白術(shù)-木香藥對對脾虛腹瀉型腸易激綜合征大鼠腸道菌群與短鏈脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)作用 Δ

黎豫川 ，張遠哲 ，楊元鳳 ，陳禮大 ，徐獻梅 （.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥學部，貴陽 55005；.貴州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴陽 55005）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種無器質(zhì)性疾病的功能性腸病，以腹痛或腹部不適伴排便習慣改變?yōu)樘卣鳎畛Ｒ姷氖歉篂a型IBS（diarrhea-type irritable bowel syndrome，IBS-D）[1]。IBS 的發(fā)病機制尚不完全清楚，目前認為IBS 是胃腸動力異常、內(nèi)臟感覺異常、腦-腸調(diào)節(jié)異常、炎癥等多種因素共同作用的結(jié)果[2]。相關(guān)研究表明，腸道菌群失衡和有害細菌定植增加是IBS-D患者重要的發(fā)病機制和臨床表現(xiàn)之一，也被認為是IBS-D患者內(nèi)臟敏感性升高的原因[3]。也有研究表明，腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）、膽汁酸等的變化可能參與了IBS 的發(fā)病過程[4]。

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是腦-腸軸的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)和信號分子，90%～95%的5-HT由腸道產(chǎn)生，其中大部分由腸嗜鉻細胞釋放[5]。5-HT通過與多種5-HT 受體結(jié)合發(fā)揮其生物學效應(yīng)，其中5-HT3 受體（5-HT3R）和5-HT4 受體（5-HT4R）與IBS 的發(fā)病機制密切相關(guān)[6]；同時，5-HT 作用的強度和持續(xù)時間最終取決于5-HT失活的效率，由于細胞間降解酶相對缺乏，5-HT信號傳導的終止幾乎完全依賴于固有層中5-HT轉(zhuǎn)運體（5-HT transporter，SERT），因為5-HT的再攝取主要由SERT將5-HT轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，進而在細胞內(nèi)被降解，其代謝產(chǎn)物則通過腎臟排出體外[7]。P物質(zhì)（SP）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對腸道動力和敏感性有調(diào)節(jié)作用[8]?？梢?，5-HT和SP等物質(zhì)介導的腦-腸軸對調(diào)節(jié)IBS腸道菌群具有重要作用。

中醫(yī)治療的方針是有機整體觀念和辨證論治。組學技術(shù)能夠從整體角度反映多因素作用下的器官功能和代謝狀態(tài)，現(xiàn)已成為中藥作用機制研究的有力工具。已有研究證實，生白術(shù)能有效改善便秘癥狀；木香性溫，味辛、苦，具有行氣調(diào)中、止痛、健脾的功效[9]。課題組前期研究也證實，香砂六君子湯中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能來源于白術(shù)、木香，可有效改善脾虛IBS-D 模型大鼠的腸動力[10]?；诖耍狙芯扛鶕?jù)香砂六君子湯原方中白術(shù)和木香的比例制備白術(shù)-木香藥對水煎液，用其干預脾虛IBS-D模型大鼠，并基于5-HT和SP等物質(zhì)介導的腦-腸軸，探討白術(shù)-木香藥對對該模型大鼠腸道菌群與SCFAs代謝的調(diào)節(jié)作用，以期為脾虛IBS-D的治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Thermo Trace 1300 型氣相系統(tǒng)、Thermo ISQ 7000 型質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），F(xiàn)Lx800 型酶標儀（美國BioTek 公司），MiSeq 型測序儀（美國Illumina 公司），BA210 Digital 型數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司），JY-SCZ4+型垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），5200 Multi 型熒光圖像分析系統(tǒng)（上海天能生命科學有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

