孫康娜,丁紅艷,李巖,院珍珍,2*,韓麗娟,葉英
(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海西寧 810016;2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海西寧 810016)
青稞(HordeumvulgareLinn.var.nudumHook.f.)屬禾本科大麥屬,因其籽粒裸露、內(nèi)外穎殼分離,所以又被稱為裸大麥[1]。它作為青藏高原最具民族特色的農(nóng)作物,具有“三高兩低”即高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪、低糖的特性,是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的農(nóng)作物[2]。
近年來國(guó)內(nèi)外在青稞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、活性成分等方面開展了研究,進(jìn)一步推動(dòng)了青稞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種非蛋白質(zhì)、功能性氨基酸,是主要存在于微生物和動(dòng)植物體內(nèi)的天然活性成分[3]。它是動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一[4]。GABA 在健康和糖尿病動(dòng)物個(gè)體水平口服都具有促進(jìn)胰島素分泌和降低空腹血糖的功能[5]。GABA 生理功能較多,不僅能抗應(yīng)激、解毒、抗癌[6]、治療帕金森、促進(jìn)乙醇代謝、調(diào)節(jié)生殖功能[7],還是大腦中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),在癲癇的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[8],兼具鎮(zhèn)靜、抗焦慮或抗驚厥作用[9],可以改善色素沉著過度障礙[10],在治療重度抑郁癥方面也具有積極作用[11]。此外,GABA 能通過離子型GABA(A)受體和代謝性GABA(B)受體影響多種胰島細(xì)胞類型的活性[12],在干酪乳桿菌對(duì)葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium,DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的有益作用中起關(guān)鍵作用[13]。在植物中GABA 也具有積極作用,葉面施用GABA 或GABA 的代謝工程產(chǎn)物可以降低作物生產(chǎn)中農(nóng)藥污染風(fēng)險(xiǎn)[14];外源GABA 通過增強(qiáng)GABA 分流和次生細(xì)胞壁生物合成,提高蘋果幼苗對(duì)長(zhǎng)期干旱脅迫的抵抗力[15];GABA 能有效緩解蘋果幼苗中的鎘(Cd)毒性[16];外源GABA 對(duì)紫花苜蓿幼苗耐堿脅迫有正向作用[17]。
國(guó)內(nèi)外學(xué)者在富含GABA 原料的選擇、高產(chǎn)GABA 微生物的分離鑒定等方面取得顯著的進(jìn)展,目前已有學(xué)者研究不同因素對(duì)青稞中GABA 含量的影響,通過分析提取時(shí)間、提取溫度、料液比、pH 值、青稞種類等因素對(duì)GABA 含量的影響,得到最優(yōu)提取工藝,使GABA 含量達(dá)到更高[18]。從米糠中提取GABA 所需的條件是用水作為提取介質(zhì),在50 ℃的溫度下攪拌米糠4 h,該方法可為提取GABA 提供良好的條件[19]。
α-淀粉酶抑制劑可以抑制餐后血糖升高和胰島素的分泌[20]。α-葡萄糖苷酶抑制劑具有抑制腸道細(xì)菌、保持血糖平衡等作用[21],α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑可抑制糖原、淀粉等物質(zhì)水解成葡萄糖,延緩糖原、淀粉等物質(zhì)在小腸中被吸收,能有效降低餐后血糖水平[22]。故可以通過α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率測(cè)定降血糖活性。
本試驗(yàn)研究提取溫度、提取時(shí)間、液料比對(duì)黑青稞中GABA 含量的影響,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)探究最優(yōu)提取工藝參數(shù),并進(jìn)行體外降血糖活性研究,以期為推進(jìn)高原健康食品發(fā)展提供理論依據(jù)。
黑青稞粉:青海漢和生物科技股份有限公司;γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品:上海源葉生物科技有限公司;四硼酸鈉(分析純):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;苯酚、次氯酸鈉、可溶性淀粉溶液(均為分析純):天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;3,5-二硝基水楊酸(分析純):上海展云化工有限公司;4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(分析純):索萊寶生物科技有限公司;α-淀粉酶(酶活力50 U/mg):合肥博美生物有限公司;α-葡萄糖苷酶(酶活力70 萬U/mL):上海吉至生化科技有限公司。
