微生物源溶菌酶的抑菌及抗炎活性

司奇，胡雨，戴靜，王珍珍，沙如意，毛建衛(wèi)

（浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州 310023）

溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質酶（muramidase），廣泛存在于自然界，具有抗病毒、抗菌、鎮(zhèn)痛、消腫、加速組織修復等功能，因其具有生物相容性和對組織無刺激性、無毒性的特點，已被制成一種性質優(yōu)良、可殺傷病原微生物而不破壞機體的酶制劑，廣泛應用于醫(yī)療[1-2]、食品[3-4]、飼料[5-7]、日化[8-9]及生物研究[10-12]中。溶菌酶主要通過催化細菌細胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4 糖苷鍵的水解[13]，造成肽聚糖骨架結構斷裂，使細菌的細胞壁受損最終破裂死亡。而不同細菌細胞壁的結構具有差異性，造成溶菌酶對不同菌種的抑菌活性具有差異，溶菌酶可與帶負電荷的病毒蛋白相互結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽[14]，從而使病毒失去活力。

目前，溶菌酶被認為是一種安全的食品添加劑，許多國家和組織批準其作為食品防腐劑或保鮮劑使用，廣泛應用于水產(chǎn)品[15-16]、肉制品[17]、果酒[18]及乳制品[19]等的防腐。國內(nèi)外對溶菌酶的需求量不斷增加，目前商業(yè)化溶菌酶的主要來源為蛋清提取和微生物源溶菌酶。近年來，國內(nèi)外對溶菌酶的結構及理化性質研究日益增多，而微生物源溶菌酶因其較高的提取率、廣泛的抑菌譜、保護動物腸道屏障受到研究人員越來越多的重視。對于微生物源溶菌酶的活性研究，多數(shù)報道只是偏重于微生物源溶菌酶的抑菌特性，較少關注其他活性（如抗炎、抗腫瘤、增強免疫力等）。研究微生物源溶菌酶的抑菌和抗炎雙重特性，可以為其在防腐或保鮮等應用方案提供重要參考。本研究以微生物源溶菌酶為研究對象，評價其抑菌活性及抗炎活性，以期為其應用開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微生物源溶菌酶（活力1 000 U/mg）：浙江愛杰斯生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichiacoli）CMCC 44102、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）CMCC 63501、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CMCC 26001、黑曲霉（AspergillusNiger）CMCC 98003：北京百歐博偉生物技術有限公司；沙門氏菌（Salmonellasp.）ATCC 13311、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）CICC 1012、單增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）ATCC 19115、產(chǎn)黃青霉（Penicilliumflavum）AS3.546、保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）CICC 6045、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）ATCC 14485、酪丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）ATCC 25755：上海寶藏生物技術中心；耐熱芽孢桿菌（Bacillusthermophilus）CICC 21144、乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcuslactissubsp.lactis）CICC 20209、根霉（Rhizopusp.）CICC 40019：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉（分析純）、可溶性淀粉：國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉：青島海博生物技術有限公司；葡萄糖：江蘇強盛功能化學股份有限公司；乙酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）、MRS 肉湯：杭州百思生物技術有限公司；馬鈴薯葡萄糖水（potato dextrose broth，PDB）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；小鼠巨噬細胞RAW264.7：上海富衡生物技術有限公司；RAW264.7 細胞專用培養(yǎng)基：上海碧云天生物技術有限公司；噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）（純度為98%）：德國BIOFROXX 公司；Griess 試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美國Sigma 公司；地塞米松（1 mg/mL）：廣州碩普生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BPS-100CH 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SpectraMax iD3 多功能酶標儀：美谷分子儀器有限公司；BB150 二氧化碳培養(yǎng)箱、MSC-AdvantageTMA2 型Ⅱ級生物安全柜：美國Thermo Fisher Scientific 公司；CKX53 倒置顯微鏡：日本Olympus 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 體外抑菌活性測定

1.3.1.1 培養(yǎng)基配制

LB 固體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g、胰蛋白胨5 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉20 g，加水至1 L，121 ℃滅菌15 min。試驗菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、耐熱芽孢桿菌。

PDA 固體培養(yǎng)基：按說明比例稱重，加水溶解，121 ℃滅菌20 min。試驗菌種：黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、根霉。

PDB 液體培養(yǎng)基：按說明比例稱重，加水溶解，121 ℃滅菌20 min。試驗菌種：黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、根霉。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）固體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加水至1 L，121 ℃滅菌15 min。試驗菌種：釀酒酵母。

