謝物檢測數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，其可通過對樣本組和對照組進行差異性分析，結(jié)合對待測物質(zhì)色譜質(zhì)譜峰的數(shù)據(jù)分析，篩選出樣品組中存在而對照組中不存在的化合物，并提示可能的生物轉(zhuǎn)化途徑[8-10]。

在本課題組前期研究中，SKI 中共鑒定出90 種化學成分，主要化學結(jié)構(gòu)類型為酚酸類、黃酮類和蒽醌類等[11]。隨后，又研究了SKI 在大鼠體內(nèi)的組織分布和藥動力學[12]。為了鑒定SKI 在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 和CD平臺，提出了“提取-化合物篩選-鑒定-驗證”的大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定策略，最終從iv SKI 后的大鼠血漿、尿液和糞便中篩選出并鑒定了92 種代謝產(chǎn)物，明確了SKI 在大鼠體內(nèi)的代謝譜，為針對SKI進一步的藥物研究奠定了堅實的理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Ultimate 3000 UHPLC（美國Dionex 公司）；Q Exactive HRMS（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Xcalibur 3.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Finnigan 公司）。

腎康注射液（批號202109111）由西安世紀盛康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。對照品沒食子酸（批號MUST-18032801）、丹參素（批號MUST-18060920）、咖啡酸（批號MUST-19032003）、原兒茶酸（批號MUST-16032102 ）、 5- 羥甲基糠醛（ 批號MUST-16031202）、羥基紅花黃色素 A（批號MUST-16070508）、阿魏酸（批號MUST-19032928）和芹菜素（批號MUST-16061301）均購自成都Must生物技術(shù)有限公司；對照品大黃酸（批號wkq16062204）購自成都維可奇生物技術(shù)有限公司。所有對照品經(jīng)HPLC-UV 檢測質(zhì)量分數(shù)均大于98%。甲醇和乙腈為高效液相色譜級，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。HPLC 級甲酸購自阿拉丁工業(yè)有限公司。

雄性SD 大鼠（180～220 g）12 只購自鄭州大學動物實驗中心，合格證號SCXK（豫）2021-0002。所有動物實驗操作經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準（倫理審批號2023-KY-0543）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），體積流量0.2 mL/min；梯度洗脫： 0～3 min，5% B；3～16 min，5%～15% B；16～20 min，15%～22% B；20～26 min，22%～55%B；26～30 min，55%～100% B；30～35 min，100%B；35～36 min，100%～5% B；36～40 min，5% B。進樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀采用加熱電噴霧離子源（HESI）。離子傳輸管溫度320 ℃，輔助氣體積流量為10 μL/min。正離子模式下：噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣體積流量為40 μL/min。負離子模式下：噴霧電壓為-2.8 kV，鞘氣體積流量為38 μL/min。全掃描質(zhì)量范圍m/z80～1 200。碰撞能梯度為20、40、60 eV。

2.3 動物飼養(yǎng)和給藥

將SD 大鼠隨機分為給藥組和對照組，每組6只。隨后將各組再進一步隨機均分為采血組（3 只）和收集尿液及糞便組（3 只），這些大鼠均飼養(yǎng)在光照/黑暗周期為12 h 的動物房內(nèi)，溫度25 ℃，相對濕度在60%左右，飼養(yǎng)1 周。在這1 周內(nèi)，大鼠喂養(yǎng)標準飼料和水。給藥前，在代謝籠中的大鼠被禁食12 h，只自由飲水[13]。給藥組大鼠注射劑量為9 mL/kg（相當于臨床劑量的6.3 倍），使用前SKI 先濃縮，濃度提高5 倍，經(jīng)尾iv 給予大鼠。對照組大鼠同樣方法注射生理鹽水[14]。

2.4 生物樣本采集和預處理

2.4.1 血漿樣本 采血組大鼠，ip 10%水合氯醛水溶液（0.2 mL/100 g）進行麻醉。分別于尾iv SKI或生理鹽水后0.5、1、2、4、8、12、24 h 從大鼠眼眶靜脈中采集血液各0.3 mL，置于肝素鈉抗凝EP管中，在4 ℃下以1.3×104r/min 離心10 min，取上清液。最后將各時間點血漿上清液混合在一起，取2 mL 與8 mL 甲醇混合，渦旋、離心、干燥。用200 μL 50%甲醇-水再溶解殘余物，制備成供試液。

