米糠球蛋白的糖基化改性及其與兩種多酚的非共價(jià)作用

孫靖宇，張風(fēng)姣，唐彩云，鄭霄，劉金光，曲亞男，陳義倫，劉玉茜

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

米糠是稻谷經(jīng)過(guò)礱谷、碾磨等工序后所得的副產(chǎn)物，含有豐富的谷維素、植物甾醇、維生素E 和角鯊烯等生物活性物質(zhì)，對(duì)預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)血糖、控制肥胖、預(yù)防腫瘤、抗疲勞等均有顯著的效果[1]。然而大部分米糠被用作飼料及焚燒處理，造成了資源浪費(fèi)。米糠中蛋白質(zhì)含量豐富，與其他谷物蛋白相比，米糠蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，其生物效價(jià)為2.0～2.5，與牛奶中酪蛋白相近，優(yōu)于小麥蛋白、玉米蛋白和大豆蛋白等植物蛋白[2]。米糠蛋白主要由球蛋白、清蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白組成，且米糠球蛋白為生理活性蛋白，由單鏈組成，氨基酸組成更加合理[3]，但米糠球蛋白作為米糠蛋白中的鹽溶性成分，水溶性較差，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。研究表明，蛋白質(zhì)糖基化可以改善蛋白的功能性質(zhì)，且美拉德反應(yīng)是一種典型的常用的非酶糖基化方法，其原理為蛋白質(zhì)、肽或氨基酸側(cè)鏈上的游離氨基與還原糖分子末端的羰基縮合發(fā)生反應(yīng)，形成席夫堿并重排為Amadori 或Heyns 產(chǎn)物，通過(guò)增加蛋白質(zhì)表面羥基數(shù)量，改變了蛋白質(zhì)構(gòu)象及組分，改善了蛋白穩(wěn)定性、溶解性等功能性質(zhì)[4-6]，并且美拉德反應(yīng)溫和有效，常被用于蛋白質(zhì)糖基化改性當(dāng)中。通過(guò)美拉德反應(yīng)進(jìn)行糖基化改性有干熱法和濕熱法兩種。與濕熱法相比，干熱法反應(yīng)條件較為溫和，溫度適度可控，且糖基化產(chǎn)物顏色較淺，因此在蛋白的糖基化修飾中應(yīng)用較為廣泛[7]。殼寡糖作為殼聚糖的降解產(chǎn)物，具有分子量低、黏度小、水溶性好等特點(diǎn)，有抗菌、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種功能特性，且比殼聚糖更易發(fā)生美拉德反應(yīng)[8]。許多研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖通過(guò)美拉德反應(yīng)接枝到蛋白上改善了蛋白質(zhì)的溶解度、熱穩(wěn)定性和乳化性能[9]。因此，殼寡糖因其無(wú)毒、可生物降解等特點(diǎn)，在通過(guò)美拉德反應(yīng)修飾蛋白方面的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