白術(shù)、木香、番瀉葉藥材均來自貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，經(jīng)該科室主任中藥師趙海鑒定為真品。匹維溴銨（批號32208002）購自北京福元醫(yī)藥股份有限公司；RIPA組織裂解液（批號P0013）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔源5-HT3R、5-HT4R 單克隆抗體（批號分別為BS-24700R、BS-12054R）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔源SERT、β-actin單克隆抗體（批號分別為A19110、AC026）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；5-HT、SP 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為ZC-35959、ZC-36170）均購自上海茁彩生物科技有限公司；乙醚（純度≥99.5%）購自成都市科隆化學品有限公司；乙酸（純度≥99%）、丙酸標準品（純度≥99.5%）均購自美國Sigma公司；丁酸標準品（純度≥99%）購自東京化成工業(yè)株式會社；其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SD 大鼠，6 周齡，體重為（200±20） g，雌雄各半，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（川）2020-030。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（25±2） ℃，相對濕度為50%～60%，自由飲食。本實驗經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審批通過（批準號為20220104），動物使用許可證號為SYXK（黔）2021-0005。

2 方法

2.1 藥液的制備

2.1.1 番瀉葉水煎液

稱取番瀉葉300 g，加水1 500 mL，浸泡2 h，武火煮沸，文火煎煮10 min；過濾，濃縮，即得質(zhì)量濃度為1 g/mL的番瀉葉水煎液（以生藥量計）。

2.1.2 白術(shù)-木香藥對水煎液

根據(jù)香砂六君子湯原方中白術(shù)和木香的比例，稱取白術(shù)12 g、木香4 g，先加入8 倍量純化水（mL/g，下同），以武火煮開后再以文火煎30 min，過濾，收集濾液；加入6倍量純化水以武火煮開后再以文火煎煮20 min，過濾，收集濾液；合并2 次濾液，在100 ℃水浴條件下進行濃縮，即得質(zhì)量濃度為1.4 g/mL 的白術(shù)-木香藥對水煎液（以生藥量計）。

2.2 分組、造模及給藥

參考相關(guān)文獻方法進行造模[11]：給40 只SD 大鼠灌胃番瀉葉水煎液，給藥體積為10 mL/kg，每日2次，連續(xù)14 d。大鼠每次灌胃番瀉葉水煎液后，采取彈力繃帶束縛其兩前肢和肩背部，限制其上半身活動，持續(xù)2 h；束縛期間聯(lián)合給予夾尾刺激（用止血鉗夾大鼠尾部，刺激其產(chǎn)生抓咬、怒叫、站立弓背等反應(yīng)），每次夾尾3～5 min。14 d后觀察大鼠，當其出現(xiàn)食少納呆、泄瀉嚴重甚至脫肛等主要癥狀，以及消瘦、體重減輕、神態(tài)萎靡、四肢不收、毛色枯槁、蜷縮聚堆、易疲勞中的2項次要癥狀時，表明脾虛IBS-D造模成功。

取30 只造模成功的大鼠，分為模型組和白術(shù)-木香藥對低、中、高劑量組（0.7、1.4、2.8 g/kg，中劑量根據(jù)成人和大鼠的體表面積換算而得）以及陽性對照組（匹維溴銨1.5 mg/kg，劑量參考文獻[12]設(shè)置），每組6只；另取6只健康大鼠作為空白對照組。空白對照組與模型組大鼠灌胃生理鹽水，其余各組灌胃相應(yīng)藥液，每天1次，連續(xù)14 d。

2.3 大鼠一般狀況觀察及糞便含水量檢測

記錄各組大鼠給藥后1、7、14 d的體重，并觀察其腹瀉程度、精神狀態(tài)及進食狀況。收集大鼠糞便樣本，經(jīng)恒溫加熱干燥至恒重后，計算糞便含水量。糞便含水量＝（糞便干燥前質(zhì)量－糞便干燥后質(zhì)量）/糞便干燥前質(zhì)量×100%。