2.4.2 尿液和糞便樣本 收集尿液和糞便組大鼠在代謝籠內(nèi)尾iv SKI或生理鹽水后24 h的尿液和糞便樣本。尿液樣本濾過后，在4 ℃下以1.3×104r/min 離心10 min。取2 mL 上清液與8 mL 甲醇混合，渦旋、離心。室溫下氮氣干燥上清液。用200 μL 50%甲醇-水將殘余物再溶解。另外，取1 g 干燥后的糞便樣品，加入10 mL 甲醇，超聲處理30 min后濾過。然后渦旋、離心。上清液干燥。用200 μL 50%甲醇-水復溶，制備成供試液。所有供試液在進樣前均用0.22 μm 微孔濾膜濾過[15]。

2.5 對照品溶液的制備

取對照品沒食子酸、丹參素、咖啡酸、原兒茶酸、5-羥甲基糠醛、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、芹菜素、大黃酸各1.0 mg，精密稱定后，分別置于10 mL 量瓶中，加入50%甲醇-水溶解并稀釋至刻度，搖勻，最終制備成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的對照品儲備液；分別精密量取上述對照品儲備液適量，將其混合后加入50%甲醇-水稀釋，最終制備成各對照品質(zhì)量濃度均為1 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Xcalibur 3.0 軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，包括總離子流圖、提取離子流圖、MS2質(zhì)譜圖、碎片離子和元素組成，質(zhì)量誤差均在5×10-6以內(nèi)。大鼠靜脈注射SKI 后，各生物樣本的總離子流圖見圖1。將Q Exactive HRMS 獲取的原始數(shù)據(jù)文件導入Compound Discoverer 2.1（CD）軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）進行代謝物的篩選鑒定。選擇“Metabolism w Statistics Expected w Fish Scoring and Unknown w Pattern and Compound Class Scoring”處理流程，根據(jù)導入的原型化合物結(jié)構(gòu)和所選的代謝反應類型，系統(tǒng)自動篩選出潛在的代謝物。主要參數(shù)：最大位移0.2 min，質(zhì)量誤差5×10-6，最小質(zhì)量150，最小峰強度1×105。峰面積的比值（給藥組/對照組）設(shè)置為大于5。

圖1 大鼠iv SKI 后各生物樣本的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms (TICs) of bio-samples after intravenous administration of SKI in rats

2.7 大鼠體內(nèi)代謝物的鑒定策略

為了系統(tǒng)分析SKI 在大鼠體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化和代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定，提出了“提取-化合物篩選-鑒定-驗證”的大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定策略，如圖2 所示。第一步，根據(jù)文獻檢索信息和標準品質(zhì)譜數(shù)據(jù)建立化合物數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫不僅包含SKI 中的已知化學成分，還包含文獻報道的部分化合物的已知代謝物，包括化合物名稱、分子式、相對分子質(zhì)量、化學結(jié)構(gòu)和特征碎片離子等信息[16]。

圖2 大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定策略Fig.2 Identification strategy of metabolites in rats

第二步，原型化合物的體內(nèi)鑒定。依據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫，利用Xcalibur 軟件從生物樣本的色譜圖中提取原型化合物，然后根據(jù)精確相對分子質(zhì)量、分子式和特征碎片離子進行確認。

第三步，已知代謝物的鑒定。這些代謝物是文獻已經(jīng)報道的，來源于SKI 中某一味草藥或某一種活性成分的體內(nèi)代謝研究。同樣，用Xcalibur 軟件從生物樣本的色譜圖中提取已知代謝物，然后根據(jù)精確相對分子質(zhì)量、分子式和特征碎片離子進行確認。

