細菌回復突變試驗菌株鑒定方法的比較

高 梅，湯連升，鄭智勇，馬 會，秦春雪，曹 沖

(山東省藥學科學院，山東 濟南 250101)

細菌回復突變試驗(Ames 試驗)作為一項體外遺傳毒性試驗，是食品、醫(yī)療器械、化妝品、化學品、農(nóng)藥和藥物等研發(fā)常規(guī)開展的毒理學試驗項目，目的是檢測受試物能否引起細菌堿基置換或移碼突變，從而評價其是否具有致突變性。

在Ames 試驗相關的國家和行業(yè)標準、技術規(guī)范和指導原則中[1-8]，均規(guī)定了應采用營養(yǎng)缺陷型菌株組合作為試驗菌株，組合方式一是鼠傷寒沙門氏菌菌株間進行組合，二是鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌進行組合。實驗室在進行Ames試驗時，多采用第一種組合，如TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 組 合[9-11]，TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535 組合[12-14]，TA97、TA98、TA100、TA102 組 合[15-16]，TA97a、TA98、TA100、TA102 組 合[17-18]，TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535、TA1537 組合[19]等。無論采用哪種組合，都需要對菌株特性進行鑒定，鑒定合格后才能用于正式試驗。GB 15193.4-2014、GBZ/T 240.8-2011、YY/T 0127.10-2009、YY/T 0870.1-2013、GB/T 15670.14-2017 和化妝品安全技術規(guī)范等標準和規(guī)范中，都規(guī)定需對菌株進行組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷(rfa 突變)鑒定、氨芐青霉素抗性(R因子)鑒定、四環(huán)素抗性(pAQ1質(zhì)粒)鑒定和uvrB修復缺陷型(紫外線敏感性)鑒定，但鑒定方法不盡相同，本文就這幾種菌株基因型鑒定的試驗方法進行比較分析，并對TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 等5 株試驗菌株進行了鑒定，以期為Ames試驗菌株鑒定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，由Molecular Toxicology公司提供。

1.2 主要試劑與儀器

牛肉膏、胰蛋白胨、瓊脂粉、結晶紫，均購于國藥集團化學試劑有限公司；D-生物素、L-組氨酸、氨芐青霉素、四環(huán)素，均購于北京索萊寶科技有限公司。

HFsafe-1500TE 型生物安全柜，購自上海力申科學儀器有限公司；SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱，購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；ZHWY-100B 型恒溫培養(yǎng)振蕩器，購自上海智城分析儀器制造有限公司；15 W 紫外線殺菌燈，購自廣東雪萊特光電科技股份有限公司。

1.3 菌株組合

Ames試驗相關的標準、規(guī)范和指導原則中，對試驗菌株組合要求不盡相同，見表1。食品國家標準GB 15193.4-2014、化學品國家標準GB/T 21786-2008、《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》中要求使用TA98、TA100、TA1535、TA97a 或TA97 或TA1537、TA102 或大腸桿菌WP2 uvrA 或大腸桿菌WP2 uvrA(pKM101)5 株菌株組合；口腔醫(yī)療器械行業(yè)標準YY/T 0127.10-2009、《化妝品安全技術規(guī)范》中要求使用TA97、TA98、TA100和TA102 4株菌株組合；化學品國家職業(yè)衛(wèi)生標準GBZ/T 240.8-2011、醫(yī)療器械行業(yè)標準YY/T 0870.1-2013 和農(nóng)藥國家標準GB/T 15670.14-2017則推薦使用4株菌株組合，需要時可增加菌株。

表1 Ames試驗相關的國家和行業(yè)標準、技術規(guī)范、指導原則

1.4 組氨酸缺陷型鑒定

1.4.1 試驗原理組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌生長需要組氨酸，其本身沒有合成組氨酸的能力，若培養(yǎng)基不含組氨酸，則菌株不能正常生長，只能在補充組氨酸的培養(yǎng)基上生長。

1.4.2 鑒定方法鑒定方法見表2?；痉椒ㄊ侵谱鲀煞N平板，一種同時含有L-組氨酸和D-生物素，另一種只含D-生物素。將菌株分別接種在兩種平板上，培養(yǎng)24 或48 h 觀察菌株是否生長，但平板制作方法和培養(yǎng)時間有所不同。

