細(xì)胞膜通透性對(duì)大黃歐文氏菌異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

李曉亞，吳甜甜，王洪玲，葛文沛，劉娜

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

近年來(lái)，低熱量、低糖食品逐漸成為消費(fèi)趨勢(shì)。攝入的糖分過(guò)高會(huì)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為脂肪，導(dǎo)致發(fā)胖，甚至引起高血脂、高血壓、糖尿病等疾病。因此，肥胖、糖尿病和齲齒等問(wèn)題使消費(fèi)者對(duì)蔗糖替代品的需求升高。有研究表明，低糖、低熱量的飲食方式不僅能改善高血脂癥狀，降低機(jī)體患糖尿病、心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]，還有助于維持長(zhǎng)時(shí)間的飽腹感和持續(xù)的能量釋放，從而進(jìn)一步對(duì)身體和精神狀況產(chǎn)生積極影響，這使功能性甜味劑得到廣泛關(guān)注[2]。異麥芽酮糖（6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-呋喃果糖）又名帕拉金糖，是蔗糖的一種同分異構(gòu)體，1957年由威登·哈根和洛倫茲首次發(fā)現(xiàn)[3-4]，除具有與蔗糖類(lèi)似的物理性質(zhì)和口感外，還有低熱量、不致齲、不吸濕、耐酸解的特點(diǎn)[5]，其甜度約為蔗糖的50%，適合作為蔗糖的替代品[6]。已有國(guó)家將異麥芽酮糖認(rèn)證為公認(rèn)安全級(jí)食品[7]，可防止脂肪過(guò)量積累[8]，食用后不會(huì)引起血糖與胰島素的迅速上升，有助于糖尿病的防治[9-10]。異麥芽酮糖作為功能型甜味劑，越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于食品與醫(yī)療行業(yè)。

異麥芽酮糖天然存在于甜菜、糖蜜和糖漿等食物中，但其含量微乎其微，提取困難，無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求[11]。目前，異麥芽酮糖的主要來(lái)源是以微生物轉(zhuǎn)化法為主。大黃歐文氏菌（Erwiniarhubarb）DXW-62 中的蔗糖異構(gòu)酶（α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，sucrose isomerase，簡(jiǎn)稱(chēng)SIase，EC 5.4.99.11）可以將蔗糖異構(gòu)為異麥芽酮糖，但該酶為胞內(nèi)酶[8，12]。改變DXW-62 的細(xì)胞膜通透性有利于蔗糖與蔗糖異構(gòu)酶的接觸，從而提高蔗糖異構(gòu)酶的催化效率。超聲波可以提高細(xì)胞膜的通透性，經(jīng)超聲波作用后的細(xì)胞膜對(duì)鉀和鈣離子的通透性會(huì)發(fā)生較大的改變[13]。從而增強(qiáng)生物膜的彌散性，促進(jìn)物質(zhì)交換，加速代謝，改善組織營(yíng)養(yǎng)。吐溫-80 是一種親水性的表面活性劑，具有很強(qiáng)的破壞細(xì)胞膜的作用，也是一種油/水型乳化劑，可用作穩(wěn)定劑、擴(kuò)散劑、抗靜電劑、纖維潤(rùn)滑劑等[14]。丙酮和甲苯可使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)受到破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過(guò)性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋放到胞外。因此，本研究利用超聲波、吐溫-80、丙酮和甲苯等處理方法改變大黃歐文氏菌DXW-62 細(xì)胞膜通透性，加快蔗糖異構(gòu)酶的催化效率，進(jìn)而提高異麥芽酮糖產(chǎn)率，以期為異麥芽酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

大黃歐文氏菌DXW-62：河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，蔗糖40 g/L。

液體培養(yǎng)基[15]：蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，磷酸氫二鈉3 g/L，蔗糖80 g/L。

以上培養(yǎng)基均在115 ℃，30 min 條件下進(jìn)行滅菌處理。

1.2 主要試劑

異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)品：北京沃凱生物科技有限公司；吐溫-80：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙腈（色譜級(jí)）、丙酮、甲苯、磷酸二氫鈉、檸檬酸（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、碘化丙啶（100 μg/mL）：武漢塞維爾生物科技有限公司；蔗糖、氯化鈉（均為分析純）、蛋白胨（生物試劑）、牛肉膏（生物試劑）、瓊脂（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KYC-100B 恒溫培養(yǎng)搖床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LC-2030C 高效液相色譜儀（檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器）：日本島津公司；HWQ-280 恒溫培養(yǎng)箱：寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司；DZKW-S-4 電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；UV-3100PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；Revolve FL 熒光顯微鏡：美國(guó)Echo Laboratories 公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株發(fā)酵液中生長(zhǎng)曲線的建立