第四步，未知代謝物的鑒定。通過Compound Discoverer 2.1 和Mass Frontier 7.0 軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）對未知代謝物進行篩選和鑒定。將給藥組、對照組和空白溶劑組的原始數(shù)據(jù)文件導入CD 軟件。空白溶劑組用于去除背景和噪聲。另外，導入SKI 中35 個代表性活性成分的化學結(jié)構(gòu)，選擇15 種I相代謝反應和19 種Ⅱ相代謝反應。設(shè)定好參數(shù)運行，系統(tǒng)篩選出較多潛在代謝物。然后，根據(jù)原型化合物結(jié)構(gòu)、代謝反應、中性損失和特征碎片離子，推測潛在代謝物的結(jié)構(gòu)。將該化學結(jié)構(gòu)導入Mass Frontier 7.0 軟件，可以自動生成理論的碎片離子和二級質(zhì)譜圖。隨后將該二級質(zhì)譜圖與CD 篩選出的潛在代謝物的二級質(zhì)譜圖進行匹配。根據(jù)匹配結(jié)果驗證推測的代謝物結(jié)構(gòu)是否正確。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體內(nèi)SKI 原型化合物的鑒定

大鼠iv SKI 后，在其血漿、尿液和糞便中共檢測到29 種原型成分。通過與標準品和文獻數(shù)據(jù)的比較，確定了原型的化學結(jié)構(gòu)。其中包括17 種酚酸類、5 種蒽醌類、3 種黃酮類、壬二酸、5-羥甲基糠醛、蓮花掌苷和羥基紅花黃色素A。原型化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表1 所示。

表1 大鼠iv SKI 后血漿、尿液和糞便中的原型化合物Table 1 Prototype compounds in rat plasma, urine and feces after intravenous administration of SKI

3.1.1 酚酸類 P3 的母離子m/z169.01 和特征碎片離子m/z125.02、m/z97.03 與沒食子酸一致，P3 為沒食子酸。P2 具有與P3 相同的母離子和碎片離子，是沒食子酸的異構(gòu)體。P1、P4、P5、P8 具有相同的母離子m/z331.07，比沒食子酸高162（C6H10O5），且具有相同的特征碎片離子m/z169.01 和m/z125.02。另外，僅P1 和P4 具有碎片離子m/z271.04和m/z211.02。因此，P5 和P8 鑒定為沒食子酸-4-O-葡萄糖苷和沒食子酸-3-O-葡萄糖苷[11]，P1 和P4 為沒食子?；?葡萄糖或其異構(gòu)體[17]。P13 的母離子比沒食子酸的母離子高14（CH2），碎片離子m/z168.01和124.02 是母離子連續(xù)丟失CH3和CO2。因此，P13被認為是沒食子酸甲酯[11]。P10 和P16 顯示出與原兒茶酸（P9）相同的母離子和碎片離子，被鑒定為原兒茶酸的異構(gòu)體。P11 母離子m/z167.03 和碎片離子m/z152.01、123.04、108.02 與香草酸均一致，P11 為香草酸[11,18]。P7 的分子離子比丹參素（P6）小18（H2O），碎片離子m/z135.04 和107.05 是從母離子連續(xù)丟失CO2和CO 產(chǎn)生，經(jīng)鑒定P7 為咖啡酸。而P18 的母離子比P7 高14（CH2），鑒定為阿魏酸。P15 顯示出與阿魏酸相同的母離子和碎片離子，鑒定為異阿魏酸[11,19]。P21 的碎片離子m/z373.09、237.04、197.04、175.04、135.04 與文獻報道的丹酚酸D 相同，P21 為丹酚酸D[18]。

3.1.2 蒽醌類 P25 的母離子比蘆薈大黃素高162（C6H10O5），碎片離子一致，鑒定為蘆薈大黃素-O-葡萄糖苷[11]。同理，P20 經(jīng)鑒定為大黃酸-8-O-葡萄糖苷。P27 的母離子比大黃素高16（O），考慮為ω-羥基大黃素[20]。P28 的母離子比大黃酸（P29）高14（CH2），鑒定為6-甲基大黃酸[17]。

3.1.3 黃酮類 由于黃酮類化合物的特殊碎裂模式，黃酮類特征碎裂離子的命名參考了Zhang 等[21]的研究。P26 的母離子和主要碎片離子均與芹菜素相同，鑒定為芹菜素。P23 的開環(huán)碎片離子m/z135.01、133.03 和117.03 分別對應 [M-H-C8H6O,1,3A]-、[M-H-C7H4O2, 0,3B]-和[M-H-C7H4O3,1,3B]-，通過與文獻比較，P23 被鑒定為大豆苷元[21-22]。P24 顯示 [M＋H]+為m/z285.08，碎片離子m/z270.05、242.06 和214.06 是從母離子依次中性損失CH3、CO 和CO 所得。開環(huán)碎片離子m/z137.02、134.04 和121.03 分別對應 [M＋H-C9H8O2,1,3A]+、[M＋H-CH3-C7H4O3, 1,3B]+和 [M＋HC9H8O3, 0,3A]+。根據(jù)以上質(zhì)譜信息和文獻數(shù)據(jù)，P24被明確地定性為毛蕊異黃酮[11,21]。