2.4 大鼠腸道敏感性的檢測

末次給藥后，參考文獻[13]的方法對大鼠進行腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）閾值測量，即記錄各組大鼠出現(xiàn)腹部抬起和背部弓起反應(yīng)的最小注水量（mL），每只大鼠測量3 次取平均值，時間間隔為30 s。AWR閾值越高，表明其腸道敏感性越低。

2.5 大鼠腸道推進率的檢測

末次給藥后，大鼠禁食不禁水18 h，腹腔注射4%戊巴比妥鈉進行麻醉，經(jīng)腹主動脈采集血清樣品后，取3只大鼠灌胃0.5 mL 含5%黑色活性炭的半固體混懸液；30 min 后處死，立即打開腹腔，分離腸系膜，截取從幽門至結(jié)腸末端的整段大小腸，直線平鋪于白紙上，然后用直尺測量幽門至黑色活性炭前沿的距離以及至結(jié)腸末端的距離，并計算腸道推進率。腸道推進率＝幽門至黑色活性炭前沿的距離/幽門至結(jié)腸末端的距離×100%。腸道推進率檢測結(jié)束后，收集各大鼠結(jié)腸組織、糞便樣品，并將剩余3只大鼠處死，同法收集上述樣品。

2.6 大鼠血清中5-HT、SP水平的檢測

取各組大鼠血清樣品，按ELISA試劑盒說明書方法操作，檢測大鼠血清中5-HT、SP水平。

2.7 大鼠結(jié)腸組織的病理學形態(tài)觀察

取3 只大鼠結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛中固定，制作石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水合、蘇木精-伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，使用中性樹膠封固，然后采用光學顯微鏡觀察大鼠結(jié)腸組織的病理變化。

2.8 大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R、SERT 蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法檢測。取各組大鼠結(jié)腸組織適量進行總蛋白提取，使用BCA 試劑盒定量組織中的蛋白濃度后，變性失活，在凝膠電泳下分離，轉(zhuǎn)膜；使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入5-HT3R、5-HT4R、SERT、β-actin一抗（稀釋度均為1∶1 000）置于4 ℃下孵育過夜，然后加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h；以TBST 洗滌3 次，采用ECL 系統(tǒng)對蛋白條帶進行顯色，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.9 大鼠糞便的16S rRNA測序

取空白對照組、模型組和白術(shù)-木香藥對高劑量組大鼠的糞便樣本各適量，使用試劑盒對樣本進行DNA提取與定量，擴增16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)域，純化回收，采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫，進行高通量測序分析。將測序數(shù)據(jù)進行序列去噪或操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，選用Silva 數(shù)據(jù)庫（Release132版，http：//www.arb-silva.de）進行物種分類學注釋，然后進行物種分析與α 多樣性分析。本研究以Chao1 和observed species指數(shù)表征群落豐度，以Shannon和Simpson指數(shù)表征群落多樣性，并制作相關(guān)圖表。

2.10 大鼠糞便中SCFAs含量的檢測

取空白對照組、模型組和白術(shù)-木香藥對高劑量組大鼠的糞便樣本各適量，按照Han 等[14]方法檢測樣本中乙酸、丙酸、丁酸的含量。

2.11 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 白術(shù)-木香藥對對模型大鼠一般狀況及糞便含水量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠給藥7、14 d后的體重均顯著降低（P＜0.01），糞便含水量顯著升高（P＜0.01），同時出現(xiàn)嚴重腹瀉、食欲減少、嗜睡、運動減少等癥狀；與模型組比較，各給藥組大鼠給藥7、14 d 后的體重和糞便含水量（白術(shù)-木香藥對低劑量組除外）均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），腹瀉緩解，精神狀態(tài)恢復。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠體重變化及糞便含水量檢測結(jié)果（±s，n＝6）

3.2 白術(shù)-木香藥對對模型大鼠腸道敏感性和腸道推進率的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠AWR 閾值顯著降低，腸道推進率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和白術(shù)-木香藥對中、高劑量組大鼠AWR閾值均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），腸道推進率（白術(shù)-木香藥對中劑量組除外）均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠AWR閾值和腸道推進率的檢測結(jié)果