研究表明，植物多酚可以與蛋白質(zhì)相互作用，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及構(gòu)象，如兒茶素與大豆分離蛋白相互作用后，分子無(wú)序性增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊相對(duì)含量下降，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量增加[10]。綠原酸能與重組大豆種子鐵蛋白（rH-2）發(fā)生相互作用，引起鐵蛋白三級(jí)/四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，而對(duì)其一級(jí)/二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)影響[11]。蛋白與多酚相互作用也能改善蛋白質(zhì)的功能特性。阿魏酸與亞麻籽分離蛋白相互作用后，改善其熱穩(wěn)定性及抗氧化活性[12]。因此蛋白質(zhì)和多酚廣泛運(yùn)用于食品加工中，并且它們之間的相互作用是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和多酚抗氧化活性主要因素。在相互作用過(guò)程中，共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合是相互作用的兩種主要機(jī)制，且非共價(jià)相互作用因反應(yīng)條件溫和在食品體系中更為常見(jiàn)，主要包括疏水相互作用、范德華力、氫鍵和靜電吸引力等[10]。通過(guò)美拉德反應(yīng)進(jìn)行糖基化或與多酚非共價(jià)結(jié)合是改善蛋白質(zhì)性質(zhì)的有效方法。之前的研究報(bào)道了更多關(guān)于二元和三元復(fù)合物對(duì)蛋白質(zhì)修飾的研究，而對(duì)同時(shí)與兩種多酚非共價(jià)結(jié)合的研究較少，且同時(shí)利用糖基化和與兩種多酚非共價(jià)結(jié)合對(duì)蛋白進(jìn)行修飾的應(yīng)用也鮮有研究。因此，本研究使用殼寡糖通過(guò)干法美拉德反應(yīng)對(duì)米糠球蛋白進(jìn)行糖基化修飾，并研究糖基化蛋白與兩種多酚（槲皮素、白藜蘆醇）的非共價(jià)作用，通過(guò)熒光光譜、紅外、粒徑和抗氧化性等進(jìn)行表征和分析，以期為糖基化蛋白-多酚復(fù)合物的制備及擴(kuò)大米糠蛋白在食品的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠：江西清河油脂有限公司；殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）：陜西鳳棲梧生物科技有限公司；槲皮素（quercetin，QR）、白藜蘆醇（resveratrol，RES）、胃蛋白酶（350 NFU/mg）、胰蛋白酶（250 NFU/mg）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白電泳分子量Marker、甘氨酸（glycine，Gly）、福林酚、溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、2，2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、考馬斯亮藍(lán)R-250：北京索萊寶生物科技有限公司；1-苯胺基萘-8-磺酸（1-aminonaphthalene-8-sulfonic acid，1，8-ANS）：賽默飛世爾生物制品有限公司；2，2-二苯基-1-基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；Thermo Scientific Lumina 熒光磷光分光光度計(jì)、Nicoletis5 傅立葉變換紅外光譜儀：賽默飛世爾科技公司；SpectraMax M5 酶標(biāo)儀：上海美谷分子儀器；JY300 垂直電泳槽：上海天能科技有限公司；200PC 差示掃描量熱儀：德國(guó)耐馳儀器制造有限公司；Zetasizer-Nano-ZS 激光納米粒度分析儀：英國(guó)Malvern 公司；Universal Hood lll 凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad 公司；JEM-1200EX 掃描電子顯微鏡：日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米糠球蛋白制備及表征

采用Osborne 分級(jí)提取蛋白質(zhì)的方法提取米糠球蛋白[3]，向脫脂米糠中加入10 倍體積的2% 氯化鈉溶液，室溫條件下攪拌8 h 后，在4 ℃條件下6 000 r/min離心15 min 取上清液，調(diào)節(jié)等電點(diǎn)至4.0。離心15 min（4 ℃，6 000 r/min）后取沉淀，并用蒸餾水洗滌3 次，所得的沉淀即為米糠球蛋白。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）表征所提取的米糠球蛋白[13]。將凍干的蛋白樣品溶于1 mg/mL磷酸鹽緩沖液中（0.05 mol/L，pH7）。電泳的濃縮膠和分離膠凝膠濃度分別為5%和15%。上樣緩沖液與樣品以1∶1（體積比）稀釋?zhuān)浞只靹蚝蠓兴? min，冷卻后上樣。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Marker 作為參照，以120 V恒壓進(jìn)行電泳試驗(yàn)。待電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色，并用蛋白質(zhì)凝膠成像儀進(jìn)行拍照。

1.3.2 米糠球蛋白-殼寡糖糖基化蛋白的制備及表征

按照文獻(xiàn)[7]的方法，將一定質(zhì)量的米糠球蛋白溶解于0.05 mol/L、pH7 的磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebuffered saline，PBS）中，微調(diào)蛋白溶液至pH7，配制得到10 mg/mL 的蛋白液。將米糠球蛋白溶液與殼寡糖以質(zhì)量比2∶1 混合，磁力攪拌20 min 使其充分混勻，倒入培養(yǎng)皿中置于-80 ℃預(yù)凍。將預(yù)凍好的米糠球蛋白-殼寡糖混合液放入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，制備好的樣品放入干燥器中恢復(fù)至室溫。取制備好的米糠球蛋白-殼寡糖混合物置于密閉容器中，將干燥好的樣品放置在康威皿（用飽和KBr 溶液維持容器中相對(duì)濕度79% 左右）中，在45 ℃的條件下反應(yīng)2 h 得到米糠球蛋白-殼寡糖糖基化蛋白。最后將制備好的糖基化蛋白粉末置于-20 ℃中備用。

