自噬在α粒子輻射誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用

楊 莉，邵 帥，武云云，王成芳，曲功霖，閆皓宇，茍 巧

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088)

肺癌作為一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類的身體健康。放射性氡及其子體是非吸煙者患肺癌的第一大危險(xiǎn)因素[1]。氡的主要危害是短壽命子體衰變時(shí)不斷發(fā)射出的高能α粒子，這些α粒子會(huì)滯留在人體的呼吸道表面，對(duì)局部細(xì)胞產(chǎn)生照射，從而誘發(fā)肺癌[2]。隨著氡暴露與肺癌發(fā)生之間存在的密切關(guān)系被揭示，α粒子輻射致肺癌的分子機(jī)制研究越來(lái)越受到重視。

自噬是一種進(jìn)化上古老且高度保守的分解代謝過(guò)程，主要通過(guò)各種細(xì)胞器形成自噬體并包裹細(xì)胞內(nèi)待降解蛋白及受損細(xì)胞器與溶酶體融合成為自噬溶酶體，降解內(nèi)容物，并將其循環(huán)利用或用于促進(jìn)代謝途徑的過(guò)程。自噬對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有雙重調(diào)節(jié)作用，既能抑制腫瘤的發(fā)生，減少細(xì)胞的DNA損傷和惡性增殖；亦能對(duì)腫瘤起保護(hù)作用，幫助腫瘤細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)能量匱乏的環(huán)境下生存[3]。由于自噬在不同的生物學(xué)背景(癌癥類型)下可以產(chǎn)生抑癌或致癌作用，目前自噬對(duì)癌癥發(fā)生、發(fā)展的意義仍有爭(zhēng)議。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)α粒子輻射誘發(fā)肺癌分子機(jī)制的研究主要圍繞癌基因過(guò)表達(dá)[4]，抑癌基因突變或表達(dá)下調(diào)[5-6]，DNA 損傷修復(fù)系統(tǒng)缺陷[7]，氧化/抗氧化失衡[2，8]幾方面進(jìn)行，關(guān)于自噬在α粒子輻射誘發(fā)肺癌過(guò)程中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D、α粒子照射BEP2D后的第24代細(xì)胞RH24(具有一定的惡性表型)及其惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞株BERP35T-1(具有明確的惡性表型)，分析α粒子輻射誘發(fā)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中細(xì)胞自噬水平的變化；選擇惡性程度最高的BERP35T-1細(xì)胞，分別用自噬抑制劑CQ 和自噬激活劑Rapa 抑制和促進(jìn)該細(xì)胞自噬后，檢測(cè)細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力變化，旨在從自噬影響細(xì)胞惡性表型(增殖、侵襲和遷移能力)的角度，探討α粒子輻射誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器

胎牛血清、LHC-8 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；LC3B、P62 抗體購(gòu)自Abcam 公司；LC3A/B 抗體購(gòu)自Cell Signaling 公司；β-actin抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；GAPDH 抗體購(gòu)自上海Abmart 公司；蛋白定量試劑盒、硝酸纖維素膜、濃縮電泳液及轉(zhuǎn)膜液均購(gòu)自北京普利萊公司；蛋白裂解液、發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；牛血清蛋白、胰蛋白酶和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；CQ 購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；Rapa 購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；均用DMSO 助溶，作用細(xì)胞時(shí)對(duì)照組培養(yǎng)基中均含等體積DMSO。Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司。Primo Vert 倒置顯微鏡為德國(guó)蔡司公司產(chǎn)品，ChemiDoc XRS+發(fā)光檢測(cè)成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-rad 公司產(chǎn)品，JEM-1400 Plus 透射電子顯微鏡為日本電子公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)

BEP2D 細(xì)胞為經(jīng)HPV-18 永生化的人支氣管上皮細(xì)胞；RH24細(xì)胞為采用238PuO2沉積源α粒子1.5 Gy劑量照射BEP2D 細(xì)胞后的第24 代細(xì)胞，具有一定的惡性表型，但不能在裸鼠身上成瘤；BERP35T-1惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系是用238PuO2沉積源α粒子1.5 Gy 劑量照射BEP2D細(xì)胞，連續(xù)傳35代后接種裸鼠，從成瘤細(xì)胞中克隆出來(lái)，具有明確的惡性表型，經(jīng)病理專業(yè)人員鑒定為肺鱗癌細(xì)胞[9-11]。BEP2D、RH24、BERP35T-1 細(xì)胞均由原軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所四室周平坤和胡迎春老師惠贈(zèng)。用LHC-8無(wú)血清培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。BEP2D、RH24、BERP35T-1細(xì)胞每3 d更換1次培養(yǎng)基，每周傳代1次。