3.3 白術(shù)-木香藥對對模型大鼠血清中5-HT、SP水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中5-HT、SP水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，白術(shù)-木香藥對各劑量組大鼠血清中5-HT、SP 水平均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠血清中5-HT、SP水平的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

3.4 白術(shù)-木香藥對對模型大鼠結(jié)腸組織病理學形態(tài)的影響

空白對照組大鼠結(jié)腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層結(jié)構(gòu)較完整，固有層內(nèi)腸腺排列整齊，無明顯變性或壞死。模型組大鼠結(jié)腸黏膜固有層壞死，腸腺結(jié)構(gòu)被破壞，壞死細胞結(jié)構(gòu)模糊、細胞核固縮溶解，炎癥細胞浸潤嚴重。各給藥組大鼠結(jié)腸組織部分結(jié)構(gòu)恢復，但仍有炎癥細胞浸潤和黏膜變性壞死的情況。結(jié)果見圖4。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織病理學形態(tài)的觀察結(jié)果（HE染色）

3.5 白術(shù)-木香藥對對模型大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R、SERT蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），5-HT4R、SERT蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，白術(shù)-木香藥對各劑量組大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），5-HT4R（白術(shù)-木香藥對低劑量組除外）、SERT 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖5、表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R、SERT 蛋白表達水平的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

表1 各組大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R、SERT 蛋白表達水平的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

5-HT3R 1.00±0.12 4.13±0.12a 3.22±0.43b 2.44±0.32c 1.64±0.30c組別空白對照組模型組白術(shù)-木香藥對低劑量組白術(shù)-木香藥對中劑量組白術(shù)-木香藥對高劑量組5-HT4R 1.00±0.25 0.33±0.08a 0.49±0.08 0.67±0.15b 0.83±0.15c SERT 1.00±0.09 0.21±0.03a 0.38±0.05b 0.58±0.09c 0.76±0.08c

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R、SERT 蛋白表達的電泳圖

3.6 白術(shù)-木香藥對對模型大鼠腸道菌群與SCFAs代謝的影響

在科水平上，空白對照組大鼠腸道菌群中乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）、S24_7 菌科（S24_7）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對豐度分別為30.3%、17.1%、11.3%和4.3%，模型組中上述菌科相對豐度分別為33.6%、20.8%、9.8%和11.9%，白術(shù)-木香藥對高劑量組中上述菌科相對豐度分別為41.5%、16.7%、5.2%和10.0%。由此可知，3 組大鼠糞便均以乳酸桿菌科和S24_7菌科相對豐度較高，經(jīng)白術(shù)-木香藥對干預后，大鼠糞便中上述菌科相對豐度變化較大。結(jié)果見圖6。

圖6 各組大鼠糞便中科水平排名前20的菌群分布

α多樣性分析結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組Chao1 指數(shù)、observed species 指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，白術(shù)-木香藥對高劑量組Chao1 指數(shù)、observed species 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠α多樣性分析的結(jié)果（±s，n＝6）

表2 各組大鼠α多樣性分析的結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白對照組模型組白術(shù)-木香藥對高劑量組Chao1指數(shù)625.61±49.50 799.41±28.35a 632.65±114.02b observed species指數(shù)565.13±23.18 702.07±34.33a 560.30±109.72b Shannon指數(shù)6.84±0.04 7.25±0.16 6.61±0.35b Simpson指數(shù)0.97±0.01 0.97±0.01 0.95±0.01b

與空白對照組比較，模型組大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，白術(shù)-木香藥對高劑量組大鼠糞便中丁酸含量顯著降低（P＜0.05），乙酸、丙酸含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠糞便中SCFAs 含量的檢測結(jié)果（±s，n＝6，μg/g）

