體外模擬胃腸消化過(guò)程中黑果腺肋花楸果提取物活性成分及其抗氧化作用變化規(guī)律

王旭輝，鐘方麗，王曉林，王云，封晴

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

黑果腺肋花楸（Aroniamelanocarpa）簡(jiǎn)稱(chēng)“黑果”，是一種原產(chǎn)于北美東部的灌木，其果實(shí)富含原花青素、花青素、黃酮、酚酸等多種活性成分[1-2]。2018年，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)黑果果實(shí)作為新食品原料使用[3]。研究表明，原花青素具有抗氧化、抗菌、降糖、降脂等功能[4-5]；花青素具有預(yù)防糖尿病及高血壓、抗腫瘤、抗氧化等作用[4，6]；多酚具有多種生理功能，如抗輻射、抑菌消炎、去脂降糖、保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗氧化和改善腸道微生物群等[7-8]；黃酮類(lèi)化合物已經(jīng)被證實(shí)具有良好抗氧化性、抗炎、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、降血壓、降血糖、預(yù)防和治療消化系統(tǒng)疾病及保護(hù)心血管等多種功效[9-10]。

生物活性物質(zhì)必須具備一定生物利用度，才能對(duì)人體產(chǎn)生有益的作用[11]。研究表明，茶葉中的多酚類(lèi)物質(zhì)被吸收之前，易在胃腸道中發(fā)生降解或結(jié)構(gòu)變化，其生物活性隨之改變，尤其是抗氧化活性在消化前后差異巨大[12]。因體外模擬胃腸消化具有快速、廉價(jià)、不受倫理限制、重復(fù)性高等優(yōu)勢(shì)，在食品和營(yíng)養(yǎng)科學(xué)的許多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[4]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)葡萄酒、果汁、藍(lán)莓皮渣等多種食品及其副產(chǎn)品模擬消化過(guò)程中活性成分及其抗氧化活性變化規(guī)律進(jìn)行了研究[13-15]。目前對(duì)黑果的研究主要集中在活性成分的提取純化、含量測(cè)定及其提取物的體外活性上，有關(guān)黑果活性成分和抗氧化活性在人體胃腸消化過(guò)程中變化規(guī)律的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在研究黑果提取物在體外模擬口腔、胃、腸消化過(guò)程中，多酚、黃酮、原花青素及花青素含量變化，以及其對(duì)羥基自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]陽(yáng)離子自由基、超氧陰離子自由基的清除能力，從而評(píng)價(jià)其抗氧化能力的變化規(guī)律，以期為黑果活性成分在食品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-淀粉酶（分析純，酶活力≥4 000 U/g）、胃蛋白酶（分析純，酶活力3 000～3 500 U/g）、胰蛋白酶（分析純，酶活力＞250 U/mg）、ABTS（分析純，含量≥98%）：上海寶曼生物科技有限公司；DPPH（純度＞97%）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；黑果：吉林省黑果花楸農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，經(jīng)吉林化工學(xué)院薛健飛博士鑒定為薔薇科腺肋花楸屬植物黑果腺肋花楸[Aroniamelanocarpa（Michx.）Elliott]的果實(shí)。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-B 水浴恒溫振蕩器：金壇市科析儀器有限公司；FA3204B 電子分析天平：上海天美天平儀器有限公司；PHS-3CW 型pH 計(jì)：上海般特儀器制造有限公司；TU-1950 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 黑果提取物的制備

將黑果置于60 ℃干燥6～8 h，粉碎后過(guò)80 目篩，得黑果干粉。稱(chēng)取黑果干粉25 g，按液料比55∶1（mL/g）加入60%乙醇溶液，80 ℃提取2.5 h，采用同體積溶劑連續(xù)提取2 次，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至稠膏，60 ℃真空干燥，恒重后即得黑果提取物。

1.3.1.2 模擬溶液的制備

唾液、胃液：按照封易成等[16]的方法進(jìn)行制備。

腸液：準(zhǔn)確稱(chēng)取KH2PO46.8 g，加蒸餾水500 mL溶解，用0.4% NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8；另準(zhǔn)確稱(chēng)取胰蛋白酶10 g，加蒸餾水適量使之溶解。將兩者混合，加蒸餾水稀釋至1 000 mL，得模擬腸液[17]。