1.3 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3B和P62的表達(dá)

分別收獲指數(shù)生長(zhǎng)期的BEP2D、 RH24 和BERP35T-1 細(xì)胞，或用不同濃度自噬抑制劑CQ(0、40、60 μmol/L)及自噬激活劑Rapa(0、12.5、25 pmol/L)分別作用BERP35T-1 細(xì)胞48 h，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，震蕩5 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，吸取上清液于-20 ℃保存，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)EP 管30 μg 蛋白，100 ℃變性5 min。配制不同濃度的分離膠和濃縮膠，各凝膠孔上樣量保持一致；電壓設(shè)置恒壓60 V 電泳30 min，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電壓至80 V 電泳90 min；轉(zhuǎn)膜設(shè)置恒壓110 V，20 min，分離分子質(zhì)量20 ku 以下的蛋白，20 min結(jié)束后取出小分子量膠和膜，再繼續(xù)轉(zhuǎn)膜50 min，在冰水浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；在室溫中用BSA封閉液封閉1 h；加入LC3B、P62、GAPDH 對(duì)應(yīng)的一抗及BSA 封閉液在4 ℃中孵育過(guò)夜，用TTBS 洗膜3 次；在室溫中用對(duì)應(yīng)物種的二抗及BSA 封閉液孵育1 h，用TTBS 洗膜3 次，用發(fā)光顯跡液在凝膠成像儀上顯色。使用相應(yīng)的內(nèi)參(β-actin/GAPDH)作為對(duì)照，ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算LC3B和P62的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體的變化

使用0.25%的胰蛋白酶分別消化BEP2D、RH24和BERP35T-1 細(xì)胞5 min，使用含10% FBS 的培養(yǎng)基終止消化，1 200 r/min 離心5 min 后去除上清，加入2.5%的戊二酸磷酸鹽緩沖液(pH為7.2～7.4)1 mL固定過(guò)夜。此后由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部電鏡平臺(tái)進(jìn)行制樣，具體步驟為：使用0.1 mol/L 的PBS 緩沖液洗滌樣品3 次，每次10 min；再用1% OsO4-PBS 固定1 h，用ddH2O洗3次，每次15 min；再用30%、50%、70%、95%丙酮進(jìn)行梯度脫水，接著用100%乙醇脫水3 次，每次10 min；然后將樣品以1∶1體積比轉(zhuǎn)移進(jìn)丙酮中浸透3 h；將標(biāo)本放于包埋介質(zhì)中，37 ℃加熱24 h、48 ℃加熱24 h、60 ℃加熱24 h 聚合；然后將其切成50～70 nm 厚的薄片，用乙酸鈾酰和堿性檸檬酸鉛雙染色15 min，最后使用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體并拍照，根據(jù)其形態(tài)特征計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)自噬小體的數(shù)量。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況

將指數(shù)生長(zhǎng)期的BERP35T-1細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，24 h 后，用不同濃度CQ(0、40、60 mmol/L)及Rapa(0、25 pmol/L)分別作用BERP35T-1 細(xì)胞48 h，每個(gè)濃度點(diǎn)設(shè)立6 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞用含有10%CCK-8 的LHC-8 培養(yǎng)基于96 孔板中37 ℃孵育2 h后，室溫下振蕩孵育5 s，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度值D(450)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=D(450)檢測(cè)組/D(450)空白對(duì)照組×100%