電熱恒溫水浴鍋(HH-6 型):上海比朗儀器有限公司;恒溫振蕩器(THZ-82 型):常州國(guó)華電器有限公司;臺(tái)式高速離心機(jī)(H/T16MN 型):湖南赫西儀器裝備有限公司;紫外可見分光光度計(jì)(UN-2600 型):日本島津公司;渦旋振蕩器(Xw-80A 型):海門市其林貝爾儀器制造有限公司;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(MULTISKAN Sky 型):北京平利洋經(jīng)貿(mào)有限公司。
1.3.1 GABA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
參考劉元等[3]的方法,并稍作修改,稱取一定量的GABA 標(biāo)準(zhǔn)品用去離子水配制成1 mol/L 的GABA 標(biāo)準(zhǔn)溶液,準(zhǔn)確吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL 于10 mL 帶蓋離心管中,分別加蒸餾水0.95、0.90、0.85、0.80、0.75 mL 使每個(gè)離心管中的溶液達(dá)到1 mL,得到不同濃度的GABA 標(biāo)準(zhǔn)液,從配好的標(biāo)準(zhǔn)液中取1.0 mL 到另一個(gè)帶蓋離心管中,在離心管中先加入硼酸鹽緩沖液(pH9.18)0.4 mL,然后加入6% 苯酚溶液1 mL,再加入5.25% 次氯酸鈉溶液1.5 mL,將其充分混勻后馬上放入水浴鍋中沸水浴10 min,然后取出冰浴5 min,之后加入60% 乙醇溶液2 mL,在645 nm 處測(cè)定溶液的吸光值。
1.3.2 單因素試驗(yàn)
考察不同提取溫度、提取時(shí)間、液料比對(duì)GABA含量的影響,并確定各因素的最佳水平。
1.3.2.1 提取溫度對(duì)黑青稞中GABA 含量的影響
參考趙大偉等[23]的方法,并稍作修改,稱?。?00±5)mg 黑青稞粉放置于10 mL 帶蓋離心管中,在每管中加5 mL 蒸餾水,固定液料比為10∶1(mL/g),將試管放入振蕩器,設(shè)置轉(zhuǎn)速為2 000 r/min,時(shí)間為90 min,分別在40、50、60、70、80℃條件下進(jìn)行振蕩處理。振蕩結(jié)束后,離心10 min(6 000 r/min),取1 mL 上清液于另一離心管中,待測(cè)。
1.3.2.2 提取時(shí)間對(duì)黑青稞中GABA 含量的影響
參考趙大偉等[23]的方法,并稍作修改,稱?。?00±5)mg 黑青稞粉放置于10 mL 帶蓋離心管中,每個(gè)離心管加5 mL 蒸餾水,固定液料比為10∶1(mL/g),將試管放入振蕩器,設(shè)置轉(zhuǎn)速為2 000 r/min,固定溫度為60 ℃,在30、60、90、120、150 min 條件下進(jìn)行振蕩處理。振蕩結(jié)束后,離心10 min(6 000 r/min),取1 mL 上清液于另一離心管中,待測(cè)。
1.3.2.3 液料比對(duì)黑青稞中GABA 含量的影響
參考趙大偉等[23]的方法,并稍作修改,稱?。?00±5)mg 黑青稞粉放置于10 mL 帶蓋離心管中,固定時(shí)間為90 min、溫度為60 ℃,設(shè)置液料比分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1(mL/g),將試管放入振蕩器,設(shè)置轉(zhuǎn)速為2 000 r/min,振蕩結(jié)束后,離心10 min(6 000 r/min),取1 mL 上清液于另一離心管中,待測(cè)。
1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)為自變量,以GABA 含量(Y)為響應(yīng)值,利用Box-Behnken 中心設(shè)計(jì)法則[24],確定黑青稞中GABA 提取的最佳工藝條件,并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
通過單因素試驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。
表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface methodology
1.3.4 體外降血糖活性測(cè)定
1.3.4.1 黑青稞中GABA 對(duì)α-淀粉酶的抑制活性試驗(yàn)參考張燕麗[21]的方法,并稍作修改,根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳條件提取GABA,取150 μL 未處理青稞粉溶液和富集GABA 溶液并添加0.5 mg/mL 的α-淀粉酶液150 μL,充分混勻后,放入水浴鍋在37 ℃條件下孵育10 min,然后將250 μL 的1% 可溶性淀粉溶液加入到混合液中,并在37 ℃條件下繼續(xù)孵育10 min,加入500 μL 的3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)停止反應(yīng),在沸水浴中反應(yīng)5 min。冷卻后取200 μL 于96 孔板中,使用酶標(biāo)儀在540 nm 處測(cè)吸光值,每組重復(fù)測(cè)定3 次,取平均值。α-淀粉酶抑制率(X,%)按公式(1)計(jì)算。