SDS-PAGE 表征方法同1.3.1。

1.3.3 掃描電鏡

將凍干的米糠球蛋白及糖基化蛋白粘貼在掃描電鏡觀察臺(tái)上，并用離子濺射鍍膜儀對(duì)蛋白進(jìn)行噴金處理。采用加速電壓為20 kV，放大1 500 倍的掃描電子顯微鏡放大觀察米糠球蛋白和糖基化蛋白的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)[13]。

1.3.4 抗消化性

模擬胃液的制備：用5 mL 鹽酸溶液（pH2.0）溶解16 mg 胃蛋白酶，得到模擬胃液。然后分別將40 μL 的2 mg/mL 米糠球蛋白和糖基化蛋白樣品與200 μL 模擬胃液混合，在37 ℃下反應(yīng)2 h，模擬胃消化。反應(yīng)結(jié)束后，加入60 μL 的0.001 mol/L 氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)。同時(shí)模擬腸道消化，向5 mL 的PBS 緩沖液（0.05 mol/L，pH7.0）中加入50 mg 胰蛋白酶制備得到模擬腸液。然后將40 μL 蛋白質(zhì)樣品和200 μL 模擬腸液混合，在37 ℃水浴下孵育2 h，沸水浴中加熱5 min 終止反應(yīng)。最后，通過(guò)SDS-PAGE 分析研究蛋白質(zhì)對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的穩(wěn)定性。以未進(jìn)行消化的米糠球蛋白作為對(duì)照樣品進(jìn)行分析[14]。

1.3.5 熒光光譜分析

將米糠球蛋白、米糠球蛋白+殼寡糖混合物及糖基化蛋白稀釋到相同的蛋白質(zhì)濃度，使用熒光磷光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為290 nm，在激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm 的情況下，在300～500 nm處測(cè)量熒光強(qiáng)度。

1.3.6 糖基化蛋白與槲皮素、白藜蘆醇的非共價(jià)作用

參照Z(yǔ)heng 等[15]的方法，用熒光磷光分光光度計(jì)檢測(cè)由槲皮素和白藜蘆醇引起的糖基化蛋白的熒光強(qiáng)度變化。向3 mL 的糖基化蛋白溶液（溶于0.05 mol/L，pH7.0 PBS 中，蛋白濃度1 mg/mL）中分別添加槲皮素（5 mg/mL）和白藜蘆醇（5 mg/mL）及同時(shí)添加槲皮素白藜蘆醇（5 mg/mL 槲皮素與白藜蘆醇，質(zhì)量比為1∶1）[蛋白質(zhì)與槲皮素（或與白藜蘆醇，或與槲皮素白藜蘆醇）=1∶0.005、1∶0.01、1∶0.02、1∶0.03、1∶0.04、1∶0.05，質(zhì)量比]反應(yīng)10 min 后測(cè)定熒光強(qiáng)度。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，在300～500 nm范圍內(nèi)掃描。將數(shù)據(jù)根據(jù)以下方程式進(jìn)行擬合，獲得化學(xué)計(jì)量位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)K。

式中：n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；K 為結(jié)合常數(shù)；[P]0為蛋白濃度；[PN]0為多酚濃度；I0和I∞分別為蛋白獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)完全飽和時(shí)無(wú)多酚和有多酚存在時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3.7 傅立葉紅外光譜分析

參照Z(yǔ)hao 等[6]的測(cè)定方法，將樣品（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時(shí)添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）進(jìn)行凍干處理。處理后的樣品采用KBr 法壓片進(jìn)行傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）掃描，測(cè)定波數(shù)為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，分辨率為4 cm-1，以KBr作為空白參照。

1.3.8 熱穩(wěn)定性分析

參照Z(yǔ)hao 等[6]的測(cè)定方法，取5 mg 樣品（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時(shí)添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）放入鋁制品盒中，用空鋁制樣品盒作為空白參比，加蓋壓緊后置于樣品池中，樣品掃描溫度為30～150 ℃，加熱升溫速率為5 ℃/min，控制氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，用差示掃描熱量?jī)x測(cè)定其變性溫度及熱焓值變化。