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

提前一天將基質(zhì)膠從-20 ℃冰箱中取出放置于4 ℃冰箱解凍，將基質(zhì)膠和Opti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶8 混合稀釋，向Transwell 小室中加入100 μL 的基質(zhì)膠稀釋液，置于培養(yǎng)箱中聚合1 h。BERP35T-1細(xì)胞經(jīng)CQ(0、40、60 μmol/L)及Rapa(0、25 pmol/L)分別作用后，用0.25%胰蛋白酶消化5 min，再使用含10% FBS 的培養(yǎng)基終止消化，1 200 r/min 離心5 min去除上清，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，加入Opti-MEM 稀釋至3×105個(gè)/μL，取100 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL 的LHC-8 培養(yǎng)基，放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后將小室放入無(wú)水甲醇中固定并透化30 min，ddH2O清洗3次后用Gimsa染液染色10 min，用棉簽輕輕擦拭上室未穿過(guò)的細(xì)胞。在100 倍鏡下每組隨機(jī)選取3 個(gè)視野進(jìn)行拍照，并用ImageJ 軟件計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

將BERP35T-1細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%～100%，用200 μL槍頭垂直劃痕。使用PBS 清洗脫落細(xì)胞，用CQ(0、40、60 μmol/L)作用0、12 h 和24 h 或用Rapa(0、25 pmol/L)作用0 和12 h，將細(xì)胞置于100 倍鏡下于同一視野拍照記錄劃痕愈合狀態(tài)，每組觀察6 個(gè)視野，用ImageJ 軟件計(jì)算不同濃度CQ 或Rapa 作用不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕寬度，并計(jì)算劃痕閉合率。

劃痕閉合率=(初始劃痕寬度-當(dāng)前劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 BEP2D、RH24、BERP35T-1細(xì)胞的自噬水平

LC3B是LC3四種亞型中在肺組織中表達(dá)差異最為顯著的蛋白[12]，LC3B-I 在胞漿中產(chǎn)生，在ATG7 等作用下和磷脂酰乙醇胺結(jié)合成LC3B-II，LC3B-II在自噬體形成階段被連接在自噬體外膜上，P62 作為自噬底物與LC3B-II 結(jié)合，在自噬溶酶體形成時(shí)P62 被降解[13]，因此，可以利用LC3B-II 和LC3B-I 蛋白的比值及P62 蛋白的表達(dá)水平代表細(xì)胞的自噬水平[14-15]。Western blot法檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，與BEP2D細(xì)胞相比，RH24 細(xì)胞及惡性轉(zhuǎn)化的BERP35T-1 細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-II/I 的比值顯著升高(P＜0.01)，其底物P62 的表達(dá)減弱(P＜0.01)。且如圖2 所示，用透射電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)，與BEP2D 細(xì)胞相比，RH24 細(xì)胞及惡性轉(zhuǎn)化的BERP35T-1細(xì)胞內(nèi)單位面積自噬小體數(shù)量增加(P＜0.01)。說(shuō)明在α粒子輻射誘發(fā)BEP2D細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，細(xì)胞自噬水平升高。

圖1 Western blot法檢測(cè)BEP2D、RH24、BERP35T-1細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B及P62的表達(dá)

圖2 透射電鏡觀察和分析BEP2D、RH24和BERP35T-1細(xì)胞中的自噬小體

2.2 自噬抑制劑CQ抑制BERP35T-1細(xì)胞自噬

CQ通過(guò)破壞溶酶體的酸性環(huán)境，阻止自噬小體和溶酶體融合，從而抑制自噬。在CQ的作用下，自噬體上的LC3B-II和自噬底物P62均不能被溶酶體降解，導(dǎo)致LC3B-II 和P62 蛋白的積累[16]。因此，CQ 抑制自噬的能力越強(qiáng)，LC3B-II 和P62 的蛋白水平越高，LC3B-II/I的比值也越高[17]。為確定CQ抑制自噬的合適濃度，將40 和60 μmol/L CQ 分別作用BERP35T-1 細(xì)胞48 h 后，經(jīng)Western blot 檢測(cè)LC3B、P62、GAPDH的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，40和60 μmol/L CQ 作用48 h后BERP35T-1細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-II/I 水平明顯升高(P＜0.05)，自噬相關(guān)蛋白P62的表達(dá)水平也相繼升高(P＜0.01)，表明40和60 μmol/L CQ 均可顯著抑制BERP35T-1 細(xì)胞自噬，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用40 和60 μmol/L CQ 作為抑制自噬的實(shí)驗(yàn)濃度。

圖3 不同濃度CQ作用48 h對(duì)BERP35T-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 自噬抑制劑CQ 對(duì)BERP35T-1 細(xì)胞增殖能力的影響

