荷葉山楂杜仲葉復(fù)配提取物對大鼠脂質(zhì)代謝的協(xié)同調(diào)控作用

任思敏，徐維佳，陳昭聞，王詳，侯歡，葛建*

（1.中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018；2.浙江山嶼?？叼B(yǎng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江杭州 310011）

脂質(zhì)代謝紊亂是當(dāng)今社會一類普遍發(fā)生的機(jī)體脂質(zhì)代謝綜合征，是動脈粥樣硬化、脂肪肝等疾病最主要病因[1]。目前，臨床上主要以化學(xué)藥物干預(yù)為主[2]，但效果并不理想而且具有一定的毒副作用[3]。因此，從日常膳食角度進(jìn)行干預(yù)是調(diào)控機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂的重要途徑。目前有大量研究表明植物源提取物對脂質(zhì)代謝紊亂具有顯著調(diào)控功能[4-7]，其主要功能成分包括黃酮[8]、類黃酮[9]、皂苷[10]以及生物堿類[11-12]，研究主要采用單一組分或單一植物提取物進(jìn)行研究。而單一植物往往功能有限，很難達(dá)到理想效果，張?jiān)略碌萚13]研究結(jié)果表明雷公藤甲素配伍槲皮素對肺癌和食管癌細(xì)胞均有抗癌增效作用，并均呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。因此通過多個藥食同源類成分復(fù)配來實(shí)現(xiàn)功能上的協(xié)同作用成為近年來關(guān)注的熱點(diǎn)，也與當(dāng)今“全食品”[14-15]和“復(fù)配食品”[16-17]理念一致。

荷葉（Nelumbinisfolium）、山楂（CrataeguspinnatifidaBunge）和杜仲葉（EucommiaulmoidesOliv）都屬我國重要的藥食同源類新食品資源[18]。荷葉味苦、性平，歸肝、脾、胃、心經(jīng)，具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血等功效，荷葉中含豐富的黃酮和生物堿類化合物，其中荷葉堿是荷葉中富含的一種異喹啉類生物堿，不僅是荷葉中的指征成分，也是產(chǎn)生藥理作用的重要成分，荷葉堿通過激活肝臟PGC1α，引起PPARα上升，下游脂肪酸氧化基因上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)氧化代謝，改善脂質(zhì)分布，起到降脂作用[19-20]。山楂味酸、甘，性微溫，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂功效，含有大量有機(jī)酸和黃酮化合物等，山楂及山楂黃酮可能通過增強(qiáng)低密度脂蛋白受體活性和提高抗氧化能力預(yù)防脂質(zhì)代謝紊亂[21]。杜仲葉性溫、味甘，歸肝、腎經(jīng)，作為一種新資源食品具有調(diào)控高血壓、高血脂和高血糖等功能，其中杜仲葉總黃酮通過調(diào)節(jié)血脂參數(shù)，降低總膽固醇、甘油三酯、載體脂蛋白B 和低密度脂蛋白膽固醇的水平，并顯著提高高密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白A 的含量，從而發(fā)揮降脂作用[22]。因此，綜合荷葉、山楂和杜仲葉的食品性味歸經(jīng)優(yōu)勢，研究其復(fù)配物協(xié)同調(diào)控脂質(zhì)代謝功能及其機(jī)理，為荷葉、山楂和杜仲葉等藥食同源類功能食品功效機(jī)制以及新產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷葉、山楂、杜仲葉：市售，經(jīng)中國計(jì)量大學(xué)現(xiàn)代科技學(xué)院孫駿威副教授鑒定，為藥食同源類荷葉、山楂和杜仲葉。乙醇（95%，分析純）、石蠟、二甲苯（98.5%，分析純）、蘇木精染液（99%）、伊紅染液（5%）：杭州米克化工儀器有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒：南京建成生物工程有限公司；TRIzol?Plus RNA Purification 試劑盒、SuperScript?III First-Strand Synthesis SuperMix 試劑盒：美國Thermo Fisher 公司；雄性Wistar 大鼠[（200±20）g]：上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證編號為SCXK（滬）2017-0005。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M5 多功能酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices 公司；HWS-24 恒溫水浴鍋：上海常思工貿(mào)有限公司；DTH-2050R 離心機(jī)：上海德洋意邦儀器有限公司；OLYMPUS BX60 型熒光顯微鏡攝像機(jī)：日本OLYMPUS 公司；Leica HI120 型攤片機(jī)、TP1020 全自組織脫水機(jī)：德國Leica 公司；CFX384 多重實(shí)時熒光定量PCR 儀：美國Bio-Rad 公司；MV-10 全自動超臨界萃取儀/Waters XevoG2-XSQTof 高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：美國Waters 公司；Eclipse Ci-E/L/S 光學(xué)顯微鏡：日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)配提取物制備及化學(xué)成分表征