1.3.9 粒徑分析

參考Zhao 等[6]的測(cè)定方法，采用激光納米粒度分析儀測(cè)定樣品的粒徑分布。將樣品（0.2 mg/mL 米糠球蛋白溶液、0.2 mg/mL 糖基化蛋白溶液中，分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時(shí)添加槲皮素白藜蘆醇，質(zhì)量比均為1∶0.02，溶于0.05 mol/L，pH7.0 PBS 溶液中）過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，于室溫條件下測(cè)量。

1.3.10 體外抗氧化性表征

1.3.10.1 ABTS+·清除能力測(cè)定

將ABTS 溶于蒸餾水配成0.007 mol/L 溶液并和濃度為0.002 45 mol/L 的過(guò)硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，制成ABTS+·溶液，避光放置12～16 h 后用蒸餾水稀釋至A734=0.70±0.02，避光備用。

精確量取500 μL 濃度為2 mg/mL 的樣品溶液（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時(shí)添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）于試管中，加入3.5 mL ABTS+·溶液混勻，室溫避光保存30 min 后測(cè)定734 nm處吸光值A(chǔ)；以500 μL 蒸餾水作為空白溶液與3.5 mL ABTS+·溶液混合室溫避光靜置30 min，734 nm 下測(cè)定吸光值A(chǔ)0。ABTS+·清除能力用清除率（X，%）表示，按照下式計(jì)算[6]。

1.3.10.2 DPPH·清除能力測(cè)定

精確量取2 mL 濃度為2 mg/mL 的樣品溶液（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時(shí)添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）于試管中，加入2 mL 的0.000 1 mol/L DPPH 乙醇溶液混勻，室溫避光保存30 min 后測(cè)定517 nm 處吸光值A(chǔ)；以2 mL 樣品與2 mL 乙醇混合溶液作為樣品對(duì)照組測(cè)得吸光值A(chǔ)x0；以2 mL 蒸餾水與2 mL 的0.000 1 mol/L DPPH 乙醇混合溶液作為空白溶液測(cè)得517 nm 吸光值A(chǔ)0。DPPH·清除能力用清除率（Y，%）表示，按照下式計(jì)算[6]。

1.3.10.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

精確量取1 mL 樣品溶液（2 mg/mL）（米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白中分別添加槲皮素、白藜蘆醇以及同時(shí)添加槲皮素和白藜蘆醇，糖基化蛋白與多酚質(zhì)量比為1∶0.02）于試管中，加入3 mL Tris-HCl（0.05 mol/L，pH8.2）混勻，放入水浴鍋25 ℃恒溫反應(yīng)20 min 后加入3 mL 焦性沒(méi)食子酸溶液（0.007 mol/L，25 ℃），反應(yīng)時(shí)間為5 min，最后加入1 mL 濃鹽酸終止反應(yīng)，于325 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)。以樣品溶液不加焦性沒(méi)食子酸于325 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)x0；用蒸餾水代替樣品溶液于325 nm 測(cè)定吸光值A(chǔ)0。超氧陰離子自由基清除能力用清除率（P，%）表示，按照下式計(jì)算[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

所有檢測(cè)均進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，所得結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素分析法分析組間顯著性差異，數(shù)據(jù)處理軟件為SPSS 19.0 和Origin 8.0，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳表征

2.1.1 米糠球蛋白的電泳表征

米糠球蛋白電泳見(jiàn)圖1。

圖1 米糠球蛋白電泳Fig.1 Electrophoretogram of rice bran globulin

如圖1所示，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比，所提取的米糠球蛋（條帶1）白亞基分別在57、53、35 kDa 左右，與已有研究結(jié)果一致[18]，說(shuō)明米糠蛋白的制備提取成功。提取的蛋白質(zhì)中雜質(zhì)條帶較少，提取的球蛋白純度符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.1.2 糖基化蛋白的SDS-PAGE 表征

米糠球蛋白及糖基化蛋白電泳見(jiàn)圖2。

圖2 米糠球蛋白及糖基化蛋白電泳Fig.2 Electrophoretogram of rice bran globulin and glycosylated protein