將40和60 μmol/L CQ 作用BERP35T-1細(xì)胞48 h后，存活率檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，40 和60 μmol/L CQ 處理48 h 組細(xì)胞存活率均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明CQ 可通過(guò)抑制自噬降低BERP35T-1細(xì)胞的惡性增殖能力。

圖4 不同濃度CQ作用48 h對(duì)BERP35T-1細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 自噬抑制劑CQ 對(duì)BERP35T-1 細(xì)胞侵襲能力的影響

將40和60 μmol/L CQ 作用BERP35T-1細(xì)胞48 h后，用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果如圖5 所示，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，40 和60 μmol/L CQ 作用48 h 后BERP35T-1 細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P＜0.01)。說(shuō)明CQ 可能通過(guò)抑制自噬降低BERP35T-1細(xì)胞的侵襲能力。

圖5 不同濃度CQ作用48 h對(duì)BERP35T-1細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 自噬抑制劑CQ 對(duì)BERP35T-1 細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的劃痕閉合率，結(jié)果如圖6 所示，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，40和60 μmol/L CQ 作用12 和24 h 后，BERP35T-1 細(xì)胞的劃痕閉合率均顯著降低，且CQ 濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，降低越顯著(P＜0.05)。說(shuō)明CQ可通過(guò)抑制自噬降低BERP35T-1細(xì)胞的遷移能力。

圖6 不同濃度CQ作用12和24 h對(duì)BERP35T-1細(xì)胞遷移能力的影響

2.6 自噬激活劑Rapa促進(jìn)BERP35T-1細(xì)胞自噬

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬通路的上游蛋白，mTOR 可與不同的蛋白質(zhì)相互作用形成兩個(gè)不同的復(fù)合物，分別為mTORC1 和mTORC2，而Rapa 可以抑制mTORC1進(jìn)而促進(jìn)自噬[18]。為確定Rapa 激活自噬的合適濃度，將12.5和25 pmol/L的Rapa作用BERP35T-1細(xì)胞48 h后，經(jīng)Western blot 檢測(cè)LC3B、P62、GAPDH 的表達(dá)水平。結(jié)果如圖7 所示，與對(duì)照組相比，12.5 pmol/L Rapa 對(duì)BERP35T-1細(xì)胞內(nèi)LC3B-II/I 和P62蛋白表達(dá)水平的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；25 pmol/L Rapa 處理組BERP35T-1 細(xì)胞內(nèi)LC3B-II/I 水平明顯升高(P＜0.05)，P62 水平降低(P＜0.05)，表明25 pmol/L Rapa 可以顯著激活細(xì)胞自噬，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用25 pmol/L Rapa作為激活自噬的實(shí)驗(yàn)濃度。

圖7 不同濃度Rapa作用48 h對(duì)BERP35T-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7 自噬激活劑Rapa 對(duì)BERP35T-1 細(xì)胞增殖能力的影響

將25 pmol/L Rapa 作用BERP35T-1 細(xì)胞48 h 后，用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的存活率，結(jié)果如圖8 所示，與對(duì)照組(0 mmol/L)相比，25 pmol/L Rapa處理組細(xì)胞存活率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明Rapa 可通過(guò)促進(jìn)自噬提高BERP35T-1 細(xì)胞的惡性增殖能力。

圖8 25 pmol/L Rapa作用48 h對(duì)BERP35T-1細(xì)胞增殖能力的影響

2.8 自噬激活劑Rapa 對(duì)BERP35T-1 細(xì)胞侵襲能力的影響

將25 pmol/L Rapa 作用BERP35T-1 細(xì)胞48 h 后，用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果如圖9所示，與對(duì)照組相比，25 pmol/L Rapa 作用后，BERP35T-1 細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯增加(P＜0.01)。說(shuō)明Rapa 可通過(guò)促進(jìn)自噬從而提高BERP35T-1 細(xì)胞的侵襲能力。

圖9 Rapa作用48 h對(duì)BERP35T-1細(xì)胞侵襲能力的影響

2.9 自噬激活劑Rapa 對(duì)BERP35T-1 細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的劃痕閉合率，結(jié)果如圖10所示，與對(duì)照組相比，25 pmol/L Rapa 作用12 h 后BERP35T-1 細(xì)胞劃痕閉合率顯著降低(P＜0.01)。說(shuō)明Rapa 可能通過(guò)促進(jìn)自噬提高BERP35T-1 細(xì)胞的遷移能力。