1.3.1.3 模擬消化過(guò)程

口腔：取干燥的黑果提取物粉末準(zhǔn)確稱(chēng)取1.5 g，加入100 mL 模擬唾液，按照封易成等[16]的方法進(jìn)行處理，得口腔消化液，-20 ℃以下保存。

胃：重復(fù)口腔消化過(guò)程，水浴振蕩后，用3 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 值至1.5，加入100 mL 模擬胃液，按照封易成等[16]的方法處理后，其中的25% 于70 ℃水浴滅酶，其余未滅酶，得胃消化液，-20 ℃以下保存。

腸：重復(fù)口腔和胃消化過(guò)程，按照封易成等[16]的方法進(jìn)行處理，得腸消化液，-20 ℃以下保存。

腸透析：重復(fù)口腔和胃消化過(guò)程，取未滅酶的模擬胃消化液30 mL 轉(zhuǎn)移到30 cm 透析袋中，透析袋置于100 mL磷酸鹽緩沖液中，37 ℃水浴振蕩4 h。一半70 ℃水浴滅酶，一半未滅酶，得腸透析液，-20 ℃以下保存[16]。

1.3.2 生物活性成分的含量測(cè)定

黑果提取物溶液的配制：稱(chēng)取黑果提取物粉末0.25 g，于100 mL 容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻。

1.3.2.1 總黃酮含量測(cè)定

以兒茶素為對(duì)照品，線性回歸方程y=0.027 5x+0.049 8，R2=0.999 5，兒茶素在1.88～16.92 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。取樣品液適量，于25 mL容量瓶中，加5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加10% Al（NO）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入4% NaOH 溶液2 mL，50%甲醇定容，搖勻，靜置15 min，以未顯色的樣品液為空白，按照紫外可見(jiàn)分光光度法，于500 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的含量。

1.3.2.2 多酚含量測(cè)定

以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，線性回歸方程y=0.086 28x+0.0291 9，R2=0.998 9。吸取樣品液適量，置于25 mL 容量瓶中，加1.0 mL 的福林酚試劑，加入10 mL 蒸餾水，搖勻后加入14%的Na2CO3溶液稀釋定容，搖勻，45 ℃水浴保溫15 min，以未顯色的樣品液為空白，按照紫外可見(jiàn)分光光度法，于760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚的含量。

以原花青素為對(duì)照品，線性回歸方程y=2.844 6x+0.014 6，R2=0.999 0，原花青素在0.08～0.32 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。吸取樣品液適量，置于具塞試管中，將正丁醇與鹽酸按95∶5 的體積比混合后，取9 mL 加入試管中，再加入0.3 mL 硫酸鐵銨溶液，混勻，100 ℃沸水浴40 min，迅速冷卻，以未顯色的樣品液為空白，按照紫外可見(jiàn)分光光度法，于548 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算原花青素的含量。

1.3.2.4 花青素含量測(cè)定

以矢車(chē)菊素為對(duì)照品，線性回歸方程y=0.039 3x-0.004 6，R2=0.999 4，矢車(chē)菊素在2.7～18.9 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。吸取樣品液適量，置于10 mL 容量瓶中，加入0.1 mol/L 檸檬酸水溶液定容。空白組在定容前加入0.5 mL 的10% Na2SO3溶液。按照紫外可見(jiàn)分光光度法，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算花青素的含量。

1.3.3 體外活性試驗(yàn)

1.3.3.1 羥基自由基的清除能力測(cè)定

分別吸取各消化液及黑果提取物溶液、維生素C溶液6 種樣品適量，作為供試品溶液。

現(xiàn)階段，基層畜牧獸醫(yī)動(dòng)物防疫工作主要基層畜牧獸醫(yī)動(dòng)物防疫機(jī)制不健全、畜牧獸醫(yī)觀念滯后、基層畜牧獸醫(yī)動(dòng)物防疫專(zhuān)業(yè)人才缺乏等問(wèn)題。

取1.5 mmol/L 鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液1 mL 于10 mL 比色管中，依次加入磷酸鹽緩沖液（pH7.4）2 mL和不同體積的6 種供試品溶液，0.75 mmol/L 硫酸亞鐵溶液1 mL，用蒸餾水補(bǔ)至6 mL，充分混合，加1 mL 0.1% H2O2溶液，37 ℃恒溫反應(yīng)60 min，于536 nm 處測(cè)其吸光度（As）。以1 mL 蒸餾水分別代替供試品溶液和0.1% H2O2溶液，同波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度（Ab）。以蒸餾水代替供試品溶液，同波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度（Ap）。羥基自由基清除率（X，%）的計(jì)算公式如下[[16]。