比濁法測(cè)菌液OD600：將種子培養(yǎng)基按5%的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基，6.0～16.0 h 定時(shí)取樣，每次取樣取3 個(gè)平行。加入10 mL 濃度為70%蔗糖溶液中，混勻并在40 ℃、180 r/min 搖床中反應(yīng)2.0 h，分別以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600和異麥芽酮糖產(chǎn)率為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線[16]。

1.4.2 異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將異麥芽酮糖配制成0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，過(guò)0.22 μm 的水系濾膜，通過(guò)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定其峰面積，通過(guò)各濃度對(duì)應(yīng)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。檢測(cè)條件：ZORBAX 碳水化合物分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶水=80∶20（體積比），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，運(yùn)行時(shí)間20 min。

1.4.3 細(xì)胞膜的通透性處理

將大黃歐文氏菌DXW-62 接種到固體培養(yǎng)基中過(guò)夜，取DXW-62 接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min中振蕩反應(yīng)10.0 h 至對(duì)數(shù)期（OD600為0.60±0.05）。按5% 的接種量接入100 mL 液體培養(yǎng)基，反應(yīng)10.0 h 得到發(fā)酵液。

超聲波處理：將上述發(fā)酵液繼續(xù)反應(yīng)2.0 h 后置于冰水浴中進(jìn)行超聲波處理。超聲波的作用參數(shù)：變幅桿6，頻率25 kHz，功率分別為45、90、135、180、225、270 W，時(shí)間1 min。取超聲波處理后的發(fā)酵液于4 ℃、9 000×g條件下離心10 min，收集菌體，用去離子水重懸清洗3 次，加入10 mL 濃度為70% 蔗糖溶液中，混勻并在40 ℃、180 r/min 搖床中反應(yīng)，每隔0.5 h 取1 mL 發(fā)酵液于沸水浴5 min 滅酶以終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，以相同條件離心反應(yīng)混合物，上清液稀釋5 倍后經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，采用HPLC 法測(cè)定異麥芽酮糖含量[18]，以未經(jīng)超聲波處理的發(fā)酵液為空白對(duì)照組。

吐溫-80 處理：向發(fā)酵液中加入體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%和6.0%的滅菌吐溫-80 后繼續(xù)反應(yīng)2.0 h，后續(xù)測(cè)定異麥芽酮糖含量的操作同上。

丙酮或甲苯處理：向發(fā)酵液中分別加入丙酮和甲苯，丙酮或甲苯在發(fā)酵液中的體積比分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0% 和4.0%，繼續(xù)反應(yīng)2.0 h，后續(xù)測(cè)定異麥芽酮糖含量的操作同上。

超聲波和吐溫-80 共同處理：以90 W 超聲波和體積分?jǐn)?shù)為5.0% 的吐溫-80 共同處理DXW-62，后續(xù)測(cè)定異麥芽酮糖含量的操作同上。異麥芽酮糖產(chǎn)率（y，%）的計(jì)算公式如下。

y=a/b× 100

式中：a為測(cè)得的反應(yīng)體系中異麥芽酮糖含量，g；b為反應(yīng)體系蔗糖質(zhì)量，g。

1.4.4 細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

檢測(cè)細(xì)胞膜通透性的方法用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色法[19-20]。取1 mL 菌液，在4 ℃、8 000×g條件下離心10 min 去上清液，用PBS 清洗2 次后放入孔板。將100 μg/mL 的PI 染液用PBS 稀釋20 倍，配制成終濃度為5 μg/mL 的PI 染色工作液，向孔板內(nèi)加入適量PI 染色液覆蓋細(xì)胞，室溫避光孵育10 min。孵育后棄去染色液，加入PBS 覆蓋細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞是否呈現(xiàn)紅色熒光。PI 不能穿透完整細(xì)胞膜，死細(xì)胞或凋亡晚期細(xì)胞的核呈紅色熒光。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定均設(shè)計(jì)3 次平行。使用Origin 2021 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL 異麥芽酮糖濃度和所對(duì)應(yīng)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，線性方程為y=14 883x- 5 998.9，R2=0.999 4，相關(guān)性良好。

圖1 異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of isomaltulose

2.2 發(fā)酵液的菌體濃度及異麥芽酮糖產(chǎn)率

在6.0～16.0 h 內(nèi)，定時(shí)取樣檢測(cè)菌體濃度和異麥芽酮糖產(chǎn)率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵液的菌體濃度及異麥芽酮糖產(chǎn)率Fig.2 Cell concentration and isomaltulose yield of fermentation broth

由圖2 可知，在6.0～12.0 h 內(nèi)，異麥芽酮糖產(chǎn)率和菌體濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，在12.0 h 時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率已達(dá)到最高，為53.76%；超過(guò)12.0 h 后異麥芽酮糖產(chǎn)率逐漸下降，菌體濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)增加緩慢。這說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株迅速繁殖，異麥芽酮糖產(chǎn)率逐漸上升，但是培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，菌體生長(zhǎng)繁殖受限[15]，異麥芽酮糖產(chǎn)率下降，在培養(yǎng)16.0 h 時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率下降至45.23%。