如圖2所示，采用殼寡糖將米糠球蛋白通過(guò)美拉德反應(yīng)糖基化后，米糠球蛋白的分離膠頂部形成分子量較高的多分散帶（條帶2），糖基化蛋白的特征條帶變?nèi)?，表明殼寡糖成功與米糠球蛋白共價(jià)結(jié)合，形成二元共軛糖基化蛋白，即生成了更大分子量的化合物，證明糖基化修飾成功。

2.1.3 米糠球蛋白和糖基化蛋白的微觀形態(tài)

采用掃描電鏡觀察米糠球蛋白糖基化前后微觀結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 米糠球蛋白和糖基化蛋白的電鏡Fig.3 Electron micrograph of rice bran globulin and glycosylated protein

如圖3所示，米糠球蛋白呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)緊密。當(dāng)米糠球蛋白與殼寡糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，糖基化蛋白表面變得褶皺，不規(guī)則結(jié)構(gòu)增多，表面變得更加松散。這是由于糖分子的引入在一定程度上改變了原蛋白結(jié)構(gòu)，減少了蛋白質(zhì)的聚集，使蛋白肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，分子擴(kuò)散[19]。

2.1.4 糖基化蛋白的抗消化性表征

蛋白質(zhì)在胃腸道中的降解耐受性反映了蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性，因此對(duì)米糠球蛋白及糖基化蛋白在模擬胃腸道消化環(huán)境下的抗消化性進(jìn)行了電泳表征，結(jié)果如圖4所示。

圖4 米糠球蛋白及糖基化蛋白胃消化、腸消化蛋白電泳Fig.4 Electrophoresis of rice bran globulin and glycosylated protein after gastric and intestinal digestion

如圖4所示，在模擬胃消化中，米糠球蛋白（條帶4）及糖基化蛋白（條帶3）在50～60 kDa 之間的特征條帶幾乎都被水解，但糖基化蛋白30 kDa 的條帶仍部分保留，其原因可能是糖基化過(guò)后，殼寡糖覆蓋了球蛋白與胃蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)，降低了消化率。在腸消化過(guò)程中，米糠球蛋白（條帶6）和糖基化蛋白條帶（條帶5）的變化無(wú)明顯差別，可能是在腸道吸收中胰蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)不受殼寡糖影響，證明糖基化蛋白在胃液里具有一定的抗消化特征，在腸道中可被完全消化。

2.1.5 糖基化蛋白的熒光光譜分析

通過(guò)測(cè)定米糠球蛋白、米糠球蛋白+殼寡糖混合物及米糠球蛋白-殼寡糖糖基化蛋白的熒光光譜來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖5所示。

圖5 米糠球蛋白、米糠球蛋白+殼寡糖混合物及糖基化蛋白熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of rice bran globulin，mixture of rice bran globulin and chitooligosaccharide，and glycosylated protein

由圖5 可知，米糠球蛋白+殼寡糖混合物及糖基化蛋白均未改變米糠球蛋白所在350 nm 處的最大吸收峰，最大熒光強(qiáng)度為1 712，與米糠球蛋白相比，米糠球蛋白+殼寡糖混合物及糖基化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度均明顯降低，熒光強(qiáng)度分別降至1 495 和1 134，說(shuō)明殼寡糖的混入或鍵入均未改變蛋白的一、二級(jí)結(jié)構(gòu)，但引起了三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。此外，糖基化蛋白的熒光強(qiáng)度降幅大于混合物，這可能是美拉德反應(yīng)引起的共價(jià)相互作用導(dǎo)致蛋白的色氨酸微環(huán)境和蛋白構(gòu)象發(fā)生了改變，殼寡糖中基團(tuán)的引入遮蔽了蛋白中的部分色氨酸，進(jìn)而導(dǎo)致熒光淬滅。這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致，即美拉德反應(yīng)引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象[15]。

2.2 糖基化蛋白與多酚的相互作用

2.2.1 熒光淬滅現(xiàn)象

糖基化蛋白與多酚結(jié)合情況見(jiàn)圖6。

圖6 糖基化蛋白分別與白藜蘆醇和槲皮素以及同時(shí)添加白藜蘆醇和槲皮素的結(jié)合情況Fig.6 Binding of glycosylated protein with resveratrol or quercetin and simultaneous addition of resveratrol and quercetin