以羥基自由基清除率為縱坐標(biāo)，消耗體積為橫坐標(biāo)繪制曲線，得出回歸方程，計(jì)算各供試品的IC50值（清除率為50%時(shí)所消耗的供試品體積），進(jìn)行比較。

1.3.3.2 DPPH 自由基的清除能力測(cè)定

取0.2 mmol/L DPPH 溶液1 mL 于比色管中，分別加入不同體積的供試品溶液，按照封易成等[16]的方法，在517 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定加入供試品溶液的吸光度（Ai）、蒸餾水代替供試品溶液的吸光度（A0）和蒸餾水代替DPPH 溶液的吸光度（Aj）。DPPH 自由基清除率（Y，%）的計(jì)算公式如下。

以DPPH 自由基清除率為縱坐標(biāo)，消耗體積為橫坐標(biāo)繪制曲線，得出回歸方程，計(jì)算各供試品的IC50值（清除率為50%時(shí)所消耗的供試品體積）進(jìn)行比較。

1.3.3.3 ABTS+自由基的清除能力測(cè)定

吸取不同體積的供試品溶液于比色管中，用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，分別加入3.9 mL 工作液（7 mmo/L 的ABTS 和2.45 mmol/L 過(guò)硫酸鉀溶液體積比1∶1 配制混合溶液），23 ℃暗處孵育12～16 h，得ABTS+自由基基液，蒸餾水稀釋基液（40～50 倍）至其在波長(zhǎng)734 nm 處吸光度為0.700±0.005（A空白）得工作液。充分混合均勻后，23 ℃暗處孵育6 min，蒸餾水作空白對(duì)照，于734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A[16]。ABTS+自由基清除率（Z，%）的計(jì)算公式如下。

以ABTS+自由基清除率為縱坐標(biāo)，消耗體積為橫坐標(biāo)繪制曲線，得出回歸方程，計(jì)算各供試品的IC50值（清除率為50%時(shí)所消耗的供試品體積），進(jìn)行結(jié)果比較。

1.3.3.4 超氧陰離子自由基的清除能力測(cè)定

取4.5 mL Tris-HCl 緩沖溶液（50 mmol/L，pH8.21）于比色管中，25 ℃水浴預(yù)熱20 min，分別加入不同體積的供試品溶液和0.5 mL 鄰苯三酚溶液（30 mmol/L），用蒸餾水補(bǔ)至8 mL，混勻后于25 ℃水浴反應(yīng)30 min，加入0.5 mL HCl（0.5 mmol/L）終止反應(yīng)，以Tris-HCl 緩沖溶液為空白對(duì)照，于420 nm 波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A1。以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液（30 mmol/L），同波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A2，以蒸餾水代替供試品溶液，同波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A3[18]。超氧陰離子自由基清除率（B，%）的計(jì)算公式如下。

以超氧陰離子自由基清除率為縱坐標(biāo)，消耗體積為橫坐標(biāo)繪制曲線，得出回歸方程，計(jì)算各供試品的IC50值（清除率為50% 時(shí)所消耗的供試品體積）進(jìn)行比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3 次，采用WPS 和Origin 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物活性成分的含量測(cè)定結(jié)果與分析

表1 為黑果提取物溶液及各模擬消化液中活性成分含量檢測(cè)結(jié)果。

表1 活性成分含量Table 1 Content of active components

由表1 可知，黑果提取物中活性成分含量從高到低依次為原花青素、多酚、總黃酮、花青素。各消化液中，花青素含量在口腔消化液中最多，腸消化液次之，胃消化液和腸透析液中較少。原花青素在口腔消化液中最多，胃消化液中較少，腸消化液和腸透析液中低于檢出限。多酚在腸消化液中含量最高，口腔和胃消化液中差距不大，腸透析液中明顯減少。總黃酮在口腔消化液中含量最高，胃消化液、腸消化液中逐漸減少，腸透析液中低于檢出限。

