miR-126-3p.1通過SLC7A5調(diào)控間變性甲狀腺癌細胞糖酵解的作用機制*

丁雯鈺 高楊麗 楊一飛

(河北工程大學附屬醫(yī)院,河北 邯鄲 056000)

甲狀腺癌是世界上最常見的內(nèi)分泌腫瘤,其發(fā)病率逐年上升[1]。其中80%～85%的甲狀腺癌為甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid cancer,PTC),其5年生存率達94%,而間變性甲狀腺癌(Anaplastic thyroid cancer,ATC)占2%左右,其侵襲性較強,1年生存率約為20%[2-3]。隨著醫(yī)學技術(shù)的不斷進步,甲狀腺癌發(fā)病機制的研究也取得較大發(fā)展,但其發(fā)病率仍在增長。因此,探索ATC的發(fā)病機制,提高ATC的存活率具有重要意義。微小核糖核苷酸(MicroRNAs,miRNAs)是一類長度約22個核苷酸的非編碼RNA片段,在PTC的預后和治療中起著至關(guān)重要的作用[4-5]。miR-126在很多癌癥中扮演抑癌基因的角色,抵抗癌癥的惡化[6]。近兩年,有研究[7]報道,miR-126在甲狀腺癌中表達失調(diào),與癌癥的進展存在聯(lián)系,但是其在ATC糖酵解中的作用及機制尚少有人研究。溶質(zhì)運載家族7成員5(Solute carrier family 7 member 5,SLC7A5)是必需氨基酸(如亮氨酸和苯丙氨酸)的膜轉(zhuǎn)運蛋白,其在細胞增殖所需蛋白的合成中起關(guān)鍵作用[8]。SLC7A5在人類的多種實體腫瘤中過度表達,其中包括甲狀腺癌[9]。但是,SLC7A5是否參與miR-126-3p.1在甲狀腺癌進展中的作用尚未可知。本研究旨在探討miR-126-3p.1調(diào)控甲狀腺癌細胞糖酵解的作用機制及其與SLC7A5之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人正常甲狀腺細胞Htori-3、人間變性甲狀腺癌細胞SW1736、人乳頭瘤狀甲狀腺癌細胞TPC-1(中國科學研究院上海細胞庫);TRIzol液、逆轉(zhuǎn)錄酶、BCA蛋白檢測試劑盒(美國Invitrogen);ReadyPrep 蛋白質(zhì)萃取試劑盒(總蛋白)(美國Bio-Rad);SLC7A5一抗、GAPDH一抗、HRP標記的IgG二抗體(Abcam);BeyoECL Plus試劑盒、增強型CCK-8試劑盒、EdU試劑盒(中國上海碧云天生物科技公司);葡萄糖含量檢測試劑盒(微量法)、乳酸含量(LA)檢測試劑盒(可見分光光度法)(北京索萊寶生物科技有限公司);CKX31型奧林巴斯倒置顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 Htori-3、SW1736、TPC-1均使用DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清+100 μg/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)。在37 ℃、5%CO2飽和濕度空氣的恒溫細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。TPC-1細胞分為agomiRNA(轉(zhuǎn)染agomiRNA)組、agomiR-126-3p.1(轉(zhuǎn)染agomiR-126-3p.1)組、si-NC(轉(zhuǎn)染si-NC)組、si-SLC7A5(轉(zhuǎn)染si-SLC7A5)組、agomiR-126-3p.1+pcDNA(共轉(zhuǎn)染agomiR-126-3p.1和pcDNA)組、agomiR-126-3p.1+ pcDNA-SLC7A5(共轉(zhuǎn)染agomiR-126-3p.1和pcDNA-SLC7A5)組,各組細胞用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至SW1736。RT-qPCR確定轉(zhuǎn)染是否成功。

