黃芩湯的抗須癬毛癬菌活性及作用機制研究 Δ

沈成英 ，羅 忠 ，章 佩 ，鄧馮沂 ，申寶德 ，胡建新 [.江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院）藥學部，南昌 0006；.南昌大學藥學院，南昌 0006；.江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院）臨床醫(yī)學研究所，南昌 0006；.江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌 000]

皮膚癬菌病是皮膚癬菌侵犯人和動物的皮膚、毛發(fā)、甲板等所引起的一類疾病，根據(jù)發(fā)病部位可以分為頭癬、體癬、手癬、甲癬等。頭癬表現(xiàn)多樣，嚴重者可造成永久性脫發(fā)。甲癬可表現(xiàn)為指甲肥厚、變色、渾濁等，其他皮膚癬菌病多表現(xiàn)為瘙癢性皮疹。世界上有20%～25%的人受到其影響，特別是老年人、糖尿病患者或免疫缺陷者[1]。近年來，因真菌耐藥性不斷增強，皮膚癬菌病的發(fā)病率也在逐年上升。目前用于治療該病的藥物種類有限，主要為傳統(tǒng)的抗真菌藥物，包括唑類、三唑類、烯丙胺類等[2]。然而，這些藥物由于治療時間長、副作用大且耐藥性強，其臨床應用受到一定限制[3]。

中藥具有療效好、來源廣泛、不良反應少、耐藥性弱等優(yōu)勢，為研發(fā)天然抗真菌藥物提供了寶貴資源。黃芩湯（Huangqin decoction，HQD）首載于張仲景的《傷寒論》，由黃芩、白芍、炙甘草、大棗組成，具有清熱止痢、和中止痛的作用[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，HQD 具有抗菌、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、解痙等作用[5—6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HQD對臨床分離的常見皮膚癬菌具有抑制作用，其最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為1.75～5.90 mg/mL[7]，但具體作用機制尚不明確。基于此，本研究以須癬毛癬菌為模型菌株，考察HQD對該菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)和生物量等的影響，并探討其作用機制，為HQD治療皮膚癬菌病提供理論基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有XS105DU型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、Multiskan FC 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、LC-2010A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）、SPX-25085H-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、HC-2517型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）、NP80型紫外分光光度計（德國Implen公司）、JEM1200型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）。

1.2 主要藥品與試劑

黃芩、白芍、炙甘草、大棗飲片購自江西彭氏國藥堂飲片有限公司，經(jīng)江西省人民醫(yī)院藥學部胡建新主任藥師鑒定，分別為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi.的干燥根、毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖以及鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實。葡萄糖、吐溫-20、山梨醇購自上海生工生物工程股份有限公司；蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限責任公司；麥角固醇（純度＞98%，批號HR20525B1）購自寶雞辰光生物科技有限公司；氯霉素、特比萘芬（terbinafine，TBF）、咪康唑（miconazole，MCZ）、兩性霉素B （amphotericin B，AMB）、卡泊芬凈（caspofungin，CAS）（純度均大于98%，批號分別為829J047、713T011、623M012、715V036、420O021）均購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基（批號2496521）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；角鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）、羊毛甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）試劑盒（批號分別為YX-190500、YX-032516）均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司；蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）和鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶、總ATP 酶試劑盒（批號分別為A021-2-1、A022-1-1、A070-6-1）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 菌株

須癬毛癬菌臨床分離株由國家衛(wèi)生健康委員會真菌病監(jiān)測網(wǎng)江西分中心暨江西省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所分離鑒定并保存。

2 方法與結果

2.1 HQD的制備

按照文獻[8]方法制備HQD：取黃芩、白芍、炙甘草和大棗按照3∶2∶2∶2的比例稱取適量，加10倍量（mL/g，下同）水，煎煮1 h，趁熱過濾；藥渣加8 倍量水繼續(xù)煎煮1 h，過濾藥液；合并2 次藥液，濃縮成每毫升含1 g 生藥的藥液，經(jīng)冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HQD的抗菌活性評價