3.1.4 其他 經(jīng)與對照品的母離子和碎片離子比較，P12 和P14 分別被明確鑒定為5-羥甲基糠醛和羥基紅花黃色素A。P19 的二級碎片離子m/z169.01和125.02 與沒食子酸的特征碎片離子一致，經(jīng)鑒定P19 為蓮花掌苷。P22 的碎片離子m/z169.09、125.10和97.06 從母離子先后丟失H2O、CO2和C2H4，可鑒定為壬二酸[11]。

3.2 大鼠體內(nèi)SKI 代謝產(chǎn)物的鑒定

基于本課題組提出的大鼠體內(nèi)SKI 代謝產(chǎn)物的鑒定策略，共篩選并鑒定了92 種代謝產(chǎn)物。對其中39 種已知代謝產(chǎn)物進行了提取和確認。又利用CD代謝平臺，導入SKI 中35 種代表性活性成分的化學結(jié)構(gòu)為母化合物，設(shè)置15 種I 相代謝反應和19種II 相代謝反應，篩選并鑒定了53 種未知代謝產(chǎn)物。所有代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表2 所示。

表2 大鼠iv SKI 后血漿、尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物Table 2 Metabolites in rat plasma, urine and feces after intravenous administration of SKI

3.2.1 酚酸類代謝物 大鼠靜脈注射SKI 后，檢測到15 種沒食子酸（P3）代謝物。其代謝途徑如圖3所示。M8 的母離子比沒食子酸大80（SO3），兩者的特征碎片離子m/z169.01 和125.02 相同。因此，M8 是沒食子酸的硫酸化產(chǎn)物，鑒定為沒食子酸-O-硫酸酯。M17 的母離子比M8 高14（CH2），M17的碎片離子m/z183.03 和139.00 也比M8 的碎片離子m/z169.01 和125.02 高14，因此，M17 是沒食子酸經(jīng)過甲基化和硫酸化后的代謝產(chǎn)物。同樣，M14、M18、M23 也是M17 的甲基化產(chǎn)物，它們被鑒定為二甲基-沒食子酸-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。M42 的碎片離子m/z125.02 是由母離子連續(xù)丟失C2H3ON 和CO2產(chǎn)生，它也是沒食子酸的特征碎片離子；另一個碎片離子m/z151.00 是由母離子損失C2H5O2N（甘氨酸）產(chǎn)生的，這表明化合物與甘氨酸進行了結(jié)合。M42 被初步鑒定為沒食子酸-甘氨酸結(jié)合物。M27 的母離子m/z125.02 比沒食子酸少44（CO2），碎片離子m/z125.02、97.03 和69.03 均與沒食子酸的特征碎片離子一致。M27 是沒食子酸脫羧基代謝產(chǎn)物，鑒定為鄰苯三酚[17]。M1 和M19是具有相同分子式和碎片離子的同分異構(gòu)體，母離子比M27 高80（SO3），結(jié)合特征碎片離子m/z125.02、97.03 和69.03，認為M1 和M19 是鄰苯三酚的硫酸化產(chǎn)物。M4 和M10 的母離子比M1 高14（CH2），特征碎片離子分別為m/z203.97 [M-HCH3]-、139.04 [M-H-SO3]-和124.02 [M-HSO3-CH3]-。結(jié)果表明，M4 和M10 是由鄰苯三酚通過甲基化和硫酸化生成的。同一分析方法，M12和M16 被確認為鄰苯三酚經(jīng)過硫酸化和二甲基化的代謝物。M7 的母離子比鄰苯三酚高 176（C6H8O6），為鄰苯三酚的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。M11的母離子m/z329.09 比鄰苯三酚大204，對應的是加入了C6H8O6和2CH2。初步鑒定M11 為二甲基-鄰苯三酚-O-葡萄糖醛酸。

