1，8-桉葉油素對2型糖尿病胰島β細胞鐵死亡的干預作用及機制 Δ

楊 紅 ，任鵬艷 ，陳永鑫 ，姚喻霆 ，甘詩泉 ，劉 佳 陳婷婷 張 寶 沈祥春 ，李 悅 （.貴陽市婦幼保健院/貴陽市兒童醫(yī)院藥學部，貴陽 55000；2.貴州醫(yī)科大學天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴陽 56；.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 56）

糖尿病是嚴重威脅人類健康的疾病之一，在全球范圍內發(fā)病率逐年上升，糖尿病及其并發(fā)癥已成為21世紀全球醫(yī)療衛(wèi)生的沉重負擔，是目前亟待解決的重大科學及社會民生問題[1—2]。2 型糖尿病作為糖尿病兩種表型之一，其發(fā)病涉及多種誘因，包括高血糖、胰島素抵抗等，但其潛在的發(fā)病機制尚未充分闡明。很多2型糖尿病患者仍不可避免地患有微血管并發(fā)癥（包括視網膜病變、腎病和神經病變）和大血管并發(fā)癥（如心血管并發(fā)癥）[3]，這對2 型糖尿病患者的生存構成了嚴重威脅，給世界衛(wèi)生系統帶來巨大的挑戰(zhàn)。

近年來研究表明，胰島β細胞鐵死亡是導致正常人糖代謝出現異常并進展為2型糖尿病的始動因素之一，也是2型糖尿病進展的關鍵環(huán)節(jié)，但其確切的發(fā)病機制尚未完全闡明[4]。鐵死亡是一種鐵依賴性的脂質過氧化物蓄積驅動的細胞程序性死亡，其特征在于細胞內鐵的沉積以及脂質過氧化物的積累[5]。已有研究表明，抑制谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase-4，GPX4）活性是誘導細胞鐵死亡的關鍵環(huán)節(jié)，恢復GPX4 活性可明顯抑制鐵死亡的發(fā)生發(fā)展[6]。2 型糖尿病患者的高血糖環(huán)境可誘導胰島β 細胞鐵死亡的發(fā)生[7]。因此，探索GPX4在胰島β細胞鐵死亡過程中的具體調控作用及機制，對進一步闡明2型糖尿病的發(fā)病機制、尋求有效干預措施具有重要的社會意義。

民族藥艷山姜為姜科山姜屬艷山姜Alpiniazerumbet（Pers.） Burtt.et Smith的果實，具有溫中燥濕、行氣止痛的功效。揮發(fā)油作為艷山姜的主要活性成分，具有抗氧化[8]、改善糖尿病[9]等作用。其中，1，8-桉葉油素是艷山姜揮發(fā)油的主要效應成分。本課題組前期的研究顯示，1，8-桉葉油素對高糖誘導的胰島β 細胞凋亡具有顯著的改善作用[10]，但其對胰島β 細胞鐵死亡的作用及機制尚不明確?；诖?，本研究探討了1，8-桉葉油素對2型糖尿病誘導的胰島β細胞鐵死亡的干預作用及機制，旨在為治療2型糖尿病的創(chuàng)新藥物開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Varioskan LUX型多功能酶標儀（美國Themo Fisher Scientific 公司），HF240 型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司），Chemi-DocTMXRS+型曝光儀（美國Bio-Rad 公司），Leica DMi8型熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 主要藥品與試劑

1，8-桉葉油素（批號K1822141，純度≥99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1640 基礎培養(yǎng)基（批號8121324）購自美國Gibco 公司；D-無水葡萄糖、D-甘露醇（批號分別為405A0918、1126F038）均購自北京索萊寶科技有限公司；鐵死亡誘導劑Erastin、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（批號分別為HY-15763、HY-100579）均購自美國MCE 公司；組織鐵測定試劑盒（批號20230202）購自南京建成生物工程研究所有限公司；FerroOrange探針（批號F374）購自東仁化學科技（上海）有限公司；鼠源β-actin 單克隆抗體、鼠源環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX2）單克隆抗體、鼠源GPX4 單克隆抗體（批號分別為66009-1-Ig、66351-1-Ig、67763-1-Ig）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的鼠免疫球蛋白G二抗（批號BS12478）購自美國Bioworld公司。