表2 組氨酸缺陷型鑒定試驗方法

在平板制作方面，食品、醫(yī)藥器械、化妝品、農(nóng)藥平板制作方法基本相同，在底層培養(yǎng)基中加入組氨酸和/或生物素溶液混合后倒平板，口腔醫(yī)療器械是將組氨酸和/或生物素溶液平鋪在底層培養(yǎng)基平板表面；在培養(yǎng)時間上，食品、醫(yī)療器械、農(nóng)藥要求在菌株接種后培養(yǎng)48 h觀察，口腔醫(yī)療器械、化妝品、化學品則要求培養(yǎng)24 h觀察。

參考食品試驗方法對TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 菌株進行鑒定。用移液器分別吸取0.1 mL菌液，使用涂布棒在含組氨酸和不含組氨酸的培養(yǎng)基平板上涂成一條帶，37 ℃培養(yǎng)48 h 觀察結果。同時，參考其他文件，也對菌株接種后培養(yǎng)24 h的生長情況進行了觀察。

1.5 脂多糖屏障缺陷鑒定

1.5.1 試驗原理具有脂多糖屏障缺陷(rfa 突變)的試驗菌株，表面一層脂多糖屏障缺損，細胞壁屏障功能喪失，通透性增加，結晶紫等一些大分子物質(zhì)與其接觸后，能穿透菌膜進入菌體，菌株的生長被抑制。

1.5.2 鑒定方法鑒定方法見表3?；痉椒ㄊ菍⒕号c0.1%的結晶紫溶液接觸24 h，觀察結晶紫是否能抑制菌株生長，但平板制作方法和結晶紫溶液與菌液接觸方法有所不同。

表3 脂多糖屏障缺陷鑒定試驗方法

食品、醫(yī)療器械和農(nóng)藥試驗方法相同，將0.1 mL菌液與營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基混合后制備平板，再放上濾紙片滴加結晶紫溶液；口腔醫(yī)療器械和化學品試驗方法基本相同，將菌液加到頂層培養(yǎng)基試管混合后平鋪到營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板表面，再放上浸過結晶紫溶液的濾紙片或者放上濾紙片后再滴加結晶紫溶液；化妝品則是將菌液于營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板表面劃線，將浸過結晶紫溶液的濾紙條與劃線處交叉放置。

參考食品試驗方法進行鑒定。用移液器吸取0.1 mL菌液，使用涂布棒在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基表面涂成一條帶，待其干后，將無菌濾紙片放入條帶中，并輕壓濾紙片，用移液器在濾紙片上滴加0.1%結晶紫溶液10 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結果。

1.6 氨芐青霉素抗性(R因子)鑒定

1.6.1 試驗原理試驗菌株若含R因子則具有氨芐青霉素抗性，與氨芐青霉素接觸后能照常生長，不含R因子則無氨芐青霉素抗性，生長會被抑制。

1.6.2 鑒定方法鑒定方法見表4?；痉椒ㄊ菍⒕号c氨芐霉素接觸，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察氨芐青霉素是否能夠抑制菌株生長，但在平板制備、菌液使用量和菌液與氨芐青霉素接觸的方法有所不同。食品、醫(yī)療器械、農(nóng)藥和化學品試驗方法相同，先將氨芐青霉素溶液在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，再交叉劃線菌液；化妝品是在氨芐青霉素平板上劃線接種0.1 mL菌液；口腔醫(yī)療器械則包括兩種平板方法，在使用營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板時，是將沾有氨芐青霉素溶液的濾紙條與菌液劃線處交叉放置。鑒定方法中只規(guī)定了氨芐青霉素的使用量，除化妝品技術規(guī)范外，都未規(guī)定劃線接種時菌液使用量。

表4 氨芐青霉素抗性鑒定試驗方法

參考食品試驗方法進行鑒定。用移液器吸取10 μL 0.8%的氨芐青霉素，用涂布棒在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基表面平板涂成一條帶，待其干后，將待測菌株0.1 mL 與條帶交叉處用涂布棒涂成一條帶，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結果。

1.7 四環(huán)素抗性(pAQ1質(zhì)粒)鑒定

1.7.1 試驗原理試驗菌株若含pAQ1 質(zhì)粒則對四環(huán)素有抗性，與四環(huán)素接觸后能照常生長，不含pAQ1質(zhì)粒則無四環(huán)素抗性，生長會被抑制。