經(jīng)過(guò)模擬消化后，花青素含量下降明顯，腸消化后略有升高，但依然明顯低于提取物溶液中含量?，F(xiàn)有研究表明，花青素主要在胃和小腸被吸收[19]?；ㄇ嗨卦诮?jīng)過(guò)小腸時(shí)發(fā)生分解代謝。所以腸透析液中花青素含量大幅下降[20]。在口腔和胃消化過(guò)程中，原花青素含量逐漸下降，在腸消化液和腸透析液中均未檢出，此前劉楚[21]通過(guò)定量測(cè)得體外消化后的山竹果皮原花青素提取物中原花青素含量顯著降低。這可能是由于腸道消化的化學(xué)環(huán)境呈弱堿性，而黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)堿性條件比較敏感，容易在堿性條件下降解為其他化合物，導(dǎo)致原花青素在腸消化液中消失現(xiàn)象的出現(xiàn)[22]。模擬消化過(guò)程中，多酚含量在口腔消化、胃消化過(guò)程中均減少，而腸消化過(guò)程中有所增加，可能是由于多酚與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵在胰蛋白酶作用下發(fā)生變化，產(chǎn)生了更多的自由酚[23]，也可能是腸道堿性環(huán)境、酶的作用下，使得與多糖以酯鍵的形式形成的糖苷發(fā)生水解釋放，從而在腸消化過(guò)程中多酚含量升高[24]，腸透析液中含量更少，這可能是酚類(lèi)化合物和其他成分之間的相互作用形成了低溶解度或大分子量的絡(luò)合物，而這些絡(luò)合物不能穿過(guò)透析膜。模擬消化過(guò)程中，總黃酮含量整體呈下降趨勢(shì)，最后在腸透析液中低于檢出限。可能在小腸消化階段，胰蛋白酶使黃酮類(lèi)非極性多酚形成水溶性的混合膠束，無(wú)法透過(guò)透析袋游離到腸透析液中[25]。

因?yàn)檠芯拷K止消化反應(yīng)的方式為滅酶，所以進(jìn)行了滅酶與未滅酶的對(duì)比試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)滅酶對(duì)生物活性物質(zhì)的潛在影響。滅酶前和滅酶后活性物質(zhì)含量變化結(jié)果沒(méi)有一致規(guī)律，可能是不同的活性物質(zhì)在不同消化過(guò)程中，被完全消化所需的時(shí)間和試驗(yàn)設(shè)定的消化時(shí)間有差異，這一結(jié)果值得更深入的研究探討。

2.2 體外活性試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 羥基自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果

不同消化液對(duì)羥基自由基清除能力結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 羥基自由基清除能力Fig.1 Hydroxyl radical scavenging capacity

由圖1 可知，供試品溶液消耗體積反映其清除羥基自由基的能力，其中腸消化液（1 762 μL）與腸透析液（1 685 μL）羥基自由基清除能力相近且較弱，口腔消化液羥基自由基清除能力最強(qiáng)（71 μL）且高于維生素C（105 μL）。結(jié)合圖1 與表1 可以看出，各消化液清除羥基自由基的能力與原花青素和總黃酮的含量具有正向相關(guān)性，口腔消化液中總黃酮和原花青素含量較高，口腔消化液也呈現(xiàn)了最強(qiáng)的清除羥基自由基能力。黑果提取物溶液對(duì)羥基自由基的清除能力沒(méi)有呈現(xiàn)與消化液相同的含量相關(guān)性，消化過(guò)程可能改變活性成分對(duì)羥基自由基的清除能力。胡佳慧等[26]的研究表明玉米須總黃酮具有較強(qiáng)的清除羥基自由基和DPPH 自由基的能力。王彥平等[27]研究表明葡萄皮渣原花青素對(duì)羥基自由基清除能力顯著優(yōu)于維生素C。

2.2.2 DPPH 自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果

不同消化液對(duì)DPPH 自由基清除能力結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 DPPH 自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging capacity