式中:a為含葡萄糖苷酶溶液與待測(cè)樣本時(shí)所檢出的吸光值;b為含有待測(cè)樣本但不包括葡萄糖苷酶的溶液所測(cè)得的吸光值;c為含葡萄糖苷酶溶液但不含待測(cè)樣本所測(cè)得的吸光值。
1.3.4.2 黑青稞中GABA 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性試驗(yàn)
參考張燕麗[21]的方法,并稍作修改,根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳條件提取GABA,取0.05 mol/L(pH6.8)磷酸鹽緩沖液600 μL,加入20 mol/L 的4-硝基苯基-α-D-吡咯葡萄糖苷溶液300 μL 與40 μL 未處理青稞粉溶液和富集GABA 溶液,將其放置于37 ℃水浴條件下孵育10 min,然后加入0.2 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液52 μL,室溫條件下放置10 min 后再加入0.1 mol/L 的Na2CO31.65 mL 終止反應(yīng),在405 nm 的條件下測(cè)定終止液吸光值。反應(yīng)體系中采用0.05 mol/L(pH6.8)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)作為溶液及待測(cè)樣品的空白對(duì)照。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行,并設(shè)置空白對(duì)照,取平均值。α-葡萄糖苷酶抑制率(Y,%)按公式(2)計(jì)算。
式中:a為含葡萄糖苷酶溶液與待測(cè)樣本時(shí)所檢出的吸光值;b為含有待測(cè)樣本但不包括葡萄糖苷酶的溶液所測(cè)得的吸光值;c為含葡萄糖苷酶溶液但不含該樣本時(shí)所測(cè)得的吸光值;d為不包括葡萄糖苷酶的溶液與待測(cè)樣本時(shí)所檢出的吸光值。
同一處理的樣品組做3 組平行,使用Excel 2016、Origin 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析及作圖,響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行處理。
在室溫條件下,測(cè)定處理過的GABA 標(biāo)準(zhǔn)溶液在645 nm 處的吸光值,結(jié)果見圖1。
圖1 GABA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of GABA
由圖1 可知,在645 nm 的條件下GABA 含量和吸光值的線性關(guān)系為Y=1.954 2X-0.042 8,R2=0.996 8。為了讓重復(fù)性符合要求,本次試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次,使得其結(jié)果穩(wěn)定,準(zhǔn)確性高。因此,采用該方法對(duì)黑青稞提取液的GABA 含量進(jìn)行測(cè)定可行。
2.2.1 提取溫度對(duì)GABA 含量的影響
提取溫度對(duì)GABA 含量的影響見圖2。
圖2 提取溫度對(duì)GABA 含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on GABA content
由圖2 可知,當(dāng)提取溫度從40 ℃升高到60 ℃時(shí),黑青稞中GABA 含量隨著提取溫度的升高而升高,在60 ℃時(shí)GABA 含量達(dá)到峰值(0.273±0.017)mg/mL;提取溫度進(jìn)一步升高,黑青稞中GABA 含量呈下降趨勢(shì)。提取溫度為40 ℃時(shí),黑青稞中GABA 含量最低,僅為(0.103±0.013)mg/mL。這可能是因?yàn)樘崛囟任催_(dá)到60 ℃時(shí),水溶液對(duì)GABA 的溶解度較低,從而導(dǎo)致GABA 含量比峰值低,提取溫度高于60 ℃使得GABA 發(fā)生降解,在一定程度上破壞了黑青稞提取液中的GABA,使得GABA 分解、氨基脫離,也可能是因?yàn)榉肿娱g發(fā)生劇烈碰撞會(huì)產(chǎn)生能量,這部分能量使GABA 的氨基解離,所以提取液中的GABA 含量下降[24]。因此選擇提取黑青稞GABA 提取溫度50、60、70 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。
2.2.2 提取時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響
提取時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響見圖3。
圖3 提取時(shí)間對(duì)GABA 含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on GABA content