圖3 沒食子酸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathway of gallic acid in rats

大鼠iv SKI 后，檢測到原兒茶酸（P9）的12種代謝產(chǎn)物。代謝途徑如圖4 所示。M2 的母離子比原兒茶酸高80（SO3），碎片離子相同，可表征為原兒茶酸-O-硫酸酯。M35、M48、M71 的母離子比原兒茶酸少16（O），碎片離子m/z93.03 和65.04是母離子連續(xù)損失CO2和CO 產(chǎn)生。M35、M48、M71 被鑒定為脫羥基-原兒茶酸或其異構(gòu)體。M13和M26 為M35 的硫酸化產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為脫羥基-原兒茶酸-O-硫酸酯或其異構(gòu)體[23]。同樣，M31 經(jīng)鑒定為脫羥基-原兒茶酸-O-葡萄糖醛酸。M41 和M52 的母離子m/z151.04 和碎片離子m/z123.04、107.05 均比M35 高14（CH2），鑒定為脫羥基-甲基-原兒茶酸。M20 的碎片離子m/z121.03 [M＋HC2H5NO2]+和93.03 [M＋H-C2H5NO2-CO]+顯示其為甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物，且M20 和M35 相同的碎片離子m/z93.03 為羥基苯離子，因此，M20 被初步鑒定為脫羥基-原兒茶酸-甘氨酸結(jié)合物，結(jié)合部位發(fā)生在甘氨酸的氨基。此外，M30 和M50 可能是M20 經(jīng)過甲基化反應的產(chǎn)物，亦可能是M41 與甘氨酸結(jié)合的產(chǎn)物。

圖4 原兒茶酸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.4 Metabolic pathway of protocatechuic acid in rats

M33 的母離子和碎片離子均比香草酸大14（CH2），M33 是香草酸的甲基化產(chǎn)物。M25、M29、M34 的準分子離子 [M-H]-（m/z261.01）比M33高80（SO3），碎片離子相同，它們是由M33 硫酸化產(chǎn)生的，經(jīng)鑒定為甲基-香草酸-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。同樣，M3 和M24 被鑒定為香草酸-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。

大鼠iv SKI 后，檢測到丹參素（P6）的19 種代謝物，代謝途徑如圖5 所示。M39 的碎片離子m/z193.05、178.03 和134.04 是從母離子連續(xù)丟失H2O、CH3和CO2產(chǎn)生，均比丹參素高14（CH2），M39 被認為是丹參素的甲基化產(chǎn)物[19]。由于碎片離子相同且分子式多SO3，M22 是M39 的硫酸化產(chǎn)物，被鑒定為甲基-丹參素-O-硫酸酯。M5、M9 也是丹參素的硫酸化產(chǎn)物[24]。M45 顯示其特征碎片離子為m/z181.04 [M-H-CH2OCO]-和179.04 [MH-CH3COOH]-，且其母離子比丹參素高 42（C2H2O），因此，M45 是丹參素的乙?；a(chǎn)物[18]。M28 的特征碎片離子為m/z135.04 [M-HHCOOH]-和109.03 [M-H-HCOOH-C2H2]-，其母離子比丹參素少16（O），這表明M28 是脫羥基化產(chǎn)物，且脫羥基位置發(fā)生在羧基的α-C。M15 的母離子比M28 高176（C6H8O6），為葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為脫羥基-丹參素-O-葡萄糖醛酸。由于O 的減少和CH2的加入，M36 的母離子比丹參素小 2，其特征碎片離子m/z151.08 [M＋HHCOOH]+、137.06 [M＋H-CH3COOH]+和123.04[M＋H-CH3COOH-CH2]+表明對應的基團變化是去羥基化和甲基化，M36 可鑒定為脫羥基-甲基-丹參素。同時，M40、M44 又是M36 的硫酸化產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為脫羥基-甲基-丹參素-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。M79 的特征碎片離子為m/z120.06 [M-HCO2-CH3COO]-，其母離子比M28 高42（C2H2O），因此，M79 為乙?；a(chǎn)物，初步鑒定為脫羥基-乙?；?丹參素。M85 為M79 的甲基化產(chǎn)物，初步鑒定為脫羥基-甲基-乙?；?丹參素。依據(jù)文獻報道[24]，M57、M60 作為已知代謝物被提取驗證，結(jié)果表明，M57、M60 是丹參素的脫二羥基產(chǎn)物。另外，M38、M46 是M57、M60 的硫酸化產(chǎn)物，鑒定為脫二羥基-丹參素-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。由于減少2O 和增加2CH2，M86 的母離子比丹參素少4，M86 可能是丹參素的脫二羥基和二甲基化產(chǎn)物。M56、M66 的母離子比M86 高14（CH2），初步鑒定為脫二羥基-三甲基-丹參素或其異構(gòu)體。

