基于頂空氣相色譜-離子遷移譜的不同品種香稻米快速鑒別方法

卞景陽，孫興榮*，劉琳帥，邵凱，馮鵬，車野，胡禧熙，顧鑫，徐磊，李杰

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大慶分院，黑龍江大慶 163319；2.國家耐鹽堿水稻技術創(chuàng)新中心東北中心，黑龍江哈爾濱 163316）

水稻是世界上主要的糧食之一，黑龍江省水稻產(chǎn)量占全國水稻產(chǎn)量的近五分之一[1]。目前，人們不僅僅滿足于食品的營養(yǎng)與安全，更對食品的風味有更高的要求[2-3]。香氣是食品最重要的風味特征之一，是決定食品是否被消費者所接受的關鍵因素。香稻米深受消費者喜愛，具有濃郁的香味，多種微量元素含量高，是一種高營養(yǎng)價值的稻米[4]。香味是香稻米品種最重要的品質性狀之一，因此探究不同香稻米品種中揮發(fā)性風味物質，可實現(xiàn)對不同品種香稻米的品質評價，對香稻米的育種和開發(fā)具有重要的意義。

目前，許多分析技術已被開發(fā)用于評價不同樣品的揮發(fā)性成分以及樣品的鑒定分析。然而，這些傳統(tǒng)方法的樣品前處理的提取過程耗時較長，無法實現(xiàn)樣品的快速分析，如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質譜（liquid chromatograph-mass spectromete，LC-MS）、氣相色譜-質譜（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）和超高液相色譜-串聯(lián)質譜（super-high performance liquid chromatography-mass spectrum in series，UPLC-MS）。因此，亟需開發(fā)一種全新的、綠色的、無預處理的、快速、高靈敏度的光譜分析方法。氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是由氣相色譜和離子遷移譜組成的一種可用于對高揮發(fā)性的有機化合物總量（volatile organic compounds，VOCs）進行評估分析和精確定量預測的超靈敏分析預測技術，具有快速分析能力。氣相色譜（gas chromatography，GC）是測定揮發(fā)性物質的常用方法，離子遷移譜（ion mobility spectrumetry，IMS）是根據(jù)氣體離子通過電場時不同的遷移速率來分離離子。兩種方法結合時，先用GC 預分離，控制分析物的濃度，分離雜質，再用IMS 進行分離。兩次分離得到的停留時間和遷移時間可以準確地確定分析物的二維特性[5-7]。相比傳統(tǒng)的食品風味物質分析方法如電子舌、電子鼻[8-9]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法、氣相色譜-吸聞法、氣相色譜-質譜/吸聞法[10-12]，GC-IMS 具有檢測速度快、靈敏度高、操作簡單、樣品制備步驟簡單等優(yōu)點[13-14]。

目前氣相色譜-離子遷移譜在風味物質分析、產(chǎn)品鑒別、品種溯源等領域得到了很好的應用。Zhang等[15]采用氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）和氣相色譜-質譜（GC-MS）對青稞在生、洗、漂、預冷、冷凍、蒸、煮、煎加工后的揮發(fā)性物質成分進行評價，證實了通過GC-IMS 可以快速可視化和識別綠色小麥樣品的揮發(fā)性成分，并根據(jù)揮發(fā)性成分的差異對樣品進行明確的分類。He 等[16]利用頂空-高效氣相色譜-離子遷移譜（headspace-gas chromatography-ion mobility spectroscopy，HS-GC-IMS）檢測不同產(chǎn)地麥冬特征風味化合物，快速鑒別了浙江省三門市、慈溪市兩產(chǎn)地的麥冬。Zhang等[17]采用氣相色譜-離子遷移譜技術對黑芝麻不同加工階段的加工產(chǎn)物進行鑒別。利用儀器內置的數(shù)據(jù)處理軟件對樣品的揮發(fā)性成分響應數(shù)據(jù)進行處理，識別不同的成分，鑒定出20 種化合物。Pu 等[18]采用氣相色譜-離子遷移譜和感覺支配時間的動態(tài)感官評價方法，研究白面包在口腔加工過程中的香氣釋放和知覺。Yuan 等[19]建立一種基于HS-GC-IMS 的綠色、快速的百合鑒別方法，為百合不同物種的鑒別提供科學數(shù)據(jù)。Qin 等[20]采用GC-IMS 分析比較不同煙草樣品香氣的差異。Chen 等[21]以紹興黃酒、山東黃酒和湖北黃酒為研究對象，對其揮發(fā)性風味成分進行鑒別。

本研究利用GC-IMS 技術，檢測香稻米品種“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”3 種稻米中的揮發(fā)性風味成分，通過比較“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”樣品揮發(fā)性風味物質指紋圖譜，對試驗所選牡丹江地區(qū)3 個不同品種稻米進行區(qū)分，以期為不同品種稻米品種區(qū)分、品質評價、品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稻米：“牡育稻78 號”（MD1）、“牡科稻5 號”（MD2）、“牡科稻7 號”（MD3）：由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院牡丹江分院優(yōu)質水稻種植推廣示范稻基地；Flavour-Spec?風味分析儀：德國G.A.S 公司；MXT-5 色譜柱（15 m×0.53 mm）：美國RESTEK 公司；外標正酮C4～C9：國藥化學試劑北京有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