由圖2 可知，供試品溶液消耗體積反映其清除DPPH 自由基的能力，各消化液DPPH 自由基清除能力與羥基自由基清除能力呈現(xiàn)的規(guī)律相近，同樣與原花青素和總黃酮的含量具有正向相關(guān)性。腸消化液（237.1 μL）與腸透析液（221.9 μL）DPPH·清除能力相近且較弱，口腔消化液DPPH·清除能力最強(qiáng)（13.7 μL），各消化液均弱于維生素C 對(duì)照（0.12 μL）。DPPH 自由基作為一種較為穩(wěn)定的自由基，被廣泛應(yīng)用于抗氧化活性評(píng)價(jià)[28]。張欣[29]考察黑果原花青素對(duì)DPPH 自由基的清除能力，以維生素C 作對(duì)照。結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)原花青素對(duì)DPPH 自由基的清除能力強(qiáng)于維生素C。滕飛[30]研究表明黑果原花青素清除DPPH自由基能力強(qiáng)于維生素C。結(jié)合表1 可知，口腔消化液原花青素和總黃酮含量較高，所以口腔消化液清除DPPH 自由基的能力最強(qiáng)，兩組結(jié)果相一致。

2.2.3 ABTS+自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果

不同消化液對(duì)ABTS+自由基清除能力結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 ABTS+自由基清除能力Fig.3 ABTS+radical scavenging capacity

由圖3 可知，各消化液對(duì)ABTS+自由基清除能力均弱于維生素C（0.1 μL），其中口腔消化液（5.4 μL）清除ABTS+·能力最強(qiáng)，腸透析液（93.1 μL）的效果最差。ABTS 是一種水溶性的自由基引發(fā)劑，可用來(lái)評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化能力?？谇幌褐谢钚猿煞挚偤孔罡?，模擬唾液為弱酸性條件，模擬胃液為強(qiáng)酸性條件，酸性條件會(huì)提高對(duì)ABTS＋自由基的清除能力，并且酸性環(huán)境有利于促進(jìn)抗氧化物質(zhì)的釋放，而弱堿性環(huán)境下，抗氧化物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生降解。腸消化液清除ABTS＋自由基的能力強(qiáng)于腸透析液，可能與腸消化液中多酚含量高于腸透析液有關(guān)[16]。

2.2.4 超氧陰離子自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果

模擬胃腸消化過(guò)程中，僅胃消化液表現(xiàn)出了消耗體積與超氧陰離子自由基清除率呈線性關(guān)系，其清除率為50%時(shí)所消耗的體積為1 616.66 μL，遠(yuǎn)大于維生素C 的15.45 μL。而黑果提取物溶液及其他消化液加入量為3 000 μL 時(shí)，超氧陰離子自由基清除率仍未達(dá)到50%，且樣品消耗體積與超氧陰離子自由基清除率之間不呈線性關(guān)系。胃消化液表現(xiàn)出的超氧陰離子自由基清除能力可能與胃部的酸性環(huán)境有關(guān)，考慮利用超氧陰離子自由基清除率評(píng)價(jià)抗氧化能力不適用于黑果提取物溶液及其模擬消化液，相關(guān)內(nèi)容有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以黑果為原料，通過(guò)體外模擬研究其提取物在胃腸消化過(guò)程中活性成分和抗氧化作用變化規(guī)律，結(jié)果表明，模擬消化過(guò)程中黑果各活性成分變化趨勢(shì)不盡相同，模擬消化液清除羥基自由基、DPPH 自由基的變化趨勢(shì)相似，而清除ABTS+自由基能力的結(jié)果略有不同，清除超氧陰離子自由基的能力有待進(jìn)一步研究。黑果提取物模擬消化產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性。

樣品抗氧化活性與部分活性成分含量有一定的相關(guān)性，模擬消化液對(duì)羥基自由基、DPPH 自由基的清除能力變化規(guī)律與總黃酮和原花青素含量呈正向相關(guān)性。模擬腸消化液對(duì)ABTS+自由基的清除能力可能與多酚含量相關(guān)?？谇幌褐懈饔行Щ钚猿煞趾繘](méi)有黑果提取物溶液高，卻表現(xiàn)出了較提取物溶液更好的抗氧化活性，消化過(guò)程中活性成分的抗氧化能力可能得到了提升，研究消化過(guò)程對(duì)抗氧化活性的影響具有一定應(yīng)用價(jià)值。

本研究通過(guò)體外模擬胃腸消化，分析黑果提取物的總黃酮、多酚、原花青素及花青素含量以及抗氧化活性的變化規(guī)律，反映黑果在人體內(nèi)代謝情況，為今后黑果在食品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。