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的荷葉、杜仲葉和山楂（去核），粉碎后過60 目篩，然后稱取單一粉末各100 g 加入超臨界萃取儀的萃取罐中，同時加入100 mL 乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)70%）作為夾帶劑，在室溫條件下浸泡過夜，萃取壓力控制在25～30 MPa，萃取劑二氧化碳流速保持10 L/h，分離釜I 和II 溫度分別控制在70 ℃和75 ℃，萃取壓力均為6.0 MPa。將萃取物濃縮成50 g 生藥/mL的復(fù)配提取液。取25 mL 復(fù)配提取液蒸干，殘?jiān)?5 mL 甲醇溶解，離心（12 000 r/min，10 min）取上清液，過0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

1.3.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：采用Waters XevoG2-XSQTof 高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，色譜柱為ODS C18 HSS T3 系列（1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；保護(hù)柱為XBridge C18（1.8 μm，20 mm×2.1 mm）；流動相A 為水（含0.1% 甲酸）、流動相B 為甲醇；流速0.3 mL/min ；進(jìn)樣體積5 μL，梯度洗脫條件見表1。

表1 荷葉山楂杜仲葉復(fù)配提取物色譜梯度洗脫條件Table 1 Chromatographic gradient elution conditions for the compound extracts of lotus leaf，hawthorn，and Eucommia ulmoides leaf

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，正、負(fù)離子模式檢測；掃描范圍m/z100～900 Da；毛細(xì)管電壓2 kV；碎裂電壓130 V；碰撞電壓30 V；脫溶劑溫度320 ℃；脫溶劑氣體流速600 L/h。數(shù)據(jù)工作站為Waters MassLynxV4.1。

1.3.3 動物實(shí)驗(yàn)

首先將實(shí)驗(yàn)大鼠于實(shí)驗(yàn)動物中心無特定病原體（specific pathogen free，SPF）動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)室相對濕度（60±5）%，白天/夜晚設(shè)置為12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)方案由中國計(jì)量大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（2022-005）。適應(yīng)性養(yǎng)殖后，將36 只大鼠隨機(jī)分為6 組，每組6 只，分別為空白對照組、高脂模型組、荷葉組、山楂組、杜仲葉組以及復(fù)配干預(yù)組，空白對照組和高脂模型組大鼠分別飼喂正常飼料和高脂飼料，每天定期口灌生理鹽水，干預(yù)組為飼喂高脂飼料，每天定期口灌提取物，單一提取物劑量均為100 g 生藥/kg，復(fù)配提取物劑量為16 g 荷葉+80 g 山楂+4 g 杜仲葉生藥/kg。大鼠正常飼料營養(yǎng)指標(biāo)如表2所示，高脂飼料配方為10% 豬油、10% 蛋黃粉、2% 膽固醇、0.1% 膽酸鹽、6%酪蛋白、1.2%預(yù)混料、3%麥芽糊精，其余基礎(chǔ)日糧。

表2 大鼠正常飼料配方Table 2 Normal diet of rats

1.3.3.1 血清生化檢測

不同處理組大鼠于8 周后，眼靜脈叢采血，離心（4 ℃，3 500 r/min，15 min）分離血清。根據(jù)試劑盒說明書，檢測不同處理組大鼠血清中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 濃度變化。

1.3.3.2 肝臟病理組織學(xué)檢查

切除大鼠肝臟左側(cè)葉部分，于10%福爾馬林溶液中固定，于自動脫水機(jī)內(nèi)脫水后，進(jìn)行透明和浸蠟及石蠟包埋，然后石蠟切片機(jī)切片，制備厚度3～4 μm 切片，烘箱烘干后用于蘇木精-伊紅染色法（hematoxylineosin staining，HE）染色。染色前對切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蘇木精和伊紅染色，中性樹膠封片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3.3 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)

采用TRIzol?Plus RNA Purification 試劑盒和SuperScript?III First-Strand Synthesis SuperMix 試劑盒對不同處理組大鼠肝臟和小腸組織分別進(jìn)行總RNA 提取以及第一鏈cDNA 合成，具體步驟參照試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)選取GAPDH為內(nèi)參基因，采用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司負(fù)責(zé)合成，引物見表3。后采用PowerUpTMSYBRTM Green Master Mix 進(jìn)行熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR），反應(yīng)體系：Power SYBR?Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA 模板1.0 μL，補(bǔ)充ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸25 s，進(jìn)行40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同組織中基因的相對表達(dá)量。