1.7.2 鑒定方法鑒定方法見表5?；痉椒ㄊ菍⒕号c四環(huán)素接觸，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察四環(huán)素是否能夠抑制菌株生長，但平板制備、菌液使用量和菌液與四環(huán)素接觸方法有所不同。食品、醫(yī)療器械、農(nóng)藥試驗方法相同，先將四環(huán)素溶液和氨芐青霉素溶液在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，再交叉劃線接種菌液；化學品也是使用營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板，僅四環(huán)素與菌株接觸無需使用氨芐青霉素；化妝品是在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線接種0.1 mL 菌液；口腔醫(yī)療器械則包括兩種平板方法，在使用營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板時，也不使用氨芐青霉素與菌株接觸。鑒定方法中只規(guī)定了氨芐青霉素、四環(huán)素的使用量，除化妝品技術規(guī)范外，均未規(guī)定劃線接種時的菌液使用量。

表5 四環(huán)素抗性鑒定試驗方法

參考化學品和食品試驗方法進行鑒定。用移液器吸取10 μL 0.8%的四環(huán)素溶液，用涂布棒在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板表面涂成一條帶，待干后，將待測菌株0.1 mL 與條帶交叉處用涂布棒涂成一條帶，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結果。

1.8 uvrB修復缺陷型(紫外線敏感性)鑒定

1.8.1 試驗原理試驗菌株若具有uvrB突變，切除修復功能有缺陷，被紫外線照射后不能生長，具有野生型切除修復酶的菌株，具有損傷修復功能，被紫外線照射后照常生長。

1.8.2 鑒定方法食品、醫(yī)療器械、口腔醫(yī)療器械、化妝品、化學品、農(nóng)藥試驗方法一致，基本方法是在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板表面劃線接種菌液，然后用黑紙遮蓋住劃線的一半，紫外線照射后37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株能否生長。鑒定方法中規(guī)定了紫外線照射的強度、距離和時間，除化妝品技術規(guī)范外，均未定劃線接種時菌液使用量。

用移液器吸取0.1 mL菌液，用涂布棒在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基表面涂成一條帶，待其干后，用黑紙遮蓋涂布帶的一半，在距離平板33 cm 處用15 W 紫外線滅菌燈照射8 s，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結果。

2 結 果

2.1 組氨酸缺陷型鑒定

鑒定結果見圖1 和圖2。結果顯示，接種后培養(yǎng)48 h，TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 菌株在無組氨酸培養(yǎng)基平板上僅有自發(fā)回變菌落生長，而在有組氨酸培養(yǎng)基平板上生長出一條菌膜，表明5 株菌株生長均需要組氨酸。

圖1 組氨酸缺陷型鑒定結果(不含組氨酸平板)

圖2 組氨酸缺陷型鑒定結果(含組氨酸平板)

此外，在組氨酸缺陷型鑒定中，不同文件中培養(yǎng)時間要求不同，對TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535 菌株接種后培養(yǎng)24 h，結果顯示菌株在未添加組氨酸的平板上未見自發(fā)回變菌落生長，而在添加了組氨酸的平板上均生長出菌膜。

2.2 脂多糖屏障缺陷(rfa突變)鑒定

鑒定結果見圖3。結果顯示，TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 在濾紙片周圍均出現(xiàn)抑制環(huán)，說明5株菌株均對結晶紫敏感，為rfa突變型菌株。

圖3 脂多糖屏障缺陷鑒定結果

2.3 氨芐青霉素抗性(R因子)鑒定

鑒定結果見圖4。結果顯示，TA97a、TA98、TA100、TA102 與氨芐青霉素接觸后生長正常，說明這4 株菌株均含有R 因子，生長不被氨芐青霉素抑制；TA1535在氨芐青霉素帶附近生長被抑制，表明該菌株不含R因子。

圖4 氨芐青霉素抗性鑒定結果

2.4 四環(huán)素抗性(pAQ1質(zhì)粒)鑒定

鑒定結果見圖5。結果顯示，TA102 菌株與四環(huán)素接觸后生長正常，說明該菌株含有pAQ1 質(zhì)粒，生長不被四環(huán)素抑制；TA97a、TA98、TA100、TA1535在四環(huán)素條帶附近生長均被抑制，表明這4 株菌株不含pAQ1質(zhì)粒。