1.2.2 RT-qPCR實驗檢測miR-126-3p.1、SLC7A5的表達 TRIzol液提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。分別使用TaqMan miRNA檢測試劑盒、SYBR?預混料Ex TaqTMII進行miR-126-3p.1、SLC7A5的qPCR分析。條件為(95 ℃,10 min與95 ℃,15 s和60 ℃,1 min,40循環(huán))。U6、GAPDH分別用作miR-126-3p.1、SLC7A5的內(nèi)部參照,2-△△Ct法計算結(jié)果。

1.2.3 CCK8法檢測細胞增殖 使用增強型CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖。將細胞以每孔100 μL(1×104個細胞)接種96孔板,每孔加入10 μLCCK-8溶液,孵育30 min。450 nm波長處檢測細胞的吸光度(OD450)。增殖率(%)=OD450實驗/OD450對照×100%。

1.2.4 EdU法檢測細胞增殖 將待測細胞以每孔500 μL(5×104個細胞)接種24孔板,培養(yǎng)過夜。再用250 μL含有20 μM EdU的新鮮培養(yǎng)液替換一半的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)8 h。4%多聚甲醛固定細胞15 min,并用0.5%Triton X-100滲透細胞20 min。用3%牛血清白蛋白沖洗后,添加500 μL 1×Click反應液,室溫避光孵育30 min。加入5 μg/mL Hoechst 33342對細胞核染色30 min。熒光顯微鏡觀察,拍照。Hoechst 33342核染為藍色,EdU染色為紅色。用紅色細胞數(shù)/藍色細胞數(shù)×100%表示EdU陽性率。

1.2.5 ELISA法檢測細胞葡萄糖、乳酸 通過葡萄糖攝取和乳酸生成評估細胞的糖酵解水平。使用葡萄糖含量檢測試劑盒(微量法)、乳酸含量(LA)檢測試劑盒(可見分光光度法)檢測細胞葡萄糖含量、乳酸含量。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書要求操作、計算。以對照組細胞葡萄糖含量、乳酸含量最為單位,實驗組葡萄糖含量、乳酸含量占對照組葡萄糖含量、乳酸含量的百分比表示相對葡萄糖消耗率、相對乳酸生成率。

1.2.6 WB實驗檢測細胞SLC7A5蛋白 使用ReadyPrep 蛋白質(zhì)萃取試劑盒(總蛋白)從各組細胞中提取總蛋白,BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白,再轉(zhuǎn)移到PVDF膜。PVDF膜封閉處理后,使用SLC7A5(1∶2000)、GAPDH(1∶3000)一抗孵育(4 ℃,12 h)。然后用HRP標記的IgG二抗(1∶1000)孵育(37 ℃,2 h)。ECL顯色,Image J軟件分析每個蛋白條帶的灰度。使用目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值之間的比值表示蛋白的相對表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測細胞熒光活性 生物信息學靶標預測網(wǎng)站Targetscan(https://www.targetscan.org)、starbase(https://starbase.sysu.edu.cn)預測miR-126-3p.1的靶標,發(fā)現(xiàn)SLC7A5為其下游靶基因之一。根據(jù)結(jié)合位點合成野生型SLC7A5(含SLC7A5 3′ UTR-WT結(jié)合序列)、突變型SLC7A5(不含SLC7A5 3′ UTR-MUT結(jié)合序列),克隆至熒光載體psiCHECK2,形成熒光報告基因(SLC7A5 3′ UTR-WT、SLC7A5 3′ UTR-MUT)。Lipofectamine 2000將熒光報告基因與agomiRNA、agomiR-126-3p.1、antagomiRNA、antagomiR-126-3p.1共轉(zhuǎn)染SW1736細胞。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞的熒光活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-126-3p.1在甲狀腺癌中的表達 TCGA數(shù)據(jù)庫顯示,miR-126-3p.1在甲狀腺癌組織中表達水平顯著降低(見圖1A),作為癌癥診斷指標的AUC值為0.68(見圖1B),高表達患者的存活率明顯升高(見圖1C)。Htori-3、SW1736、TPC-1細胞miR-126-3p.1表達分別為0.98±0.07、0.31±0.03、0.46±0.04,與Htori-3相比,SW1736、TPC-1細胞miR-126-3p.1表達顯著降低(F=451.095,P<0.001)。