稱取“牡育稻78 號”（MD1）、“牡科稻5 號”（MD2）、“牡科稻7 號”（MD3）稻米樣品各2 g 于進樣瓶中孵育后進樣。

1.2.2 GC-IMS 檢測條件

表1 GC-IMS 檢測條件Table 1 GC-IMS detection conditions

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用儀器配套的分析軟件對IMS 數(shù)據(jù)進行化學計量分析。通過LAV 軟件處理IMS 數(shù)據(jù)，計算揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)（retention index，RI），利用Reporter、Gallery Plot 內置插件進行譜圖分析。Reporter生成了稱為地形圖的光譜，它可以通過二維俯視圖和三維光譜直接比較樣品之間的光譜差異；Gallery Plot比較不同樣品之間的VOCs 差異，通過所選VOCs 的峰值強度來比較不同樣品中VOCs 的含量；利用GCIMS Library 檢索軟件對物質進行定性分析。采用SIMCA 14.1 軟件進行PCA 分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種香稻米氣相色譜-離子遷移譜圖（GCIMS）和譜圖對比分析

采用GC-IMS 對來自牡丹江地區(qū)的3 個不同品種的香稻米揮發(fā)性成分進行分析，結果如圖1～圖3所示。

圖1 不同品種香稻米中揮發(fā)性物質的GC-IMS 三維譜圖Fig.1 Three-dimensional GC-IMS of volatile components in different varieties of fragrant rice

由圖1 可知，3 種不同品種的香稻米品種GC-IMS三維譜圖非常近似，難以直接通過揮發(fā)性成分進行品種區(qū)分，但揮發(fā)性物質含量存在一定的變化，物質峰的信號強度在“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7號”3 種不同品種香稻米中有所不同。

為了對“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7號”3 種不同稻米中揮發(fā)性成分進行區(qū)分，對反應峰的離子遷移時間和位置進行歸一化處理，得到如圖2所示的GC-IMS 的二維俯視譜圖，其中x軸為離子相對遷移時間，y軸為氣相色譜的保留時間。由圖2 可知，譜圖中顯示了“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”3 種香稻米中的總揮發(fā)性化合物，揮發(fā)性化合物的信號峰均出現(xiàn)在遷移時間1.0～2.0 s 和保留時間100～800 s 的范圍內。信號強度用不同顏色表示，物質含量低呈現(xiàn)白色，物質濃度高呈現(xiàn)紅色[22-23]。通過GCIMS 技術“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7號”3 種不同品種香稻米中揮發(fā)性物質可實現(xiàn)較好地分離，為了能夠進一步比較分析出樣品特征間可能的差異，通過差異對比分析模式，對“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”進行分析，如圖3所示。選取“牡育稻78 號”作為參比，其它樣品扣除參比，顏色變淺，代表其揮發(fā)性物質濃度低于其參比，顏色變深代表其揮發(fā)性物質含量高于其參比（如白色、紅色、藍色等分別代表其揮發(fā)性物質一致、揮發(fā)性物質高于參比、揮發(fā)性物質低于參比）。

圖2 不同品種香稻米中揮發(fā)性物質的GC-IMS 二維譜圖（俯視圖）Fig.2 Two-dimensional GC-IMS of volatile components in different varieties of fragrant rice（vertical view）

圖3 不同品種香稻米中揮發(fā)性物質的GC-IMS 二維譜圖（差異對比圖）Fig.3 Two-dimensional GC-IMS of volatile components in different varieties of fragrant rice（difference contrast）

2.2 不同品種香稻米GC-IMS 揮發(fā)性風味成分定性分析

“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”3 種香稻米揮發(fā)性化合物定性譜圖如圖4所示（以“牡育稻78 號”為例），每種揮發(fā)性成分在圖中顯示為標記點。通過與正酮C4～C9 標準品比較，計算“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”中揮發(fā)性物質的保留指數(shù)[24-26]，結果如表2所示。

圖4 香稻米揮發(fā)性成分離子遷移譜定性分析Fig.4 IMS qualitative analysis of volatile components in different varieties of fragrant rice

表2 香稻米中揮發(fā)性物質分析Table 2 Analysis of volatile components in fragrant rice

由圖4 和表2 可知，牡育稻78 號、牡科稻5 號、牡科稻7 號中含有38 種單體及二聚體物質：酮類7 種、醛類16 種、醇類9 種、呋喃1 種、醚類1 種、吡啶1 種、芳香烴2 種、單萜類1 種，其中鑒定的單體、二聚體的CAS 號相同，僅形態(tài)不同。醛類物質具有濃郁的香味；醇類化合物產(chǎn)生柔和的氣味，這些風味物質使稻米呈現(xiàn)不同的風味[26-28]。