2.2.1 MIC和最小殺菌濃度的測定

參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會的《絲狀真菌肉湯稀釋抗真菌藥敏試驗的參考方法》（M38-3rd）配制須癬毛癬菌終濃度為（1～5）×104cfu/mL 的菌懸液，備用。取96孔板，每孔均加入100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，然后向第1 孔中加入 200 mg/mL HQD 100 μL，用移液槍混勻后吸取100 μL至第2孔，如法依次進行2倍稀釋至第10 孔，使各孔中HQD 的終濃度分別為100、50、25、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20 mg/mL。向第1～10、12孔中加入配制好的菌懸液100 μL，以第11孔為陰性對照，第12孔為陽性對照。AMB（0.031 25～16 μg/mL）、TBF（0.003 9～2 μg/mL）、MCZ（0.39～200 μg/mL）、CAS（0.39～200 μg/mL）為陽性對照藥物。將上述96孔板置于生化培養(yǎng)箱中，以28 ℃培養(yǎng)4 d，肉眼觀察各孔真菌的生長情況，并與陽性、陰性對照孔比較，以肉眼觀察到無真菌生長的最低藥物質量濃度為MIC 值。結果顯示，HQD、AMB、TBF、MCZ、CAS 的MIC 值分別為3.13 mg/mL、1 μg/mL、0.062 5 μg/mL、6.25 μg/mL、50 μg/mL。上述藥敏實驗結束后，吸取HQD各給藥組的內(nèi)容物200μL 至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose agar，SDA）培養(yǎng)板上培養(yǎng)7 d，以不長菌落的最低藥物質量濃度為最小殺菌濃度（minimal fungicidal concentration，MFC）。結果顯示，HQD的MFC值為25 mg/mL。

2.2.2 HQD對須癬毛癬菌菌絲生長的影響

參照文獻[9]方法測定HQD對須癬毛癬菌菌絲生長的影響。實驗分為陰性對照組、TBF組（0.062 5 μg/mL，劑量根據(jù)“2.2.1”項下結果設置）和HQD 低、中、高劑量組（1.56、3.13、6.25 mg/mL，劑量根據(jù)“2.2.1”項下結果設置）。將須癬毛癬菌接種在SDA 培養(yǎng)板上，培養(yǎng)一段時間后，用直徑為9 mm 的打孔器取菌塊作為菌餅備用。取不同質量濃度的HQD與預熱的SDA培養(yǎng)基混合均勻后倒入直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿中制備含藥培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)皿中用9 mm的打孔器除去中間培養(yǎng)基并接種上述9 mm 的菌餅，用封口膜密封培養(yǎng)皿，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，采用十字交叉法測量菌絲長度。菌絲長度（mm）＝菌絲長度測量平均值－9。實驗重復3次。采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05（下同）。由表1 可知，與陰性對照組相比，TBF 組和HQD 各劑量組須癬毛癬菌菌絲長度均顯著縮短（P＜0.05），且TBF 組和HQD 高劑量組須癬毛癬菌菌絲長度顯著短于HQD低劑量組（P＜0.05）。

表1 各組須癬毛癬菌菌絲長度、孢子萌發(fā)率、生物量的檢測結果（±s，n＝3）

表1 各組須癬毛癬菌菌絲長度、孢子萌發(fā)率、生物量的檢測結果（±s，n＝3）

a：與陰性對照組比較，P＜0.05；b：與HQD低劑量組比較，P＜0.05；c：與HQD中劑量組比較，P＜0.05。

組別陰性對照組TBF組HQD低劑量組HQD中劑量組HQD高劑量組菌絲長度/mm 15.25±1.00 12.29±0.38ab 13.67±0.44a 12.63±0.78a 11.33±0.80ab孢子萌發(fā)率/%89.33±8.08 30.00±6.00ab 44.00±6.00a 26.00±6.00ab 18.67±7.02abc生物量/mg 21.55±3.80 10.95±3.21a 15.88±1.94a 13.33±3.28a 10.43±1.91ab