由于吐溫-80、丙酮和甲苯是有機(jī)試劑，需要與菌體接觸反應(yīng)2.0 h 才能測(cè)定異麥芽酮糖產(chǎn)率。綜上所述，在培養(yǎng)12.0 h 時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率最高，使用超聲波處理菌體；在培養(yǎng)10.0 h 時(shí)，菌株生長(zhǎng)速度最快，分別添加吐溫-80、丙酮和甲苯到培養(yǎng)基中。

2.3 不同超聲功率對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

不同超聲功率對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同超聲功率對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic waves with different power on isomaltolose yield

由圖3 可知，與對(duì)照組相比，采用不同功率的超聲波處理?xiàng)l件均可提高異麥芽酮糖產(chǎn)率。當(dāng)時(shí)間為2.0 h，對(duì)照組的異麥芽酮糖產(chǎn)率為54.47%，同時(shí)超聲功率為45 W 時(shí)，異麥芽酮糖產(chǎn)率為65.03%；超聲功率為90 W 時(shí)，異麥芽酮糖產(chǎn)率為72.30%。超聲功率為270 W 時(shí)，異麥芽酮糖產(chǎn)率為61.07%，比對(duì)照組高12.12%。這是由于低功率超聲波可以使細(xì)胞短時(shí)局部破裂，改變細(xì)胞膜的通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放或胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而使異麥芽酮糖產(chǎn)率上升。但是隨著超聲功率的增大，對(duì)細(xì)胞破壞程度加大，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放導(dǎo)致細(xì)胞失活，戴傳云等[21]也驗(yàn)證了低功率超聲波可以導(dǎo)致細(xì)胞的非熱生物效應(yīng)，使細(xì)胞表面瞬間造成微傷，改變細(xì)胞膜通透性，從而使代謝產(chǎn)物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速通過(guò)細(xì)胞膜，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。

因此，最佳的處理?xiàng)l件為超聲功率90 W，相對(duì)于對(duì)照組，異麥芽酮糖產(chǎn)率達(dá)到80.0% 以上的時(shí)間由4.0 h 縮短為3.0 h。

2.4 吐溫-80 對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

不同濃度的吐溫-80 對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度的吐溫-80 對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of tween-80 with different concentrations on isomaltolose yield

由圖4 可知，只有濃度為6.0%的吐溫-80 處理過(guò)后，異麥芽酮糖產(chǎn)率低于對(duì)照組。當(dāng)時(shí)間為2.5 h 時(shí)，對(duì)照組的異麥芽酮糖產(chǎn)率為60.53%；濃度為2.0% 的吐溫-80 反應(yīng)2.5 h 時(shí)異麥芽酮糖的產(chǎn)率為63.65%，與對(duì)照組相比高5.15%；濃度為5.0% 的吐溫-80 反應(yīng)2.5 h 時(shí)異麥芽酮糖的產(chǎn)率為83.14%，與對(duì)照組相比高37.35%；濃度為6.0%的吐溫-80 反應(yīng)2.5 h 時(shí)，異麥芽酮糖產(chǎn)率低于對(duì)照組，只有60.29%?？梢院侠硗茰y(cè)低濃度的吐溫-80 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，濃度過(guò)高時(shí)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)酶有明顯的抑制作用。原因是吐溫-80為非離子型表面活性劑，可以將脂類(lèi)溶解來(lái)改變細(xì)胞膜通透性[22]，能夠有效提高異麥芽酮糖產(chǎn)率。綜上，選用濃度為5.0%的吐溫-80 作為處理?xiàng)l件。

2.5 丙酮對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

不同濃度的丙酮對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度的丙酮對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of acetone with different concentrations on isomaltolose yield

如圖5所示，所有濃度的丙酮處理均可使大黃歐文氏菌DXW-62 的異麥芽酮糖產(chǎn)率提高。當(dāng)時(shí)間為3.5 h 時(shí)，對(duì)照組的異麥芽酮糖產(chǎn)率為76.90%；添加濃度為0.5% 的丙酮反應(yīng)3.5 h 時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率為81.01%，比對(duì)照組高5.34%。添加濃度為2.0%的丙酮反應(yīng)3.5 h 時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率為83.04%，比對(duì)照組高7.98%。添加濃度為4.0%的丙酮反應(yīng)3.5 h 時(shí)異麥芽酮糖產(chǎn)率為81.02%，比對(duì)照組高5.36%。這是由于丙酮可以破壞脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)暴露在外部環(huán)境中，所以添加少量的丙酮可以增大細(xì)胞膜通透性[23]，提高異麥芽酮糖產(chǎn)率。但是與功率為90 W 超聲波和添加濃度為5.0% 的吐溫-80 處理相比，濃度為2.0%的丙酮對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率提高較少。綜上，應(yīng)用濃度為2.0%的丙酮處理大黃歐文氏菌DXW-62。