1.3 細胞

本研究所用細胞為小鼠胰島β 細胞，購自美國ATCC細胞庫。

1.4 動物

本研究所用動物為SPF級雄性C57BL/6小鼠，體重約18～22 g，6～8周齡，購自貴州醫(yī)科大學動物中心，動物生產許可證號為SCXK（貴）2023-0002。小鼠于光照周期為12 h 的環(huán)境中飼養(yǎng)，日常自由進食和飲水，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。本實驗經貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，批準文號為2100421。

2 方法

2.1 細胞實驗

2.1.1 胰島β細胞中Fe2+水平的檢測

將胰島β 細胞接種于24 孔板，當細胞密度達70%時，分為正常對照組（只加細胞不加藥）、甘露醇組（用該組作為模型組的滲透壓對照，25 mmol/L）、模型組（D-無水葡萄糖，25 mmol/L）和1，8-桉葉油素低、高劑量組（0.25、0.5 μmol/L）以及維生素E 組（陽性對照組，1×10－7mmol/L），各給藥組劑量參考本課題組的前期研究[10]。各組均先加入相應藥物預處理1 h 后，再以25 mmol/L D-無水葡萄糖干預72 h。干預結束后，棄去上清液，用無血清培養(yǎng)基清洗細胞3次，然后加入終濃度為1 μmol/L 的熒光探針FerroOrange 工作液適量，再置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min 后，采用熒光顯微鏡觀察細胞，并采集圖片，采用Image J 分析熒光強度，紅色熒光越強表示Fe2+水平越高。實驗重復3次。

2.1.2 胰島β細胞中GPX4、COX2蛋白表達的檢測

采用Western blot 法進行檢測。將細胞分為正常對照組（只加細胞不加藥）、模型組（D-無水葡萄糖，25 mmol/L）、1，8-桉葉油素組（0.5 μmol/L）、Erastin 組（20 μmol/L）、Ferrostatin-1 組（20 μmol/L）、1，8-桉葉油素+Erastin 組（0.5 μmol/L 1，8-桉葉油素+20 μmol/L Erastin）、1，8-桉葉油素+Ferrostatin-1 組（0.5 μmol/L 1，8-桉葉油素+20 μmol/L Ferrostatin-1），各給藥組劑量參考本課題組的前期研究[10—11]。各組均先加入相應藥物預處理1 h后，再以25 mmol/L D-無水葡萄糖干預72 h。收集細胞，提取總蛋白，采用BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度，蛋白經煮沸變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜，以5%牛血清白蛋白溶液封閉后，分別加入一抗（GPX4、COX2 的稀釋度均為1∶2 000，β-actin 的稀釋度為1∶10 000），于4 ℃孵育過夜；加入相應二抗（稀釋度為1∶10 000），室溫孵育2 h；洗膜后，以ECL 化學發(fā)光試劑進行顯色，置于凝膠成像系統成像，再以Image-Lab 軟件進行分析，以目的蛋白與β-actin 的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.2 動物實驗

2.2.1 分組、造模與給藥

小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機選取20 只，分為正常對照組和1，8-桉葉油素毒性研究組（200 mg/kg），每組10 只，然后給予普通飼料飼養(yǎng)。另取40 只小鼠給予高糖高脂飼料飼養(yǎng)2個月，形成胰島素抵抗后，采用小劑量多次注射的方式，對小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（35 mg/kg），隔天注射1次，一共注射4次。第4次注射結束1周后檢測小鼠空腹血糖，當小鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L時，表明2 型糖尿病模型小鼠造模成功[12]。將造模成功的小鼠隨機分為模型組，1，8-桉葉油素低、高劑量組（50、200 mg/kg，劑量參考文獻[13]設置）、維生素E 組（17.5 mg/kg，根據人與動物的等效劑量換算而得），每組10只。正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組小鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續(xù)8周。

2.2.2 小鼠空腹血糖檢測及取材

末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h后檢測各組小鼠空腹血糖；然后處死小鼠，分離其胰腺組織，部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 小鼠胰腺組織病理形態(tài)學觀察

取“2.2.2”項下固定于4%多聚甲醛的小鼠胰腺組織適量，經石蠟包埋、切片、梯度脫水等處理后，進行蘇木精-伊紅（HE）染色以及糖原沉積染色，采用顯微鏡進行觀察，并拍照。