表3 大鼠肝臟和小腸組織相關(guān)基因引物序列Table 3 Primer sequences of related genes in rat liver and small intestine

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有檢測數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異性分析采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)配提取物化學(xué)成分分析

在擬定的檢測條件下，取供試品溶液進(jìn)樣分析，正負(fù)離子模式下的總提取離子流圖見圖1。

圖1 復(fù)配提取物負(fù)離子模式和正離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the compound extracts in negative and positive ion modes

通過Waters MassLynxV4.1 軟件分析一級質(zhì)譜提供的化學(xué)成分的保留時間、精確準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰等信息并利用Elemental Composition 工具計(jì)算化合物元素組成和可能分子式，對各色譜峰進(jìn)行初步鑒定，再結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)、裂解規(guī)律等信息進(jìn)行比對，進(jìn)一步確認(rèn)化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)，具體見表4。

表4 復(fù)配提取物的化合物鑒定Table 4 Compounds in the compound extracts

2.2 復(fù)配提取物對大鼠體質(zhì)量的影響

不同處理組大鼠體質(zhì)量變化結(jié)果見圖2。

圖2 不同處理組大鼠體質(zhì)量變化Fig.2 Changes in body mass of rats in different treatment groups

由圖2 可知，不同處理組大鼠干預(yù)8 周后，與空白對照組相比，高脂模型組大鼠體質(zhì)量極顯著升高（P＜0.01），而與高脂模型組相比，單一提取物組和復(fù)配干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均極顯著下降（P＜0.01），與單一提取物組相比，復(fù)配干預(yù)組大鼠體質(zhì)量也有所下降，但差異不明顯。說明與高脂模型組相比，復(fù)配提取物能夠明顯降低大鼠體質(zhì)量。

2.3 復(fù)配提取物對大鼠血脂水平的影響

復(fù)配提取物對脂質(zhì)代謝基因表達(dá)的影響如圖3所示。

圖3 不同處理組大鼠血脂水平變化Fig.3 Changes in serum lipid levels in rats of different treatment groups

由圖3 可知，不同處理組大鼠血脂水平與高脂模型組相比存在顯著差異，與空白對照組相比，高脂模型組大鼠血脂TG、TC 和LDL-C 濃度升高，而HDL-C 濃度降低。給予不同單一提取物和復(fù)配提取物干預(yù)8 周后，與高脂模型組大鼠相比，復(fù)配干預(yù)組大鼠血脂TG、TC 和LDL-C 濃度均顯著降低（P＜0.05），同時HDL-C濃度顯著提高（P＜0.05），說明復(fù)配提取物均能夠顯著改善大鼠血脂TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平。

2.4 復(fù)配提取物對大鼠肝臟脂肪的影響

不同處理組大鼠肝臟HE 染色結(jié)果見圖4。

圖4 不同處理組大鼠肝臟HE 染色結(jié)果（100×）Fig.4 HE staining results of rat livers in different treatment groups（100×）

由圖4 可知，高脂模型組大鼠肝臟脂肪空泡明顯多于空白對照組和荷葉組、山楂組、杜仲葉組以及復(fù)配干預(yù)組，且高脂模型組部分細(xì)胞內(nèi)存在氣球樣變、肝細(xì)胞變大，肝細(xì)胞核質(zhì)收縮變形，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞。與高脂模型組相比，復(fù)配干預(yù)組肝組織中脂滴空泡顯著減少，而與單一提取物組相比，復(fù)配干預(yù)組大鼠肝臟組織中細(xì)胞結(jié)構(gòu)更為清晰，而且細(xì)胞核界限更明顯，同時細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核結(jié)構(gòu)更完整，表明復(fù)配提取物較單一提取物具有更明顯的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用。

2.5 復(fù)配提取物對脂質(zhì)代謝基因表達(dá)的影響

復(fù)配提取物對脂質(zhì)代謝基因表達(dá)的影響結(jié)果見圖5。

本實(shí)驗(yàn)選取了肝臟和小腸中5 個脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因，圖5 結(jié)果顯示與空白對照組組相比，高脂模型組肝臟中CYP7A1和PPARα顯著下降，HMGCR表達(dá)水平顯著升高；小腸中NPC1L1表達(dá)顯著升高，而ABCG5表達(dá)顯著降低。與高脂模型組相比，復(fù)配干預(yù)組大鼠肝臟中CYP7A1和PPARα均顯著升高，HMGCR表達(dá)水平顯著降低；小腸中NPC1L1表達(dá)顯著降低，而ABCG5表達(dá)顯著升高。結(jié)果顯示復(fù)配提取物可通過上調(diào)PPARα/CYP7A1基因表達(dá)，同時在小腸層面降低NPC1L1和升高ABCG5表達(dá)，達(dá)到降低血脂的作用。