2.6 甲苯對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

不同濃度的甲苯對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 不同濃度的甲苯對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of toluene with different concentrations on isomaltulose yield

由圖6 可知，不同濃度的甲苯對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率有很大影響。在3.5 h 時(shí)對(duì)照組的異麥芽酮糖產(chǎn)率為76.90%；添加濃度為0.5% 的甲苯反應(yīng)3.5 h 時(shí)，異麥芽酮糖產(chǎn)率為77.44%；添加濃度為1.0% 的甲苯反應(yīng)3.5 h 時(shí)，異麥芽酮糖產(chǎn)率為77.52%；添加濃度為2.0%的甲苯反應(yīng)3.5 h 時(shí)，異麥芽酮糖產(chǎn)率為72.41%，此時(shí)產(chǎn)率已經(jīng)比對(duì)照組低，繼續(xù)用濃度為3.0%和4.0%甲苯處理，異麥芽酮糖產(chǎn)率相比于對(duì)照組越來(lái)越低。由此可知低濃度甲苯處理對(duì)菌體細(xì)胞影響較小，能夠小幅度提高異麥芽酮糖產(chǎn)率，而高濃度甲苯能夠溶解大黃歐文氏菌DXW-62 細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜破損使細(xì)胞失活，所以異麥芽酮糖產(chǎn)率下降，劉曉艷等[14]的研究也表明了甲苯對(duì)細(xì)胞膜的損傷較大。綜上所述，添加濃度為1.0%的甲苯作為處理?xiàng)l件最佳。

2.7 超聲波與吐溫-80 共同處理對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響

90 W 功率的超聲波和濃度為5.0% 的吐溫-80 共同處理大黃歐文氏菌DXW-62，結(jié)果如圖7所示。

圖7 超聲波和吐溫-80 共同作用對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響Fig.7 Effect of ultrasound wave and tween-80 on isomaltulose yield

圖7 結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)超聲波與吐溫-80 的共同作用后，并未提高異麥芽酮糖產(chǎn)率，產(chǎn)率最大為63.75%，此時(shí)對(duì)照組麥芽酮糖產(chǎn)率為82.99%，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比低23.18%。這是因?yàn)椴捎贸暡ê屯聹?80 共同處理對(duì)細(xì)胞的破碎程度更大，導(dǎo)致細(xì)胞失活。經(jīng)過(guò)超聲波和吐溫-80 共同處理后的細(xì)胞破損程度太大，從而使細(xì)胞失活，導(dǎo)致異麥芽酮糖產(chǎn)率降低。

2.8 經(jīng)PI 染色法后的熒光顯微鏡觀察結(jié)果

PI 染色結(jié)果如圖8所示。

圖8 PI 染色法的熒光顯微鏡觀察結(jié)果Fig.8 Observation results of fluorescence microscope by PI staining method

由圖8 可知，對(duì)照組極少細(xì)胞被PI 染色；濃度為5.0% 的吐溫-80 處理后細(xì)胞顯紅色熒光細(xì)胞數(shù)量比90 W 功率超聲波處理后的數(shù)量多；然后吐溫-80 和超聲波共同作用下，顯紅色熒光細(xì)胞數(shù)量明顯多于其余單因素處理。

顯紅色熒光細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞膜通透性越強(qiáng)[24]。試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞膜通透性在一定程度上可以提高異麥芽酮糖產(chǎn)率，但是如果細(xì)胞膜通透性越大，那么細(xì)胞破碎就越多，這樣反而會(huì)使異麥芽酮糖產(chǎn)率下降。

3 結(jié)論

本文通過(guò)研究不同的處理方法對(duì)大黃歐文氏菌DXW-62 的細(xì)胞膜通透性的改變，探究其對(duì)異麥芽酮糖產(chǎn)率的影響。結(jié)果表明，使用功率為90 W 的超聲波處理后，反應(yīng)2.0 h 時(shí)和其他功率的超聲波相比，異麥芽酮糖產(chǎn)率最高為72.30%，高于對(duì)照組（54.47%）；利用濃度為5.0% 的吐溫-80 處理，繼續(xù)反應(yīng)2.5 h 后異麥芽酮糖產(chǎn)率相比其他濃度的吐溫-80 最高，為83.14%；在超聲波和吐溫-80 共同處理下，比對(duì)照組的異麥芽酮糖產(chǎn)率下降了23.18%，通過(guò)碘化丙啶染色觀察可知顯紅色熒光細(xì)胞數(shù)量最多。