3 討 論

在多種類型的腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中，自噬水平升高。如在肝癌細(xì)胞和組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B-II的表達(dá)顯著增強(qiáng)[19]；在肺腺癌細(xì)胞中，LC3B-II/I 的比值顯著升高，且P62表達(dá)顯著降低[20]；王振波[21]通過(guò)免疫組織化學(xué)分析等方法研究表明，食管鱗癌中自噬相關(guān)蛋白LC3A的表達(dá)明顯高于正常組織，且LC3A高表達(dá)與較差的患者總生存率相關(guān)，其低表達(dá)的患者放療效果更顯著；喬秋江[22]研究發(fā)現(xiàn)，LC3B-II/I 的比值和自噬小體數(shù)量與腦膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)呈正相關(guān)，與患者5年生存率呈負(fù)相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，與BEP2D細(xì)胞相比，RH24 細(xì)胞及BERP35T-1 細(xì)胞內(nèi)，LC3B-II/I蛋白比值升高，P62 表達(dá)降低，自噬體數(shù)量增加，說(shuō)明在α粒子輻射誘發(fā)BEP2D 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，細(xì)胞自噬水平增高；此外，具有明確的惡性表型的BERP35T-1細(xì)胞自噬水平高于RH24細(xì)胞(具有一定的惡性表型)，提示該過(guò)程中自噬水平與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度呈正相關(guān)。

已有研究表明，細(xì)胞自噬在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。例如，Cai 等[23]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活PTEN/AKT/FOXO3a/Atg7 軸可以誘導(dǎo)內(nèi)源性自噬，進(jìn)而導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生。抑制自噬可使腫瘤細(xì)胞的惡性表型減弱。例如，胡劍翀[24]的研究表明，CQ以濃度和時(shí)間依賴的方式抑制肝細(xì)胞癌Hep3B細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，在抑制自噬的同時(shí)也阻礙了腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程；Hamurcu 等[25]發(fā)現(xiàn)，沉默LC3和Beclin-1基因，從而抑制自噬，可顯著抑制三陰性乳腺癌模型的細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)凋亡增加；在前列腺癌和黑色素瘤的小鼠模型中，敲除自噬相關(guān)基因ATG5或ATG7后腫瘤進(jìn)展減緩[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)，40 和60 mmol/L CQ 抑制細(xì)胞自噬后，BERP35T-1細(xì)胞的存活率、侵襲數(shù)和劃痕閉合率均明顯降低，說(shuō)明抑制自噬可降低BERP35T-1細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。反之，促進(jìn)自噬可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性表型。如Han 等[27]研究表明，乙酰輔酶A可通過(guò)增強(qiáng)自噬促進(jìn)Snail蛋白的乙?；兄贙ARS-LKB1 共突變的肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移；RAS突變使自噬增加，增強(qiáng)了腫瘤的生長(zhǎng)、存活以及惡性轉(zhuǎn)化，與結(jié)腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)展相關(guān)[28]；糖原-相互作用蛋白1(GNIP1)作為支架蛋白，可通過(guò)不同結(jié)構(gòu)域與Beclin 1和LC3B結(jié)合，促進(jìn)自噬蛋白復(fù)合物的形成誘導(dǎo)自噬，從而增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)，25 pmol/L Rapa促進(jìn)細(xì)胞自噬后，BERP3T-1 細(xì)胞的存活率、侵襲數(shù)和劃痕閉合率均顯著增加，表明增強(qiáng)自噬可提高BERP35T-1細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。這些結(jié)果提示α粒子照射BEP2D 細(xì)胞后，細(xì)胞自噬水平的增高可能促進(jìn)了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

綜上所述，在α 粒子輻射誘發(fā)人支氣管細(xì)胞BEP2D惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，細(xì)胞自噬增強(qiáng)，可能由此提高細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的能力，從而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。自噬抑制劑已被證明是許多體內(nèi)抗腫瘤治療的有用佐劑[29]，目前，CQ在臨床上主要用于慢性自身免疫性疾病以及人免疫缺陷病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒、非瘧疾感染等疾病的治療[30]。結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，CQ作為自噬抑制劑在氡等α粒子放射源致肺癌的化學(xué)防治方面可能具有一定的應(yīng)用前景。