乳酸細菌固體培養(yǎng)基（MRS 固體培養(yǎng)基）：按說明比例稱重，按質量體積比為2% 加入瓊脂粉，加水溶解，121 ℃滅菌15 min。試驗菌種：保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳亞種。

加強梭狀芽孢桿菌（reinforced medium of clostridia，RCM）固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、酵母浸粉3 g、乙酸鈉3 g、可溶性淀粉1 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、瓊脂15 g，加水至1 L，121 ℃滅菌15 min。試驗菌種：酪丁酸梭菌。

1.3.1.2 菌懸液制備

從活化的固體斜面上挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基中，在菌種適宜的生長溫度下，150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，10 000 r/min 離心15 min，去除上清液，使用生理鹽水洗滌沉淀并制成含菌量1×106～2×106CFU/mL 的菌懸液，冷藏備用。

1.3.1.3 最小抑菌濃度測定

采用二倍稀釋法[20]測定微生物源溶菌酶樣品對14 種供試菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。先將樣品制成初始質量濃度為80 mg/mL 的水溶液，再分別用菌種對應的液體培養(yǎng)基依次進行二倍稀釋，共稀釋10 個濃度作為樣品溶液。每種測試菌液分別設置僅加液體培養(yǎng)基的試管作為陰性對照，加同體積樣品溶液及菌懸液的試管作為試驗組。混勻后將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、耐熱芽孢桿菌和釀酒酵母于37 ℃培養(yǎng)24 h，酪丁酸梭菌于37 ℃無氧條件下培養(yǎng)48 h，產(chǎn)黃青霉、黑曲霉和根霉于28 ℃培養(yǎng)36 h后，分別測定其OD600值。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌于37 ℃培養(yǎng)48 h、乳酸乳球菌乳亞種于28 ℃培養(yǎng)48 h 后，2 000 r/min 離心5 min，保留沉淀后烘干稱重。

1.3.2 體外抗炎活性測定

1.3.2.1 小鼠巨噬細胞RAW264.7 細胞培養(yǎng)

將凍存的RAW264.7 細胞復蘇后，于5% CO2、37 ℃飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳至3 代后，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后用于正常試驗操作。

1.3.2.2 樣品對RAW264.7 存活率的影響試驗

試驗分組：用RAW264.7 細胞專用培養(yǎng)基配制最終質量濃度分別為1、10、50、100、200 mg/mL 的微生物源溶菌酶樣品液。取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，計數(shù)，調整細胞密度為1×105cells/mL。向96 孔板中每孔加入100 μL 細胞懸液，5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去96 孔板中的培養(yǎng)基，按上述分組加入100 μL 的樣品溶液，空白對照組只加100 μL RAW264.7 細胞專用培養(yǎng)基，每組設置6 個復孔，培養(yǎng)24 h 后每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。吸去孔板中溶液加入100 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），于570 nm 處測吸光度。記錄結果并計算細胞存活率，計算公式如下。

式中：S為細胞存活率，%；A2為測定孔吸光度；A0為調零孔吸光度；A1為空白對照孔吸光度。

1.3.2.3 抗炎活性測定

取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，計數(shù)并調整細胞濃度至1×105cells/mL，將其接于24 孔板，每孔中加入混合均勻的細胞懸液1 mL，置于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，設置空白對照組、模型組、陽性對照組及樣品組進行試驗。樣品組中加入不同濃度的微生物源溶菌酶樣品1 mL，空白對照組和模型組均加入1 mL 培養(yǎng)基，陽性對照組加入1 mL 80 mg/L 的地塞米松溶液。每組設置3 個復孔，置于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在樣品組及模型組中加入含1 mg/L LPS 的培養(yǎng)基，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細胞培養(yǎng)上清，采用Griess 試劑盒測定不同樣品處理下細胞中NO 的分泌量。采用TNF-α 試劑盒測定細胞上清中炎癥因子TNF-α 的分泌量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，單因素方差進行顯著性檢驗（P＜0.05），使用GraphPad Prism 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 體外抑菌測定

微生物源溶菌酶對11 種供試菌的MIC 測定結果如表1所示。

表1 微生物源溶菌酶對11 種供試菌的MIC 測定結果Table 1 Minimum inhibitory concentrations of microbial lysozyme against 11 microbial species