2.2.3 HQD對須癬毛癬菌孢子萌發(fā)的影響

實驗分為陰性對照組、TBF 組（0.062 5 μg/mL）和HQD 低、中、高劑量組（1.56、3.13、6.25 mg/mL），將相應藥液與須癬毛癬菌菌懸液（5.0×105cfu/mL）充分振蕩混合均勻后，接種于含有SDA的凹玻片上，置于濕盒中，于28 ℃培養(yǎng)24 h。采用顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況（以抽出芽管、長出菌絲為萌發(fā)），計算每100個孢子中萌發(fā)的孢子數(shù)，孢子萌發(fā)率＝發(fā)芽孢子數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%[10]。實驗重復3 次。由表1 可知，與陰性對照組相比，TBF 組和HQD 各劑量組須癬毛癬菌孢子萌發(fā)率均顯著降低（P＜0.05），且HQD的抑制作用呈劑量依賴性。

2.2.4 HQD對須癬毛癬菌生物量的影響

實驗分為陰性對照組、TBF 組（0.062 5 μg/mL）和HQD 低、中、高劑量組（1.56、3.13、6.25 mg/mL）。取無菌搖菌管，加入5 mL 含藥沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose broth，SDB）和1 mL 含有5.0×105cfu/mL 的須癬毛癬菌菌懸液，用封口膜密封搖菌管，在28 ℃條件下以120 r/min 振蕩6 d；過濾收集菌絲體，烘干，稱重，將其作為須癬毛癬菌的生物量。實驗重復3次。由表1 可知，與陰性對照組比較，TBF 組和HQD 各劑量組須癬毛癬菌生物量均顯著降低（P＜0.05），且HQD 高劑量組的生物量顯著低于HQD 低劑量組（P＜0.05）。

2.2.5 HQD對須癬毛癬菌菌絲超微結構的影響

實驗分為陰性對照組、TBF 組（0.062 5 μg/mL）和HQD 低、中、高劑量組（1.56、3.13、6.25 mg/mL）。首先，將濃度為5×103cfu/mL的須癬毛癬菌菌懸液在28 ℃下培養(yǎng)3 d，然后加入相應藥液，繼續(xù)培養(yǎng)5 d；過濾菌絲并用無菌蒸餾水洗滌后，置于2.5%戊二醛中固定過夜；取出固定后的菌絲，用磷酸鹽緩沖液漂洗、鋨酸固定、磷酸鹽緩沖液再漂洗、乙醇梯度脫水后，依次用丙酮和樹脂混合液（1∶0、3∶1、1∶1、1∶3）處理，純樹脂包埋，切薄片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后使用透射電鏡觀察。由圖1（HQD低劑量組圖略）可知，陰性對照組須癬毛癬菌菌絲顯示出清晰和完整的細胞結構，具有典型的細胞核和線粒體等；與陰性對照組相比，各給藥組菌絲的細胞結構均受到了一定程度的破壞，HQD低劑量組菌絲部分線粒體內(nèi)容物被破壞；TBF組和HQD中劑量組細胞核被破壞，線粒體腫脹，細胞內(nèi)容物滲漏；HQD高劑量組菌絲高度空泡化，線粒體嚴重腫脹，細胞內(nèi)容物流失嚴重。

圖1 各組須癬毛癬菌菌絲的透射電鏡圖

2.3 HQD的抗菌機制

2.3.1 HQD對須癬毛癬菌細胞壁的影響

同“2.2.1”項下方法測定在有/無0.8 mol/L 山梨醇時，HQD的MIC值（以CAS為陽性對照藥）。結果顯示，在無山梨醇的條件下，CAS的MIC為50 μg/mL，而在加入0.8 mol/L 山梨醇的條件下，CAS 的MIC 從50 μg/mL提高至200 μg/mL，表明CAS抗須癬毛癬菌的機制與細胞壁有關。而HQD 無論是否有山梨醇存在，其MIC 值均為3.13 mg/mL，表明HQD 可能對須癬毛癬菌細胞壁無作用。