3 討論

荷葉和山楂近年來一直作為藥食同源類新食品資源在功能食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。荷葉中主要活性成分為荷葉生物堿和黃酮類，研究表明生物堿類為主要降脂減肥功效成分，荷葉生物堿為有機(jī)弱堿類阿樸菲生物堿，水溶性極差（溶解度為16 mg/L）[23]，從而使得荷葉生物堿在胃腸道分散性較差，生物利用度較低。山楂性味酸，其主要含有有機(jī)酸類和黃酮類成分。因此，荷葉與山楂等酸性食品復(fù)配使用，能夠顯著達(dá)到協(xié)同增效的功能，這與本研究結(jié)果一致。

杜仲葉作為新食品資源已被收入藥食同源類新食品資源目錄，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨功效，有研究顯示杜仲葉提取物能顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠血脂水平，改善肝臟脂肪變性，對非酒精性脂肪肝有明顯防治作用[24]。同時，荷葉、山楂和杜仲葉都?xì)w肝經(jīng)，均具有降脂功效，從食物性味歸經(jīng)和功能活性角度，均顯示荷葉、山楂和杜仲葉復(fù)配能夠顯著調(diào)控脂質(zhì)代謝紊亂。因此，本文以荷葉、山楂、杜仲葉及其復(fù)配提取物為主要研究對象，深入探究荷葉、山楂、杜仲葉單一及其復(fù)配物的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能，為藥食同源類植物復(fù)配機(jī)制研究提供借鑒。

CYP7A1為肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇向膽汁酸合成的限速酶，高脂飲食能夠顯著抑制酶表達(dá)，而提取物通過明顯誘導(dǎo)該酶表達(dá)水平，從膽固醇排泄途徑加速了消除，從而達(dá)到降低膽固醇功能[25]。PPARα為肝細(xì)胞內(nèi)一種重要轉(zhuǎn)錄因子，本研究發(fā)現(xiàn)提取物顯著誘導(dǎo)PPAR-α基因表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)控脂質(zhì)代謝基因表達(dá)，這與文獻(xiàn)相關(guān)報(bào)道一致[26-27]。NPC1L1和ABCG5分別為小腸黏膜細(xì)胞中膽固醇攝取和外排的重要蛋白[28]。因此本研究結(jié)果表明，荷葉、山楂、杜仲葉單一提取物以及復(fù)配提取物均能調(diào)控脂質(zhì)代謝，其中復(fù)配提取物具有更顯著調(diào)控高脂所致血脂水平能力，保護(hù)肝臟脂肪變性，且其調(diào)節(jié)機(jī)制與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因HMGCR、CYP7A1、PPARα、NPC1L1和ABCG5表達(dá)水平改變有關(guān)。

近年來，大量研究表明腸道菌群可通過影響參與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因調(diào)節(jié)宿主的物質(zhì)與和能量代謝。已有研究表明若腸道微生物穩(wěn)態(tài)失衡，將導(dǎo)致肥胖癥、糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展[29]。宋晶晶[30]的研究表明枸杞甘草配制酒能夠影響免疫低下的小鼠腸道菌群，提高有益菌的數(shù)量，抑制致病菌的生長繁殖。然而本實(shí)驗(yàn)雖明確了荷葉、山楂和杜仲葉復(fù)配提取物具有協(xié)同增效作用，后續(xù)可從腸道菌群角度進(jìn)行進(jìn)行機(jī)制探究。

4 結(jié)論

本研究以與單一植物提取物相比，探究荷葉、山楂、杜仲葉復(fù)配提取物協(xié)同血脂調(diào)節(jié)作用。采用超臨界萃取技術(shù)得到荷葉、山楂、杜仲葉以及復(fù)配提取物，對高脂飼養(yǎng)的Wistar 大鼠進(jìn)行灌胃，并進(jìn)行肝臟形態(tài)學(xué)觀察和脂質(zhì)代謝基因表達(dá)水平檢測。結(jié)果表明，荷葉、山楂和杜仲葉提取物均能夠顯著調(diào)控肝臟和小腸中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)，其調(diào)節(jié)機(jī)制通過上調(diào)PPARα/CYP7A1基因表達(dá)，同時在小腸層面降低NPC1L1和升高ABCG5，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。同時與單一提取物相比，復(fù)配提取物又顯著增強(qiáng)了脂質(zhì)代謝調(diào)控功能。綜上所述，將荷葉、山楂和杜仲葉復(fù)配提取后，可進(jìn)一步增強(qiáng)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，且具有協(xié)同增效特點(diǎn)。