圖5 丹參素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.5 Metabolic pathway of danshensu in rats

M6 和M32 的碎片離子與咖啡酸相同，但母離子比咖啡酸高80（SO3），M6 和M32 是咖啡酸的硫酸化代謝產(chǎn)物。M51 的碎片離子m/z193.05、178.03 和134.04 由母離子連續(xù)丟失C6H8O6、CH3和CO2產(chǎn)生。結(jié)合文獻數(shù)據(jù)，M51 是咖啡酸的甲基化和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，且甲基化位置發(fā)生在羧基[19]?；谖墨I報道的質(zhì)譜數(shù)據(jù)[23]，M67 和M43 在總離子流圖中提取得到。MS2碎片離子結(jié)果表明，M67是由咖啡酸經(jīng)去羥基產(chǎn)生的，M43 是M67 的硫酸化產(chǎn)物。

M49 和M37 具有共同的碎片離子m/z193.05、178.03、149.06 和134.04，且與阿魏酸相同。此外，M49 和M37 的母離子分別比阿魏酸大80（SO3）和176（C6H8O6）。因此，M49 是阿魏酸的硫酸化產(chǎn)物，M37 是阿魏酸的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[25]。M69的母離子m/z209.04 和碎片離子m/z165.06 均比阿魏酸大16（O），結(jié)合其他碎片離子，M69 可能是阿魏酸的羥基化產(chǎn)物。M54 的母離子比阿魏酸大57（C2H3NO），結(jié)合碎片離子m/z177.06 [M-HC2H3NO2]-和 134.04 [M-H-CO2-CH3-C2H3NO]-，M54 是阿魏酸的甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物。M80的特征碎片離子m/z193.05 [M-H-C11H8O5-H2O]-與阿魏酸的母離子相同，且其母離子比丹酚酸D 高14（CH2），認為M80 為丹酚酸D 的甲基化產(chǎn)物[18]。

3.2.2 蒽醌類代謝物 M73、M87 和M75 具有相同的碎片離子m/z269.04、241.05、225.06，與大黃素一致。根據(jù)文獻報道，M73 和M87 為大黃素的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，M75 為大黃素-O-葡萄糖苷的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[26-27]。由于加入SO3和2H，M90的母離子比大黃素大82，且其碎片離子m/z271.06和243.06 比大黃素的碎片離子m/z269.04 和241.05也大2。因此，M90 是大黃素的還原氫化和硫酸化產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為9(10)-羥基-大黃素-O-硫酸酯。M91的母離子和主要碎片離子均比M90 小16（O），故初步鑒定M91 為脫羥基-9(10)-羥基-大黃素-O-硫酸酯。M68 的母離子比蘆薈大黃素高176（C6H8O6），兩者均有特征碎片離子m/z269.04 和240.04。M68是蘆薈大黃素的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。M74 的母離子經(jīng)連續(xù)丟失C6H10O5（162）和C6H8O6（176）產(chǎn)生碎片離子m/z429.08 和253.05，且與大黃酚具有相同的碎片離子m/z253.05 和225.06，M74 被認為是大黃酚-O-葡萄糖苷-O-葡萄糖醛酸。M62 的母離子比大黃素甲醚高176（C6H8O6），碎片離子相同，M62 是大黃素甲醚的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。M70 也是大黃酸的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，而M83 是大黃酸的硫酸化產(chǎn)物。