2.3.2 HQD對須癬毛癬菌細胞膜的影響

同“2.2.5”項下方法培養(yǎng)、分組、給藥、收集濕菌絲體。稱取濕菌絲體約0.2 g，加入5 mL 新鮮配制的25%氫氧化鉀乙醇溶液（25 g KOH 和30 mL 無菌蒸餾水用100%乙醇稀釋至100 mL），渦旋混合5 min，然后參考文獻[11—12]方法測定須癬毛癬菌細胞膜中麥角固醇的含量。另外，同“2.2.5”項下方法培養(yǎng)、分組（另設置MCZ組作為檢測CYP51活性的陽性對照）、給藥、收集濕菌絲體，然后按相應試劑盒方法操作，檢測須癬毛癬菌細胞膜中SE和CYP51的活性。實驗重復3次。由表2可知，與陰性對照組相比，TBF 組和HQD 各劑量組須癬毛癬菌細胞膜中麥角固醇的含量均顯著降低（P＜0.05），且HQD的抑制作用呈劑量依賴性；TBF組和HQD中、高劑量組須癬毛癬菌細胞膜中SE 活性以及MCZ 組和HQD中、高劑量組須癬毛癬菌細胞膜中CYP51活性均顯著降低（P＜0.05），且MCZ組和HQD高劑量組須癬毛癬菌細胞膜中CYP51活性顯著低于HQD低劑量組（P＜0.01）。

表2 各組須癬毛癬菌中麥角固醇含量和SE、CYP51活性的檢測結果（±s，n＝3）

表2 各組須癬毛癬菌中麥角固醇含量和SE、CYP51活性的檢測結果（±s，n＝3）

a：與陰性對照組比較，P＜0.05；b：與HQD低劑量組比較，P＜0.01；c：與HQD中劑量組比較，P＜0.01；－：無相應數(shù)據(jù)。

組別陰性對照組TBF組MCZ組HQD低劑量組HQD中劑量組HQD高劑量組麥角固醇含量/（μg/g）419.04±16.98 296.16±14.51ab－366.18±11.82a 305.67±22.70ab 193.56±24.80abc SE活性629.29±55.77 424.15±52.24a－522.37±41.91 426.75±92.06a 375.47±56.83a CYP51活性319.54±41.21－204.38±23.64ab 274.22±23.34 241.38±27.27a 216.41±37.38ab

2.3.3 HQD 對須癬毛癬菌線粒體中MDH、SDH 及ATP酶活性的影響

同“2.2.5”項下方法培養(yǎng)、分組、給藥、收集濕菌絲體，提取線粒體，然后參考相應試劑盒說明書方法操作，檢測線粒體中MDH、SDH 及ATP 酶（鈉鉀ATP 酶、鈣鎂ATP 酶和總ATP 酶）的活性。實驗重復3 次。由表3 可知，與陰性對照組比較，TBF 組和HQD 中、高劑量組須癬毛癬菌線粒體中MDH、SDH、鈉鉀ATP 酶、鈣鎂ATP酶、總ATP酶活性均顯著降低（P＜0.05）；且相比HQD低劑量組，HQD 中、高劑量組的部分指標活性更低（P＜0.05）。

表3 各組須癬毛癬菌線粒體中MDH、SDH 及ATP 酶活性的檢測結果（±s，n＝3）

表3 各組須癬毛癬菌線粒體中MDH、SDH 及ATP 酶活性的檢測結果（±s，n＝3）

a：與陰性對照組比較，P＜0.05；b：與HQD低劑量組比較，P＜0.05；c：與HQD中劑量組比較，P＜0.05。

組別陰性對照組TBF組HQD低劑量組HQD中劑量組HQD高劑量組MDH 4.56±1.23 2.52±0.44a 3.59±0.72 2.57±1.57a 1.66±0.57ab SDH 17.46±2.17 10.33±0.64ab 13.88±1.28a 10.61±2.11ab 9.38±2.04abc鈉鉀ATP酶3.08±0.17 1.68±0.28a 2.22±0.72 1.63±0.72a 1.13±0.19ab鈣鎂ATP酶5.33±0.42 3.24±0.37ab 4.46±0.19 2.98±0.90ab 2.24±0.97abc總ATP酶11.67±1.23 7.99±1.94a 6.39±1.10 8.60±1.69a 6.39±1.10ab