如圖6A、圖6C 和圖6E所示，糖基化蛋白最大吸收峰出現(xiàn)在350 nm 處，其熒光強(qiáng)度隨多酚（槲皮素、白藜蘆醇）質(zhì)量的增加而降低，表明糖基化蛋白與多酚之間存在相互作用，導(dǎo)致靜態(tài)熒光淬滅現(xiàn)象的產(chǎn)生[20]。圖6B、圖6D 和圖6F 分別對(duì)單獨(dú)添加白藜蘆醇、槲皮素以及同時(shí)添加兩種多酚時(shí)糖基化蛋白熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行了熒光擬合，結(jié)果顯示兩種多酚分別單獨(dú)添加時(shí)，一個(gè)糖基化蛋白分子可結(jié)合0.019 25 個(gè)白藜蘆醇分子，結(jié)合常數(shù)為0.001 5（圖6B），且白藜蘆醇的添加使得蛋白的熒光光譜發(fā)生了明顯的紅移（圖6A），表明糖基化蛋白與多元醇白藜蘆醇的非共價(jià)結(jié)合使得蛋白質(zhì)的色氨酸殘基暴露于更為極性的環(huán)境中。隨著白藜蘆醇濃度增加，糖基化蛋白紅移越明顯，證實(shí)了白藜蘆醇的加入使得糖基化蛋白色氨酸殘基微環(huán)境極性增加[21]。

如圖6D所示，一個(gè)糖基化蛋白分子可以結(jié)合0.020 13 個(gè)槲皮素分子，結(jié)合常數(shù)為0.004 61。槲皮素對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合較強(qiáng)。同時(shí)添加兩種多酚時(shí)，其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為0.014 7，結(jié)合常數(shù)為0.002 23。其結(jié)合能力小于單獨(dú)的白藜蘆醇和槲皮素分子，這可能與兩種多酚之間的空間位阻有關(guān)。同時(shí)與蛋白結(jié)合時(shí)兩種多酚之間的相互影響尚且需進(jìn)一步研究。

2.2.2 糖基化蛋白-多酚非共價(jià)復(fù)合物的傅立葉-紅外光譜分析

不同復(fù)合物的紅外光譜見(jiàn)圖7。

圖7 不同復(fù)合物的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of different compounds

如圖7所示，與米糠球蛋白相比，糖基化蛋白在—OH 的伸縮振動(dòng)區(qū)間3 700～3 200 cm-1內(nèi)出現(xiàn)了更寬的吸收峰，糖分子與蛋白共價(jià)作用時(shí)，殼寡糖引入了更多的羥基接入米糠球蛋白中。此外，糖基化蛋白在糖的特征吸收峰887 cm-1（糖環(huán)中C—H 鍵的彎曲振動(dòng)）處有新的振動(dòng)，說(shuō)明殼寡糖成功鍵合在蛋白上，糖分子與米糠球蛋白發(fā)生了糖基化反應(yīng)[23]。

糖基化蛋白與多酚結(jié)合后酰胺Ⅰ帶峰的位置從1 659 cm-1變成了1 661、1 658 cm-1和1 659 cm-1。可以看出，與多酚結(jié)合之后，蛋白的酰胺Ⅰ帶發(fā)生位移，移動(dòng)了3～1 cm-1，說(shuō)明多酚引起了蛋白的構(gòu)象變化[22]。在3 600～3 200 cm-1的范圍內(nèi)出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰，表明糖基化蛋白與多酚相互作用改變了已有的羥基環(huán)境和氫鍵網(wǎng)絡(luò)，多酚中的羥基可以與氨基酸殘基通過(guò)氫鍵作用。進(jìn)一步說(shuō)明多酚與糖基化蛋白主要是疏水作用及氫鍵等非共價(jià)相互作用[15]。