由表1 可知，微生物源溶菌酶對11 種供試菌均有一定的抑菌效果，其中對耐熱芽孢桿菌的抑制效果最好，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉次之，對產(chǎn)黃青霉、釀酒酵母的抑制效果相對較弱。

不同質量濃度微生物源溶菌酶對乳酸菌菌種干重的影響如圖1所示。

圖1 微生物源溶菌酶作用下3 種乳酸菌的質量變化Fig.1 Mass changes of three species of lactic acid bacteria treated with microbial lysozyme

由圖1 可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，微生物源溶菌酶對保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳亞種3 種益生菌均無抑制效果，反而對其生長具有一定的促進作用。對照組為加入相同體積液體培養(yǎng)基及菌懸液相同培養(yǎng)條件下的質量，由圖1 可知，較高濃度處理下的菌種干重明顯高于對照組。Dan 等[21]將含有重組人溶菌酶基因的改良細菌人工染色體注入小鼠胚胎中構建轉基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，轉基因小鼠腸道中的雙歧桿菌顯著增加并對沙門氏菌的生長產(chǎn)生抑制。Tuncer 等[22]研究表明，嗜熱鏈球菌ST8.01 能夠在100 mg/L 溶菌酶濃度下生長，并顯示出高的自聚集（49.55±6.24）%和疏水能力。Kunová 等[23]研究結果也證實了乳酸桿菌對溶菌酶具有良好的耐受性，在溶菌酶濃度為400 μg/mL 時，13 株試驗菌株中有8 株對溶菌酶具有完全耐藥性，而且能夠正常利用所有益生元。劉紋芳等[24]對乳酸菌培養(yǎng)液和微生物溶菌酶聯(lián)合應用的體外抑菌效果進行了測定，其結果表明乳酸菌培養(yǎng)液和微生物溶菌酶聯(lián)合應用提高了微生物溶菌酶的抗菌活性，并且其抗菌活性為協(xié)同作用。目前保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳亞種的抑菌活性已被證實[25-27]，其與微生物源溶菌酶的聯(lián)合可考慮作為新的抑菌組合被應用。

溶菌酶的抑菌效果主要歸因于其能有效水解細菌細胞壁的肽聚糖，細菌細胞壁肽聚糖含量的差異使溶菌酶對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌的抑菌效果有所不同。目前國內(nèi)外市場使用較多的溶菌酶制劑為雞蛋清溶菌酶，但是其對革蘭氏陰性菌、真菌等的抑菌能力較差，因此會對其進行化學改性、生物改性和物理改性以擴大抑菌范圍和提高抑菌效果[28]。呂淑霞等[29]發(fā)現(xiàn)植物源蘿卜溶菌酶的抑菌譜較雞蛋清溶菌酶更為廣泛，其對大腸桿菌抑菌效果最好，優(yōu)于其他3 種革蘭氏陽性菌，對釀酒酵母、總狀毛霉的抑菌效果較好，對鼠傷寒沙門氏桿菌、青霉相對較差。相較而言，微生物源溶菌酶或許具有更為廣泛的抑菌譜，可以滿足實際應用中不同的需求。

2.2 體外抗炎測定

2.2.1 微生物源溶菌酶對小鼠巨噬細胞RAW264.7 存活率的影響試驗

巨噬細胞作為調控炎癥反應的中心細胞，在炎癥發(fā)生、維持、解決的過程中起著關鍵作用[30]，巨噬細胞通過抗原呈遞、吞噬、產(chǎn)生細胞因子等方式在炎癥發(fā)生過程中進行免疫調節(jié)[31]。本文以RAW264.7 小鼠巨噬細胞為炎癥模型，探究微生物源溶菌酶的抗炎活性。根據(jù)抑菌活性測定結果，選取微生物源溶菌酶樣品具有較好抑菌效果的濃度進行體外抗炎活性測定，分別設置不同質量濃度（1、10、50、100、200 mg/mL）同時干預小鼠巨噬細胞RAW264.7 進行MTT 試驗測定各組細胞的存活率，結果如圖2所示。

圖2 不同濃度微生物源溶菌酶對RAW264.7 細胞存活率影響Fig.2 Effects of different concentrations of microbial lysozyme on the survival rate of RAW264.7 cells