2.2.4 小鼠胰腺組織中鐵含量的檢測

取“2.2.2”項下凍存的小鼠胰腺組織（約10 mg），加入適量生理鹽水置于冰上剪碎并勻漿，以2 500 r/min離心 10 min，取上清液，根據相應試劑盒說明書方法操作，檢測小鼠胰腺組織中鐵含量。

2.2.5 小鼠胰腺組織中GPX4、COX2蛋白表達的檢測

采用Western blot 法進行檢測。取“2.2.2”項下凍存的胰腺組織（約10 mg），添加預冷的蛋白裂解液（含1%PMSF）于冰上剪碎，裂解30 min，超聲處理2 s×5次；于4 ℃條件下以12 000 r/min 離心20 min，取上清液，然后按“2.1.2”項下方法檢測小鼠胰腺組織中GPX4、COX2蛋白表達水平。

2.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 細胞實驗結果

3.1.1 1，8-桉葉油素對胰島β細胞中Fe2+水平的影響

與正常對照組（21.12±3.60）比較，模型組（50.07±0.49）細胞中Fe2+水平顯著升高（P＜0.05），甘露醇組（24.43±2.92）細胞中Fe2+水平變化差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，1，8-桉葉油素低、高劑量組（分別為30.04±2.97、16.51±1.70）以及維生素E 組（22.56±3.52）細胞中Fe2+水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 各組胰島β細胞中Fe2+的熒光顯微圖

3.1.2 1，8-桉葉油素對胰島β細胞中GPX4、COX2蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組胰島β 細胞中GPX4 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），COX2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，1，8-桉葉油素組、Ferrostatin-1 組、1，8-桉葉油素+Ferrostatin-1 組胰島β 細胞中上述兩種蛋白表達水平均顯著逆轉（P＜0.05）；Erastin組、1，8-桉葉油素+Erastin組胰島β細胞中上述兩種蛋白表達水平差異無統計學意義。與1，8-桉葉油素組比較，1，8-桉葉油素+Erastin組胰島β細胞中GPX4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），COX2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。結果見圖2、表1、表2。

表1 鐵死亡誘導劑Erastin 對胰島β 細胞中GPX4、COX2蛋白表達的影響（±s，n＝3）

表1 鐵死亡誘導劑Erastin 對胰島β 細胞中GPX4、COX2蛋白表達的影響（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與1，8-桉葉油素組比較，P＜0.05。

COX2/β-actin 0.31±0.04 0.71±0.13a 0.39±0.03b 0.60±0.17 0.68±0.11c組別正常對照組模型組1，8-桉葉油素組Erastin組1，8-桉葉油素+Erastin組GPX4/β-actin 0.69±0.18 0.34±0.08a 0.64±0.09b 0.31±0.06 0.26±0.05c

表2 鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 對胰島β 細胞中GPX4、COX2蛋白表達的影響（±s，n＝3）

表2 鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 對胰島β 細胞中GPX4、COX2蛋白表達的影響（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組1，8-桉葉油素組Ferrostatin-1組1，8-桉葉油素+ Ferrostatin-1組GPX4/β-actin 0.70±0.11 0.31±0.09a 0.80±0.15b 0.73±0.12b 0.64±0.13b COX2/β-actin 0.37±0.04 0.62±0.08a 0.38±0.06b 0.29±0.13b 0.32±0.07b

圖2 各組胰島β 細胞中GPX4、COX2 蛋白表達的電泳圖

3.2 動物實驗結果

3.2.1 1，8-桉葉油素對模型小鼠血糖及胰腺組織病理形態(tài)的影響

與正常對照組[（4.92±0.38） mmol/L]比較，模型組小鼠空腹血糖[（15.58±4.35） mmol/L]顯著升高（P＜0.05），1，8-桉葉油素毒性研究組小鼠空腹血糖[（5.38±0.84） mmol/L]差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，1，8-桉葉油素低、高劑量組[分別為（14.85±4.27）、（18.75±5.59） mmol/L]和維生素E 組[（17.75±2.58）mmol/L]小鼠空腹血糖差異無統計學意義（P＞0.05）。HE 染色以及糖原染色結果顯示，正常對照組和1，8-桉葉油素毒性研究組小鼠胰島呈橢圓形，結構規(guī)整、邊緣清晰、排列緊密，未發(fā)現病理變化；模型組小鼠胰島結構不完整、邊界模糊，內有空泡浸潤，糖原沉積較多；1，8-桉葉油素各劑量組和維生素E 組小鼠胰島組織結構相比模型組恢復完整，形態(tài)有所改善。結果見圖3、圖4。