3.2.3 黃酮類代謝物 M84 的母離子比芹菜素（P26）大80（SO3），碎片離子相同，M84 被鑒定為芹菜素-O-硫酸酯。由于增加了2C6H8O6，M53的母離子比芹菜素高352，M53 是芹菜素的二葡萄糖醛酸反應產(chǎn)物。M76 和M59 的母離子分別比大豆苷元（P23）高80（SO3）和176（C6H8O6），兩者和大豆苷元具有相同的碎片離子m/z253.05、225.06、209.06、197.06、135.01 和133.03，因此，M76 為硫酸化產(chǎn)物，M59 為葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[28-29]。M63 也是毛蕊異黃酮通過葡萄糖醛酸化反應產(chǎn)生的代謝物。由于增加SO3和2H，M92 的母離子比柚皮素高82，此外，其開環(huán)的特征碎片離子m/z199.01 [M-H-C7H6O4, 1,3B]-和137.02 [M-HSO3-C8H8O2，0,3A]-表明M92 是柚皮素的還原氫化和硫酸化產(chǎn)物，且硫酸化的位置發(fā)生在B 環(huán)。因此，M92 被表征為4-羥基-柚皮素-O-硫酸酯。M89的母離子m/z367.05 和碎片離子m/z287.09 與151.04 均比M92 高14（CH2），另外，通過比較M89 的特征碎片離子m/z272.07 [M-H-SO3-CH3]-與 136.02 [M-H-SO3-C8H8O2-CH3，0,3A]-和M92 的特征碎片離子m/z273.08 [M-HSO3]-與137.02 [M-H-SO3-C8H8O2，0,3A]-，M89可確認為M92 的甲基化產(chǎn)物，鑒定為甲基-4-羥基-柚皮素-O-硫酸酯。

3.2.4 壬二酸類代謝物 大鼠iv SKI 后，檢測到壬二酸（P22）的11 種代謝物，代謝途徑如圖6 所示。由于CH2和O 的加入，M64 的母離子比壬二酸高30，其碎片離子m/z199.10 [M-H-H2O]-、157.09 [MH-CH3COOH]-和143.07 [M-H-CH3COOHCH2]-表明M64 很可能是壬二酸的甲基化和羥基化產(chǎn)物。初步鑒定M64 為羥基-甲基-壬二酸。M58 的主要碎片離子m/z215.09、197.08、155.07、153.09、135.08、111.08 比M64 均少2（2H），M58 是脫飽和產(chǎn)物。M65、M81 的母離子由于CH2的加入和2H 的損失比壬二酸的母離子高12，推測M65、M81是壬二酸經(jīng)過甲基化和脫飽和的產(chǎn)物。M72 的主要碎片離子m/z199.10、181.08、153.09、135.08、107.08和93.07 比M65 少2（2H），M72 是脫飽和產(chǎn)物。M88 的母離子由于CH2的加入和O 的減少比壬二酸小2，結(jié)合生物轉(zhuǎn)化和碎片離子，推測M88 是壬二酸的甲基化和還原（-O）產(chǎn)物，其中1 個羧基（-COOH）還原為醛基（-CHO）。M47 的碎片離子m/z124.01 [M-H-C9H12O3，C2H6NO3S]-和106.98 [MH-C9H12O3-NH3，C2H3O3S]-表明它是?；撬岬慕Y(jié)合產(chǎn)物，另外，中性丟失C9H12O3表明其為脫飽和產(chǎn)物。因此，M47 被鑒定為壬烯二酸-?；撬峤Y(jié)合物。M61 的碎片離子及歸屬為m/z261.12 [M＋HNH3]+、201.11 [M＋H-C2H7NS]+、183.10 [M＋HC2H7NS-H2O]+、155.11 [M＋H-C2H7NSHCOOH]+、137.10 [M＋H-C2H7NS-H2OHCOOH]+和 123.08 [M＋H-C2H7NS-H2OCH3COOH]+，半胱氨酸的分子式是C3H7NO2S（C2H6NS-COOH），由此可推測它是半胱氨酸結(jié)合產(chǎn)物；另外，根據(jù)擬合的分子式也表明它經(jīng)歷了還原反應（-O，＋2H），其中1 個羧基（-COOH）還原為醇羥基（-CH2OH），最后鑒定M61 為9-羥基-壬酸-半胱氨酸結(jié)合物。M55 的大部分碎片離子比M61 小2（2H），M55 是M61 的脫飽和產(chǎn)物，鑒定為9-羥基-壬烯酸-半胱氨酸結(jié)合物。M78、M82的碎片離子及歸屬分別為m/z167.11 [M-HCH3COOH-H2O]-、153.09 [M-H-CH3COOHH2O-CH2]-、141.13 [M-H-CH3COOH-CO2]-和125.10 [M-H-CH3COOH-CH3COOH]-，結(jié)合CD軟件分析的生物轉(zhuǎn)化反應，M78、M82 經(jīng)歷了羥化、甲基化、還原（-O，＋2H）和乙?；磻?，初步鑒定為9-羥基-甲基-羥基-乙?；?壬酸/異構(gòu)體。