圖1 miR-126-3p.1與甲狀腺癌之間的關(guān)系分析Figure 1 Analysis of the relationship between miR-126-3p.1 and thyroid cancer注:A.miR-126-3p.1在癌組織中的表達;B.miR-126-3p.1在甲狀腺癌中的ROC分析;C.miR-126-3p.1與甲狀腺癌患者的生存分析。

2.2 過表達miR-126-3p.1對TPC-1細胞糖酵解的調(diào)控 與agomiRNA組相比,agomiR-126-3p.1組細胞miR-126-3p.1表達顯著升高,細胞增殖率、EdU陽性率、相對葡萄糖消耗率、相對乳酸生成率均顯著降低(均P<0.05), 見表1。

表1 過表達miR-126-3p.1的SW1736細胞增殖、糖酵解Table 1 Proliferation and glycolysis of SW1736 cells overexpressing miR-126-3p.1

2.3 miR-126-3p.1靶向SLC7A5 Targetscan(https://www.targetscan.org)發(fā)現(xiàn),SLC7A5 3′UTR與miR-126-3p.1之間存在連續(xù)的6個互補結(jié)合位點。轉(zhuǎn)染agomiR-126-3p.1和SLC7A5 3′UTR-WT的TPC-1細胞熒光活性顯著降低,轉(zhuǎn)染antagomiR-126-3p.1和SLC7A5 3′UTR-WT的TPC-1細胞熒光活性顯著升高(均P<0.05)。在甲狀腺癌組織中miR-126-3p.1與SLC7A5之間呈顯著的負相關(guān)(R=-0.266,P<0.05)。與agomiRNA組相比,agomiR-126-3p.1組TPC-1細胞SLC7A5蛋白表達量顯著降低,與antagomiRNA組相比,antagomiR-126-3p.1組TPC-1細胞SLC7A5蛋白表達量顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-126-3p.1靶向SLC7A5Figure 2 miR-126-3p.1 targets SLC7A5注:A.互補結(jié)合位點;B.雙熒光素酶報告實驗結(jié)果;C.miR-126-3p.1與SLC7A5在甲狀腺癌中的相關(guān)性;D.miR-126-3p.1負向調(diào)控SLC7A5蛋白。與agomiRNA組比較,①P<0.05;與agomiR-126-3p.1組比較,②P<0.05。

2.4 SLC7A5在甲狀腺癌中的表達 SLC7A5在甲狀腺癌組織中的表達顯著高于正常組織(見圖3A),在SW1736、TPC-1細胞中的表達顯著高于Htori-3細胞(見圖3B)。與Htori-3相比,SW1736、TPC-1細胞SLC7A5表達顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 SLC7A5在Htori-3、SW1736、TPC-1細胞中的表達Table 2 SLC7A5 expression in Htori-3, SW1736 and TPC-1 cells

圖3 SLC7A5在甲狀腺癌中的表達Figure 3 SLC7A5 expression in thyroid carcinoma注:A.SLC7A5在甲狀腺癌組織中的表達;B.SLC7A5在甲狀腺癌細胞中的表達。

2.5 敲減SLC7A5對SW1736細胞糖酵解的調(diào)控 與si-NC組相比,si-SLC7A5組SW1736細胞SLC7A5表達、細胞增殖率、EdU陽性率、相對葡萄糖消耗率、相對乳酸生成率均顯著降低(P<0.05),見圖4、表3。

表3 敲減SLC7A5的SW1736細胞的增殖、糖酵解Table 3 Proliferation and glycolysis of SW1736 cells knockdown SLC7A5