2.2.3 糖基化蛋白-多酚非共價(jià)復(fù)合物的熱穩(wěn)定性分析

糖基化蛋白-多酚非共價(jià)復(fù)合物的熱穩(wěn)定性分析見(jiàn)圖8 及表1。

表1 不同復(fù)合物的熱性質(zhì)分析Table 1 Thermal property analysis of different compounds

圖8 不同復(fù)合物的DSC 圖譜Fig.8 DSC spectra of different compounds

如圖8 及表1所示，米糠球蛋白經(jīng)過(guò)糖基化修飾后，糖基化蛋白的變性溫度由原球蛋白的62.36 ℃增加至69.60 ℃，焓變值由11.80 J/g 增加至15.58 J/g，表明米糠球蛋白與殼寡糖共價(jià)鍵合提高了米糠球蛋白的熱穩(wěn)定性。這與Liu 等[24]的報(bào)道一致，美拉德反應(yīng)提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。當(dāng)加入多酚后，蛋白質(zhì)與多酚相互作用后進(jìn)一步提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[25-26]。具體表現(xiàn)為分別單獨(dú)或共同與兩種多酚槲皮素和白藜蘆醇結(jié)合后糖基化蛋白的變性溫度和焓變值顯著升高。其中，與白藜蘆醇單獨(dú)結(jié)合后糖基化蛋白熱穩(wěn)定性最好，變性溫度和焓變值分別為137.33 ℃和48.19 J/g。而同時(shí)與兩種多酚非共價(jià)結(jié)合次之?？赡苁前邹继J醇的加入顯著增加了糖基化蛋白的極性，通過(guò)非共價(jià)鍵形成了更緊密、熱穩(wěn)定性更高結(jié)構(gòu)。

2.2.4 糖基化蛋白-多酚非共價(jià)復(fù)合物的粒徑變化

米糠球蛋白、糖基化蛋白及糖基化蛋白-多酚非共價(jià)復(fù)合物的粒徑如圖9所示。

圖9 不同復(fù)合物的粒徑Fig.9 Particle size of different compounds

如圖9所示，平均粒徑由小到大順序?yàn)镽BG（373 nm）＜RBG-C（416 nm）＜RBG-C-R（459 nm）＜RBGC-Q（503 nm）＜RBG-C-Q-R（521 nm），米糠球蛋白的粒徑小于糖基化蛋白以及糖基化蛋白-多酚非共價(jià)復(fù)合物，原因可能是美拉德反應(yīng)主導(dǎo)的糖基化以及蛋白與多酚之間的相互作用力如氫鍵、范德華力等增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子之間的聚集，從而使得粒徑增大[27]。當(dāng)同時(shí)與兩種多酚結(jié)合時(shí)，粒徑最大，可能是兩種多酚與糖基化蛋白結(jié)合位點(diǎn)的不同導(dǎo)致蛋白分子之間的聚集更強(qiáng)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.2.5 糖基化蛋白-多酚非共價(jià)復(fù)合物的體外抗氧化性分析

米糠球蛋白、糖基化蛋白、糖基化蛋白-多酚非共價(jià)復(fù)合物的體外抗氧化能力如圖10所示。

如圖10所示，所有糖基化復(fù)合物自由基清除能力均高于米糠球蛋白，這與之前的研究結(jié)果一致，即糖基化可以提高蛋白的抗氧化活性，這與美拉德反應(yīng)中糖基化蛋白的氫和/或電子貢獻(xiàn)有關(guān)[28]。與多酚結(jié)合后，發(fā)現(xiàn)與白藜蘆醇結(jié)合后抗氧化能力最強(qiáng)，原因可能是白藜蘆醇本身抗氧化性強(qiáng)于槲皮素[29-30]。當(dāng)與兩種多酚結(jié)合時(shí)，其抗氧化能力介于糖基化蛋白單獨(dú)結(jié)合槲皮素和單獨(dú)結(jié)合白藜蘆醇之間。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)美拉德反應(yīng)對(duì)米糠球蛋白進(jìn)行了糖基化修飾，提高了其抗消化性和抗氧化性。糖基化蛋白可同時(shí)與兩種多酚發(fā)生非共價(jià)結(jié)合，其結(jié)合能力介于糖基化蛋白分別單獨(dú)結(jié)合槲皮素和單獨(dú)結(jié)合白藜蘆醇之間。糖基化蛋白同時(shí)與兩種多酚非共價(jià)結(jié)合后其粒徑最大，其熱穩(wěn)定性及抗氧化能力介于糖基化蛋白單獨(dú)結(jié)合槲皮素和單獨(dú)結(jié)合白藜蘆醇之間。本研究為擴(kuò)大糖基化蛋白與兩種及以上多酚的非共價(jià)復(fù)合物的研究及應(yīng)用提供了一定的理論支持。