圖5 四環(huán)素抗性鑒定結果

2.5 uvrB修復缺陷型(紫外線敏感性)鑒定

鑒定結果見圖6。結果顯示，TA97a、TA98、TA100、TA1535菌株經(jīng)紫外線輻射后不生長，僅在未照射過的一半生長，說明這4 株菌株對紫外線敏感，有uvrB突變；TA102經(jīng)紫外線輻射后仍生長，說明該菌株對紫外線不敏感，具有完整的切除修復系統(tǒng)。

圖6 uvrB修復缺陷型鑒定結果

3 討 論

Ames試驗是采用原核細胞測試受試物能否致細菌基因突變的體外試驗，預測其致突變性和潛在的致癌作用。試驗菌株生長需要組氨酸或色氨酸，若培養(yǎng)基不含組氨酸或色氨酸，則菌株不能正常生長，菌株與有致突變作用的受試物作用后，回復突變?yōu)橐吧投哂泻铣山M氨酸或色氨酸的能力，從而回變菌落數(shù)增多，因此可以通過菌落數(shù)量來評價受試物是否有遺傳毒性。在使用5株菌株組合進行Ames試驗時，國內(nèi)實驗室較多的是組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA1535、TA97/TA97a、TA98、TA100 和TA102 組合[9-14]，較少使用色氨酸營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌WP2 uvrA[20]，國外實驗室使用此菌株頻率較高[21-23]。

Ames試驗中用到的菌株為突變型菌株，其某些特性易丟失或變異，以下情況應鑒定菌株的基因型：新購入菌株后；制備冷凍保存菌株時；重新挑選菌株時；當自發(fā)回變數(shù)不在正常范圍時；對標準誘變劑喪失敏感性時；使用主平板傳代時；用長期保存的菌株進行試驗時[1，3-6]。GB 15193.4-2014、GBZ/T 240.8-2011、YY/T 0127.10-2009、YY/T 0870.1-2013、GB/T 15670.14-2017 和化妝品安全技術規(guī)范等文件中[1-6]，均規(guī)定需對菌株進行組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷(rfa突變)鑒定、氨芐青霉素抗性(R因子)鑒定、四環(huán)素抗性(pAQ1 質(zhì)粒)鑒定和uvrB 修復缺陷型(紫外線敏感性)鑒定等基因型鑒定，并詳細地說明了各種試劑的配制及鑒定的具體操作方法。藥物指導原則中[8]要求菌株特性鑒定需符合要求，未介紹具體的試驗方法，ICH S2(R1)[24]和OECD TG471[25]中亦未規(guī)定相關鑒定方法。此外，氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性鑒定和紫外線敏感性鑒定試驗中，對接種時菌液的使用量規(guī)定也不盡相同，建議控制劃線接種的菌液量，均勻劃線或涂布，避免菌液分布不均勻?qū)е妈b定結果不準確。較其他文件，食品安全標準GB 15193.4-2014 還要求進行生物素缺陷型的鑒定。Maron 和Ames[26]建議紫外線敏感性鑒定中，不含R因子的菌株用紫外線照射6 s，而且用到的紫外線滅菌燈應定期監(jiān)測紫外線輻射照度；另外，他們認為不需要進行生物素需求試驗。雖然不同文件中鑒定方法不同，但是判定標準和鑒定結果相同[27]， TA97/TA97a、 TA98、 TA100、TA102 和TA1535 菌株生長均需組氨酸，均具有rfa 突變，除TA1535 外均具有氨芐青霉素抗性，除TA102外均對紫外線敏感和均無四環(huán)素抗性(見表6)。

表6 試驗菌株生物需特性鑒定結論

此外，除基因型鑒定外，還應進行自發(fā)回變、對誘變劑敏感性的生物特性鑒定[1-4]，各實驗室在參考文獻的基礎上，應建立自己實驗室的菌株自發(fā)回變菌落數(shù)和對陽性誘變劑的回變菌落數(shù)的歷史背景數(shù)據(jù)庫。其中，張慧君等[28]研究顯示多次傳代后會影響菌株的自發(fā)回變數(shù)，建議實驗室控制菌株傳代次數(shù)，必要時對傳代后用于試驗的菌株進行鑒定?？傊鱾€實驗室應規(guī)定好試驗菌株鑒定的試驗方法和鑒定頻率，只有菌株合格，才能為Ames 試驗結果的真實、可靠提供根本保障。