圖4 SLC7A5蛋白表達Figure 4 SLC7A5 protein expression

2.6 過表達SLC7A5逆轉(zhuǎn)miR-126-3p.1對SW1736細胞糖酵解的作用 與agomiR-126-3p.1+pcDNA組相比,agomiR-126-3p.1+pcDNA-SLC7A5組SW1736細胞SLC7A5表達顯著升高,miR-126-3p.1表達顯著降低,細胞增殖率、EdU陽性率、相對葡萄糖消耗率、相對乳酸生成率顯著升高(均P<0.05)。見圖5、表4。

表4 過表達SLC7A5和miR-126-3p.1的SW1736細胞增殖、糖酵解Table 4 Proliferation and glycolysis of SW1736 cells overexpressing SLC7A5 and miR-126-3p.1

圖5 SLC7A5蛋白表達Figure 5 SLC7A5 protein expression

3 討論

miR-126表達廣泛,在人類癌癥中具有診斷價值,其在某些癌癥中作為腫瘤抑制因子發(fā)貨作用,包括肺癌、胃癌、胰腺癌及惡性甲狀腺癌[10-11]。Tao等[12]報道,miR-126作為circPVT1的靶點,在甲狀腺癌組織、細胞中低表達,并且下調(diào)miR-126可逆轉(zhuǎn)沉默circPVT1對癌細胞增殖、遷移侵襲的抑制和凋亡的促進作用。Zeng等[13]在甲狀腺癌的研究中報道,miR-126在PTC-1、ATC細胞SW1736中低表達,與NEAT1、VEGFA存在靶向關(guān)系,調(diào)控甲狀腺癌細胞的增殖、遷移侵襲及凋亡,暗示miR-126在甲狀腺癌中的潛在作用。本課題組的此研究發(fā)現(xiàn),miR-126-3p.1在甲狀腺癌組織、細胞中表達下調(diào),這也與上述研究結(jié)果相一致。進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達miR-126-3p.1抑制了癌細胞的增殖、葡萄糖消耗率、乳酸生成,表現(xiàn)出抑制癌細胞糖酵解的抑癌功能。深入研究發(fā)現(xiàn),miR-126-3p.1可靶向SLC7A5,并且他們在癌組織中的表達水平呈明顯的負相關(guān)性,這也許可能與miR-126-3p.1在甲狀腺癌中發(fā)揮調(diào)控作用存在一定聯(lián)系。

據(jù)報道[14-15],在PTC中,SLC7A3、SLC7A5和SLC7A11表達水平的升高預示著患者的生存率較低或預后不良。在ATC的研究[16-17]中報道,SLC7A5在ATC小鼠腫瘤模型、ATC患者組織樣本中的表達均上調(diào),SLC7A5阻斷劑JPH203給藥后,模型小鼠腫瘤生長停滯,這些臨床前的研究結(jié)果表明,SLC7A5抑制劑在甲狀腺癌中的治療前景。體外研究[18-20]顯示,JPH203通過抑制mTOR信號,阻斷細胞從G0/G1期到S期的進展,抑制ATC細胞的增殖,腫瘤生長,再次表明SLC7A5抑制劑是控制ATC的候選藥物。但是,SLC7A5對甲狀腺癌糖酵解過程是否有影響尚未可知。本研究結(jié)果顯示:SLC7A5在甲狀腺癌組織、細胞中表達升高,敲減SLC7A5不但抑制癌細胞的增殖,更抑制了癌細胞的糖酵解,這再次證實了SLC7A5在甲狀腺癌惡化過程中的關(guān)鍵作用,也說明其作為miR-126-3p.1靶標在miR-126-3p.1調(diào)控甲狀腺癌過程中的重要性。過表達SLC7A5逆轉(zhuǎn)了miR-126-3p.1對癌細胞增殖、糖酵解的抑制作用。

4 結(jié)論

miR-126-3p.1抑制甲狀腺癌細胞增殖、糖酵解,這種抗癌作用的潛在機制與靶向SLC7A5有聯(lián)系,可為甲狀腺癌的治療提供新靶點。