由圖2 可知，與空白對照相比，不同質量濃度的微生物源溶菌酶對RAW264.7 細胞的存活率產(chǎn)生了一定的影響。質量濃度在10～200 mg/mL 時，細胞存活率顯著降低，說明過高濃度的微生物源溶菌酶對巨噬細胞毒性較大。當質量濃度為1 mg/mL 時細胞存活率沒有受到抑制，說明低于1 mg/mL 的濃度對巨噬細胞無毒性。因此，選擇質量濃度1 mg/mL 及以下的微生物源溶菌酶進行抗炎活性評價。

2.2.2 微生物源溶菌酶處理下細胞中NO 分泌量分析

NO 作為跨膜分子信號能損傷機體周圍組織，當發(fā)生炎癥反應時巨噬細胞會分泌大量NO，因此在炎癥模型中，通過NO 分泌量的變化可以判斷炎癥反應是否得到改善[32]。LPS 是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成成分，能夠誘導機體的免疫反應，作為巨噬細胞的活化劑可以使其分泌多種炎癥因子，使RAW264.7 細胞產(chǎn)生炎癥急劇增加NO 分泌量[33]。地塞米松是一種糖皮質激素，被廣泛應用于治療炎癥性疾病[34]。因此，本文采用LPS 誘導的巨噬細胞炎癥模型探究微生物源溶菌酶的抗炎活性。微生物源溶菌酶處理對細胞中NO分泌量影響結果如圖3所示。

圖3 微生物源溶菌酶處理對細胞中NO 分泌量影響Fig.3 The secretion of NO in cells treated with microbial lysozyme

由圖3 可知，與空白對照組（C）相比，模型組（M）RAW264.7 細胞中的NO 分泌量顯著提高（P＜0.05），陽性對照組（Y）由于加入藥物地塞米松顯著降低了細胞中NO 分泌量（P＜0.05），由此證明本試驗建模成功。不同質量濃度的微生物源溶菌酶（0.2～1.0 mg/mL）在一定程度上降低了RAW264.7 細胞中的NO 分泌量，且濃度越高，NO 分泌量越小，與模型組相比最高可降低57.92%，說明微生物源溶菌酶具有一定的抗炎作用。當微生物源溶菌酶質量濃度為1.0 mg/mL 時，可以在保證細胞較高存活率的同時，使細胞中的NO 分泌量最低。

2.2.3 微生物源溶菌酶處理下細胞中TNF-α 分泌量分析

NF-kB 是經(jīng)典的炎癥信號通路，炎癥發(fā)生時該通路被激活，進而促進炎癥因子TNF-α 的大量表達[35]，在炎癥性疾病中TNF-α 水平過高會引起巨噬細胞釋放多種炎癥因子[36]，因此，炎癥因子TNF-α 的分泌量是抗炎活性評價的指標之一。不同質量濃度的微生物源溶菌酶對RAW264.7 細胞的炎癥因子TNF-α 分泌量的影響見圖4。

圖4 不同濃度微生物源溶菌酶處理下細胞中TNF-α 分泌量Fig.4 The secretion of TNF-α in the cells treated with different concentrations of microbial lysozyme

由圖4 可知，與模型組相比，3 個質量濃度的微生物源溶菌酶對炎癥因子TNF-α 的分泌有較明顯抑制作用，最高可降低36.75%。隨著質量濃度的增加，巨噬細胞內(nèi)TNF-α 的分泌量呈下降趨勢，與NO 分泌量變化趨勢相一致，說明微生物源溶菌酶具有良好的改善炎癥的效果。

3 結論

溶菌酶在不同的生物類群中都有發(fā)現(xiàn)，不同來源的溶菌酶抑菌效果和抑菌機制都有所不同。本研究對微生物源溶菌酶進行了體外抑菌活性及抗炎活性的測定，針對試驗中的14 種供試菌，微生物源溶菌酶具有良好的廣譜抑菌效果，MIC 數(shù)據(jù)表明對不同菌種而言微生物源溶菌酶的抑菌效果有所差異，具有選擇抑菌性。同時，微生物源溶菌酶在一定程度上對保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳亞種3 種乳酸菌的生長具有促進作用，微生物源溶菌酶和乳酸菌的聯(lián)合利用是否可以提高抑菌效果使其具有更為廣泛的抑菌譜可作為新的研究方向。微生物源溶菌酶對LPS 誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7 炎癥模型也表現(xiàn)出明顯的抗炎效果，在預防或治療炎癥性疾病方面具有一定應用潛力，其良好的抑菌效果和抗炎活性為進一步開發(fā)新型功能性產(chǎn)品提供了依據(jù)。