圖6 壬二酸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathway of azelaic acid in rats

3.2.5 其他代謝物 M21的母離子比5-羥甲基糠醛（P12）大73，質(zhì)量的變化是由于增加了NH2CH2COOH（甘氨酸，75）并脫去2H，結(jié)合其碎片離子m/z168.03[M-H-HCHO]-、154.05 [M-H-CO2]-和136.04[M-H-CO2-H2O]-，表明M21 是甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物[30]，結(jié)合部位發(fā)生在甘氨酸的氨基和5-羥甲基糠醛的醛基，生成了酰胺。M77 的母離子比二氫丹參酮I高16（O），且其碎片離子m/z277.09、267.10、249.09、239.11 和221.10 與文獻報道的羥基-二氫丹參酮I 相同[31]，可鑒定為羥基-二氫丹參酮I。

4 討論

在iv SKI 后的大鼠尿液、血漿和糞便中鑒定出29 種原型成分，分別為酚酸類、蒽醌類、黃酮類和壬二酸類等。然而，僅發(fā)現(xiàn)了其中16 種原型成分的代謝產(chǎn)物。另外，有趣的是，一些原型成分的代謝物（M62、M68、M73～M75、M77、M87、M89～M92）很容易被檢測到，但它們的原型化合物（大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、柚皮素和二氫丹參酮I 等）在大鼠的尿液、血漿和糞便中沒有被檢測到。這些現(xiàn)象表明體內(nèi)藥物代謝研究的難點仍在于復雜成分的生物樣本中痕量的原型化合物或代謝物，加之受到內(nèi)源性物質(zhì)的干擾[23,31]。

SKI 在大鼠體內(nèi)的原型化合物和代謝產(chǎn)物來源于尿液樣本較多，而血漿和糞便樣本中較少，與文獻報道結(jié)果一致[17,22]，這可能與藥物半衰期、蛋白結(jié)合率、取樣方式、代謝排泄途徑等有關(guān)。大鼠體內(nèi)SKI 成分主要經(jīng)歷了I 相代謝反應（羥基化、還原、脫飽和）和II 相代謝反應（甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化、乙酰化、甘氨酸結(jié)合、半胱氨酸結(jié)合和?；撬峤Y(jié)合）。值得注意的是，甘氨酸、半胱氨酸和?；撬崾蔷哂兄匾飳W功能的內(nèi)源性物質(zhì)[32]。對與甘氨酸、半胱氨酸和?；撬峤Y(jié)合的代謝物（M20、M30、M42、M47、M50、M54、M55、M61）的進一步研究可能有助于闡明SKI 在體內(nèi)的作用機制。

本研究共鑒定了SKI 在大鼠體內(nèi)的121 種化合物。其中，通過一些代謝反應從原型中產(chǎn)生了92種代謝物，參與的代謝反應主要包括羥基化、脫飽和、甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化等。其中有53種代謝物是首次在大鼠的生物樣本中鑒定出來的。一些與內(nèi)源性物質(zhì)甘氨酸、半胱氨酸和?；撬峤Y(jié)合的代謝物由于其潛在的活性將被重點研究。本研究將為SKI 在體內(nèi)的藥效學、毒理學、網(wǎng)絡藥理學及作用機制的進一步研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，本文基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 和CD 代謝平臺，提出的“提取-化合物篩選-鑒定-驗證”的鑒定策略能快速、系統(tǒng)、全面的鑒定體內(nèi)化合物原型及其代謝產(chǎn)物，有助于體內(nèi)藥效物質(zhì)的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突