圖3 各組小鼠胰腺組織HE染色顯微圖（HE染色）

圖4 各組小鼠胰腺組織糖原沉積染色顯微圖

3.2.2 1，8-桉葉油素對模型小鼠胰腺組織中鐵含量的影響

與正常對照組[（13.97±4.85） μmol/mg pro]比較，模型組小鼠胰腺組織中鐵含量[（26.04±4.83） μmol/mg pro]顯著升高（P＜0.05），1，8-桉葉油素毒性研究組小鼠胰腺組織中鐵含量[（15.55±4.83） μmol/mg pro]差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，1，8-桉葉油素低、高劑量組[分別為（15.78±2.62）、（16.50±5.4） μmol/mg pro]和維生素E 組[（14.56±2.78） μmol/mg pro]小鼠胰腺組織中鐵含量均顯著降低（P＜0.05）。

3.2.3 1，8-桉葉油素對模型小鼠胰腺組織中GPX4、COX2蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠胰腺組織中GPX4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），COX2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；1，8-桉葉油素毒性研究組小鼠胰腺組織中上述蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，1，8-桉葉油素高劑量組和維生素E 組小鼠胰腺組織中上述蛋白表達水平均顯著逆轉（P＜0.05）。結果見圖5、表3。

表3 各組小鼠胰腺組織中GPX4、COX2蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

表3 各組小鼠胰腺組織中GPX4、COX2蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組1，8-桉葉油素低劑量組1，8-桉葉油素高劑量組維生素E組1，8-桉葉油素毒性研究組GPX4/β-actin 0.93±0.26 0.35±0.04a 0.76±0.40 1.04±0.27b 0.82±0.37b 0.73±0.46 COX2/β-actin 0.21±0.08 0.84±0.26a 0.74±0.46 0.34±0.06b 0.34±0.21b 0.30±0.07

4 討論

鐵死亡是一種鐵依賴的脂質過氧化物累積引起的細胞程序性死亡，胰島β 細胞鐵死亡是2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展的病理基礎與惡化的始動環(huán)節(jié)[14]。保護胰島β細胞免于損傷、恢復胰島功能是預防與治療2型糖尿病的關鍵[15]。研究顯示，COX2 的過表達是鐵死亡的標志[16]。GPX4 是主要的膜脂修復酶，也是鐵死亡的重要負調控因子，其活性降低，可造成膜脂上活性氧的積累，驅使脂質過氧化終產物丙二醛與蛋白質和DNA 形成復合物，進一步誘導細胞鐵死亡的發(fā)生[17]。本研究細胞實驗結果顯示，高糖環(huán)境可誘導胰島β細胞中Fe2+水平增加，鐵死亡相關蛋白GPX4 蛋白表達下調，COX2 蛋白表達上調；同樣的，動物實驗結果顯示，模型組小鼠胰島結構不完整，且糖原沉積較多，胰腺組織中鐵含量增加，GPX4蛋白表達下調，COX2 蛋白表達上調。經1，8-桉葉油素干預后，胰島β細胞以及小鼠胰腺組織中上述指標均有所改善，這提示1，8-桉葉油素對2 型糖尿病誘導的胰島β細胞鐵死亡具有明顯的改善作用。

本研究采用鐵死亡誘導劑Erastin 及鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 進一步驗證了1，8-桉葉油素對2 型糖尿病胰島β 細胞鐵死亡的抑制作用機制。結果顯示，Erastin與1，8-桉葉油素聯合作用胰島β細胞后，可抑制1，8-桉葉油素的作用；相反，Ferrostatin-1 單獨使用或與1，8-桉葉油素聯合作用后，均能顯著抑制高糖環(huán)境誘導的胰島β 細胞鐵死亡。這提示，1，8-桉葉油素可能是通過抑制鐵死亡信號改善2型糖尿病誘導的胰島β細胞損傷。

綜上所述，1，8-桉葉油素對2 型糖尿病胰島β 細胞損傷具有明顯的改善作用，其作用機制可能與降低細胞內鐵沉積以及調控鐵死亡相關蛋白有關。