2.3 不同品種香稻米離子遷移色譜（GC-IMS）指紋譜圖分析

試驗選用的牡丹江地區(qū)3 種不同香稻米品種“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”的指紋譜圖如圖5所示。圖中橫向顯示牡丹江地區(qū)3 種不同品種香稻米同一樣品進行3 次重復試驗，縱向顯示不同品種香稻米中相同揮發(fā)性風味物質[29]。

圖5 不同品種香稻米中揮發(fā)性物質的指紋譜圖Fig.5 Fingerprint spectrum of volatile components in different varieties of fragrant rice

由圖5 可知，3 種不同品種的香稻米揮發(fā)性風味物質豐富，通過數(shù)據(jù)庫比對確定了38 種風味物質，不同品種香稻米中揮發(fā)性物質有明顯的不同之處。紅色區(qū)域框內，揮發(fā)性風味物質在“牡育稻78 號”中最豐富，其次為“牡科稻5 號”，“牡科稻7 號”中最少，主要為化合物羅勒烯、檸檬烯單體、檸檬烯二聚體。綠色區(qū)域框內揮發(fā)性物質如乙醇、二甲基-1-丁醇，在“牡科稻7 號”中最多，其次為“牡科稻5 號”，“牡育稻78 號中”最少。黃色區(qū)域框內揮發(fā)性物質如2-甲基-2-丙醇、2-甲基丁酮、2-正戊基呋喃、2-己烯醛單體、（E）-2-庚烯醛二聚體、2-己烯醛二聚體，苯乙醛、2-己烯醛單體、在“牡育稻78 號”中最豐富，其次為“牡科稻7 號”，“牡科稻5 號”中最少。紫色區(qū)域框內物質如辛6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛單體、辛醛二聚體，在“牡科稻5 號”中含量最少，在其它樣品中差異不大。

2.4 不同品種香稻米特征風味物質的相似度分析

采用主成分分析法對GC-IMS 數(shù)據(jù)降維，區(qū)分“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”中揮發(fā)性物質特征，顯示數(shù)據(jù)結構。主成分分析用于將一組原始相關變量轉化為幾個獨立的不相關變量，這些不相關變量能夠解釋原始變量的大部分變化。本研究將牡丹江地區(qū)3 種不同品種的香稻米的GC-IMS 譜圖風味成分數(shù)據(jù)進行主成分分析，結果如圖6A所示。采用儀器軟件計算試驗中牡丹江地區(qū)“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”不同品種稻米樣本之間的歐幾里得距離，歐氏距離圖如圖6B所示，通過檢索最小距離確定樣品間的相似程度[30]。

圖6 不同品種香稻米揮發(fā)性風味物質相似度分析Fig.6 Similarity analysis of volatile flavor components in different varieties of fragrant rice

由圖6A 可知，主成分PC1 貢獻率為63%，PC2 的貢獻率為21%，累計貢獻率達到84%，能夠較好代表和解釋原始數(shù)據(jù)的大部分特征，3 個樣品能夠有效的分開。PC1、PC2 的總貢獻率包含了不同品種香稻米樣品的大部分信息，能代表不同品種香稻米揮發(fā)性風味的主要特征?！澳悼频? 號”和“牡育稻78 號”距離最遠，表明這兩種香稻米的風味存在較大差異，“牡科稻5 號”、“牡育稻78 號”與“牡科稻7 號”距離較近，表明稻米間的風味差異較小。本研究采用GC-IMS 較好地區(qū)分不同品種的香稻米。由圖6B 可知，“牡育稻78號”、“牡科稻7 號”之間距離最近，相似度高，雖然，“牡育稻78 號”檢測平行樣品出現(xiàn)一個異常值，但整體結果與PCA 結果一樣，因此可以通過歐式距離直接對不同品種香稻米進行區(qū)分。

3 結論

采用GC-IMS 可以較好地鑒別牡丹江地區(qū)“牡科稻5 號”、“牡育稻78 號”與“牡科稻7 號”3 種不同的香稻米品種。研究發(fā)現(xiàn)：香稻米中的揮發(fā)性物質主要包括酮類7 種、醛類16 種、醇類9 種、呋喃1 種、醚類1 種、吡啶1 種、芳香烴2 種、單萜類1 種。本研究利用GC-IMS 技術檢測香稻米香氣成分，通過對“牡育稻78 號”、“牡科稻5 號”、“牡科稻7 號”、3 種不同品種的香稻米香氣成分的分析和比較，確定了特征香氣成分及其特征峰，如辛醛單體、辛醛二聚體、6-甲基-5-庚烯-2-酮，在“牡科稻5 號”中含量最少，在其它樣品中差異不大。羅勒烯、檸檬烯單體、檸檬烯二聚體在“牡育稻78 號”中含量多；乙醇、二甲基-1-丁醇，在“牡科稻7號”中最多。通過主成分分析和歐氏距離分析表明，“牡科稻5 號”、“牡育稻78 號”與“牡科稻7 號”3 種不同香稻米可通過GC-IMS 譜圖數(shù)據(jù)實現(xiàn)區(qū)分。