表3 各組大鼠糞便中SCFAs 含量的檢測結(jié)果（±s，n＝6，μg/g）

a：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白對照組模型組白術(shù)-木香藥對高劑量組丁酸2 914.82±937.10 2 902.64±584.89 1 394.83±529.95a乙酸3 561.73±791.92 3 018.50±322.94 2 470.01±290.27丙酸1 143.55±241.67 1 156.94±190.50 1 050.82±161.38

4 討論

脾虛IBS-D是臨床常見的腸道疾病，此類患者存在體重下降、腹瀉等癥狀[15]。白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水的功效，為治療脾胃氣虛證常用藥[15]；木香具有行氣止痛、健脾消食的功效，為治療脾胃氣滯證常用藥[16]；二者聯(lián)合配伍，可改善脾氣虛衰、脾胃運化功能失調(diào)的情況。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白術(shù)-木香藥對干預后，大鼠體重增加，腹瀉緩解，精神狀態(tài)恢復，腸道敏感性降低，結(jié)腸組織部分結(jié)構(gòu)恢復，表明該藥對可改善脾虛IBS-D模型大鼠癥狀。

5-HT是腸功能的重要介質(zhì)，在IBS中發(fā)揮特殊的作用[17]。5-HT 受體中5-HT3R 的主要作用是促進腸道收縮、腸液分泌和內(nèi)容物運輸；5-HT4R的主要作用是緩解消化不良，改善胃食管反流病、胃輕癱或IBS[18]。SP具有調(diào)節(jié)腸道蠕動的作用，但是其異常分泌則會導致腸道平滑肌興奮過度，引起腹瀉[8]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)白術(shù)-木香藥對干預后，大鼠血清中5-HT、SP 水平均降低，5-HT3R蛋白表達水平降低，5-HT4R、SERT蛋白表達水平均升高。這提示，白術(shù)-木香藥對可通過調(diào)節(jié)5-HT 及其受體的表達，改善脾虛IBS-D模型大鼠癥狀。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，焦慮IBS-D大鼠經(jīng)過治療后腸道中乳酸桿菌的數(shù)量會增加[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白術(shù)-木香藥對干預后，脾虛IBS-D模型大鼠腸道中乳酸桿菌相對豐度增加，且其對S24_7等擬桿菌的相對豐度具有一定調(diào)節(jié)作用，這提示白術(shù)-木香藥對對脾虛IBS-D模型大鼠腸道中乳酸桿菌與擬桿菌具有特異性調(diào)節(jié)作用。Chao1 數(shù)值越高反映出細菌物種越多，observed species數(shù)值越高表明細菌物種的相對豐度越高，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)則是衡量細菌物種多樣性的相關(guān)指標[20]。本研究結(jié)果顯示，白術(shù)-木香藥對可降低脾虛IBSD模型大鼠腸道菌群的多樣性與物種數(shù)量，從而減少因細菌引起的病癥。

除了腸道菌群的影響，其代謝產(chǎn)物SCFAs的變化也會影響IBS的發(fā)病過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs（主要是乙酸和丁酸）可促進5-HT 的分泌和釋放，誘發(fā)蠕動反射，從而增強結(jié)腸收縮，加快結(jié)腸傳輸速度，然后導致腹瀉發(fā)生率升高[21]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)白術(shù)-木香藥對干預后，脾虛IBS-D 模型大鼠糞便中丁酸含量降低，但是乙酸、丙酸含量變化不大。這可能是由于腸道菌群的變化未能引起大規(guī)模SCFAs 分泌異常，因此，SCFAs 的變化有可能是腸道菌群與5-HT 等共同作用的結(jié)果，也有可能與腸道中瘤胃球菌科和毛螺菌科相對豐度降低導致SCFAs合成減少有關(guān)。

綜上所述，白術(shù)與木香配伍可以改善脾虛IBS-D模型大鼠的腸道動力及腸道敏感性，并緩解腹瀉，這可能與改善腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，降低5-HT 表達和丁酸含量以及升高5-HT4R、SERT表達有關(guān)。