由圖3 可知,控制其它3 個(gè)變量,逐漸延長(zhǎng)提取時(shí)間,黑青稞中GABA 含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,在90 min 時(shí)黑青稞中GABA 含量達(dá)到峰值(0.289±0.007)mg/mL;提取時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng),黑青稞中GABA 含量呈下降趨勢(shì);當(dāng)提取時(shí)間為150 min 時(shí),黑青稞中GABA 含量最低,僅為(0.218±0.006)mg/mL。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間太短,黑青稞中GABA 未完全溶出,導(dǎo)致GABA 含量較少,長(zhǎng)時(shí)間的浸提使得GABA被破壞,從而導(dǎo)致GABA 含量比峰值低。因此選擇黑青稞GABA 提取時(shí)間60、90、120 min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。
2.2.3 液料比對(duì)GABA 含量的影響
液料比對(duì)GABA 含量的影響見圖4。
圖4 液料比對(duì)GABA 含量的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on GABA content
由圖4 可知,隨著溶劑體積增加,黑青稞粉沒有完全浸濕,黑青稞中的GABA 沒有增加,黑青稞中GABA含量先增加后減小,在液料比為3∶1(mL/g)時(shí),黑青稞中GABA 含量達(dá)到峰值(0.316±0.015)mg/mL;液料比為6∶1(mL/g)時(shí),黑青稞中GABA 含量最低,僅為(0.144±0.012)mg/mL。這可能是因?yàn)槿軇w積過小,黑青稞粉沒有完全浸濕,黑青稞中的GABA 沒有完全被溶出;溶出的GABA 在液料比為3∶1(mL/g)時(shí)達(dá)到最大,繼續(xù)增加溶劑用量,會(huì)溶解出其他物質(zhì),所以GABA 含量降低。最終選擇液料比2∶1、3∶1、4∶1(mL/g)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。
2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)為影響因子,以黑青稞中GABA 含量(Y)為響應(yīng)值,采用Box-Behnken 模型設(shè)計(jì)出包括17 次試驗(yàn)的提取方案[25],測(cè)定每組試驗(yàn)條件下黑青稞GABA 含量,試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology
2.3.2 回歸模型的建立與顯著性分析
將表2 得到的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,得到Y(jié)關(guān)于A、B、C的二次多項(xiàng)回歸擬合模型為Y=0.34+9.250×10-3A-5.375×10-3B+0.017C-0.012AB+2.250×10-3AC+5.500×10-3BC-0.11A2-0.096B2-0.075C2。
方差分析結(jié)果見表3。
表3 回歸方程試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for regression equations
由表3 可知,回歸擬合模型的p<0.01,說明該模型極顯著。失擬項(xiàng)=0.861 表現(xiàn)出不顯著,說明擬合效果比較好。且R2=0.968 6>0.9,R2Adj=0.928 3;C.V.=11.77%,可得結(jié)論:模型的擬合結(jié)果符合實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果。因此該試驗(yàn)?zāi)P偷脑O(shè)計(jì)比較合理,可以擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù),能用于黑青稞中GABA 提取工藝的分析。
2.3.3 交互作用分析
通過影響因素之間的響應(yīng)面圖和等高線圖來進(jìn)行分析,響應(yīng)面圖可以形象直觀地反映出兩因素之間的交互作用。通過Design-Expert 8.0.6 軟件,各試驗(yàn)因素交互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面及等高線見圖5~圖7。
圖5 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)GABA 含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots of the effects of temperature and time on GABA content
由圖5 可知,A與B的交互作用的三維圖最陡峭,曲面變化最為明顯,等高線圖呈橢圓,說明A、B的交互作用對(duì)黑青稞中GABA 含量在三者中影響最大。