3 討論

須癬毛癬菌可導致人體和動物各個部位感染，已成為第二大常見的皮膚癬菌，但現(xiàn)有治療藥物有限，且副作用大，因此從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒、低耐藥的天然抗真菌藥物具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，HQD對須癬毛癬菌的MIC和MFC值分別為3.13、25 mg/mL，且可顯著抑制須癬毛癬菌菌絲生長、孢子萌發(fā)和生物量的產(chǎn)生，表明HQD 可能是一種具有臨床應用前景的抗真菌藥物。

細胞壁可以保護細胞形態(tài)免受外部滲透沖擊，在沒有滲透穩(wěn)定劑（山梨醇）的情況下，藥物可破壞細胞壁的完整性導致真菌細胞溶解，甚至死亡[13—14]。因此，山梨醇保護試驗可用于探索HQD 對真菌細胞壁是否有影響，若有影響，在含有山梨醇培養(yǎng)基中，HQD 的MIC 值將增大。而本研究中加入0.8 mol/L 山梨醇后，HQD 的MIC 值無變化，表明HQD 對須癬毛癬菌的細胞壁無作用。細胞膜是一種動態(tài)結構，由嵌入了酶和轉運蛋白的脂質雙分子層組成；麥角固醇是細胞膜的主要甾醇成分，不僅可參與調(diào)節(jié)細胞膜的通透性和流動性，還可維持細胞膜結構的完整性[15]。SE 是一種黃素腺嘌呤二核苷酸，其可催化角鯊烯環(huán)氧化為2，3-氧化角鯊烯，從而導致麥角固醇生物合成途徑的級聯(lián)反應；CYP51的阻斷可導致羊毛甾醇和其他14α-甲基化甾醇在真菌細胞膜中積累，從而導致膜通透性變化和膜蛋白功能障礙[12，16]。線粒體是ATP合成的主要細胞器，是細胞進行有氧呼吸的主要場所，其脫氫酶（包括MDH 和SDH）是ATP 生物合成中非常重要的酶[17]。基于此，筆者在抗真菌機制研究中，選擇不同的藥物作為陽性對照：（1）TBF能降低生物膜中麥角固醇含量，還能通過抑制SE 活性來抑制真菌細胞膜中麥角固醇的合成并影響線粒體酶活性[18]，因此，在麥角固醇含量測定、SE和MDH、SDH以及ATP酶活性檢測實驗中，筆者選擇TBF作為陽性對照藥物。（2）MCZ 作為CYP51 的抑制劑，可以與細胞色素P450 的血紅素鐵原子結合，阻止羊毛甾醇14α-甲基的氧化去除[19]，因此，在CYP51 活性測定實驗中，筆者選擇MCZ作為陽性對照藥物。（3）CAS可影響細胞壁完整性[20]，因此，本研究將其作為考察細胞壁完整性的陽性對照藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，HQD對須癬毛癬菌細胞壁無作用，但是其可能通過降低麥角固醇含量和SE、CYP51 的活性影響須癬毛癬菌細胞膜，還可通過降低MDH、SDH、鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶和總ATP酶的活性影響須癬毛癬菌線粒體，進而發(fā)揮抗菌作用。

綜上所述，HQD 具有顯著的抗須癬毛癬菌活性，其作用機制與降低細胞膜中麥角固醇含量和SE、CYP51活性以及線粒體相關酶活性有關。