由圖5、圖6、圖7 的等高線圖可知,提取溫度和提取時(shí)間對(duì)黑青稞中GABA 的提取量的影響顯著大于提取溫度和液料比與提取時(shí)間和液料比對(duì)黑青稞中GABA 的提取量的影響。其中,圖6 的等高線比圖5、圖7 的等高線更接近于圓形。因此,兩因素相互作用對(duì)黑青稞中GABA 的含量影響最小的是提取溫度和液料比。根據(jù)表3 的數(shù)據(jù)可以看出,AB相互作用的p值最小,數(shù)值為0.368;AC相互作用的p值最大,數(shù)值為0.859;BC相互作用的p值介于兩者之間,數(shù)值為0.666。所以兩因素相互作用對(duì)黑青稞中GABA 含量影響大小依次排序?yàn)锳B>BC>AC[26]。
圖6 提取溫度和液料比對(duì)GABA 含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots of the effects of temperature and liquid-material ratio on GABA content
圖7 提取時(shí)間和液料比對(duì)GABA 含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots of the effects of time and liquid-material ratio on GABA content
2.3.4 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)
響應(yīng)面分析得到,在提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為90 min、液料比3∶1(mL/g)條件下,預(yù)測(cè)的最優(yōu)黑青稞GABA 含量為0.341 mg/mL。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法得到的優(yōu)化數(shù)據(jù)的可靠性,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),做3 次平行試驗(yàn),取平均值,最后計(jì)算GABA 含量為(0.338±0.012)mg/mL,與理論上預(yù)測(cè)的最優(yōu)值0.341 mg/mL 基本相符,驗(yàn)證了黑青稞中GABA 含量回歸模型的有效性,所以黑青稞γ-氨基丁酸含量可以采用該模型進(jìn)行分析。
體外降血糖活性分析見表4。
表4 體外降血糖活性分析Table 4 Hypoglycemic activity in vitro
由表4 可知,根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳條件提取GABA,取未處理青稞粉溶液和富集GABA 溶液進(jìn)行α-淀粉酶的抑制活性試驗(yàn),富集GABA 溶液對(duì)α-淀粉酶的抑制效果更佳,其抑制率為(72.41±0.43)%,未處理青稞粉溶液的抑制率為(22.82±0.33)%。
由表4 可知,根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳條件提取GABA,取未處理青稞粉溶液和富集GABA 溶液進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗(yàn),富集GABA 溶液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果更佳,其抑制率為(82.29±0.38)%,未處理青稞粉溶液的抑制率為(41.46±0.43)%。
以上試驗(yàn)結(jié)果表明,黑青稞中GABA 對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶能夠產(chǎn)生抑制效果,具有良好的體外降血糖作用,為研發(fā)功能性食品和研究以青稞為原料的產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。
本試驗(yàn)以黑青稞為原料,以黑青稞中GABA 含量為響應(yīng)指標(biāo),探究提取溫度、提取時(shí)間、液料比對(duì)GABA 含量的影響,并進(jìn)行體外降血糖活性研究。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),結(jié)果表明黑青稞提取GABA 最佳工藝參數(shù):提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為90 min、液料比3∶1(mL/g),在此條件下,黑青稞中GABA 含量為(0.338±0.012)mg/mL,與模型預(yù)測(cè)值0.341 mg/mL 基本相符。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳條件提取黑青稞中GABA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)富集GABA 溶液的體外降血糖效果更佳,黑青稞中GABA 對(duì)α-淀粉酶的抑制率為(72.41±0.43)%,對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為(82.29±0.38)%,具有良好的降血糖效果。