• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-449a下調(diào)TGIF2抑制甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62惡性增殖的研究*

    2024-02-26 03:37:34岳秀杰楊崔航單妍趙月樊靜
    西部醫(yī)學(xué) 2024年2期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶陽(yáng)性細(xì)胞甲狀腺癌

    岳秀杰 楊崔航 單妍 趙月 樊靜

    (秦皇島市第四醫(yī)院北區(qū)病理科,河北 秦皇島 066000)

    甲狀腺癌是一種常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤,好發(fā)于中老年女性,其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程。盡管甲狀腺癌患者的治療方法不斷發(fā)展,但5年癌癥特異性生存率仍欠滿意[1-2]。研究[3]表明,轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)的高比例是甲狀腺癌高發(fā)的主要原因。因此,抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等特性在甲狀腺癌治療過程中至關(guān)重要。TGIF2(TGF-β-induced factor homeobox 2)是同源結(jié)構(gòu)域蛋白的三個(gè)氨基酸環(huán)延伸(Three-amino acid loop extension,TALE)超家族的成員,在細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等過程中起著重要的調(diào)控作用[4-5]。miRNA可通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合誘導(dǎo)mRNA切割或抑制基因翻譯,調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[6]。miRNA已被證明參與多種癌癥調(diào)控,包括甲狀腺癌[4, 7]。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)miR-449a具有優(yōu)異的抗腫瘤特性,但其對(duì)甲狀腺癌的作用效果還未被闡明。本研究探討miR-449對(duì)CAL-62細(xì)胞中TGIF2的調(diào)控作用以及對(duì)CAL-62惡性增殖、氧化應(yīng)激和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)的抑制作用,以期為甲狀腺癌的預(yù)防和治療提供新的依據(jù)和策略。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞與試劑 甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62(https://web.expasy.org/cellosaurus/CVCL_1112)來自美國(guó)ATCC。主要試劑:miR-NC,miR-449a mimic,pcDNA,pcDNA-TGIF2,pMIR報(bào)告質(zhì)粒載體及試驗(yàn)所用序列購(gòu)自RiboBio公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自Sigma公司;Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;BCA試劑盒、SOD、MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自合肥萊爾生物科技有限公司;細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自Foregene公司;逆轉(zhuǎn)錄酶、TRIzol試劑盒、熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)普洛麥格公司。試驗(yàn)所用抗體均購(gòu)自上海艾博抗生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將CAL-62細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的培養(yǎng)基中,置于5%二氧化碳、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 d更換一次,每3 d傳代一次,實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

    1.2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞分組:①為探索miR-449a能否在CAL-62細(xì)胞種過表達(dá),將CAL-62細(xì)胞分為mimic-NC組(陰性對(duì)照組)和miR-449a mimic(過表達(dá)miR-449a)組、對(duì)照組,按照分組分別通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染 mimic-NC、miR-449a mimic,對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染,RT-PCR用以檢測(cè)miR-449a的過表達(dá)效率。②探索過表達(dá)TGIF2能否在CAL-62細(xì)胞實(shí)現(xiàn),將細(xì)胞分為pcDNA(陰性對(duì)照)組、pcDNA-TGIF2(過表達(dá)TGIF2)組、對(duì)照組,按照分組分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-TGIF2,對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染,RT-PCR用以檢測(cè)TGIF2的過表達(dá)效率。③分別過表達(dá)miR-449a、TGIF2以及同時(shí)二者過表達(dá)對(duì)于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,將細(xì)胞分為miR-449a mimic組、pcDNA-TGIF2組和mimic+TGIF2組、對(duì)照組,按照分組分別轉(zhuǎn)染 miR-449a mimic、pcDNA-TGIF2以及共轉(zhuǎn)染pcDNA-TGIF2和miR-449a mimic,后續(xù)進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染:以5×105/mL的密度將CAL-62細(xì)胞接種于12孔板中,約80%匯合度時(shí),按照上述分組使用Lipofectamine 2000分別將上述載體轉(zhuǎn)染至CAL-62細(xì)胞。

    1.2.3 RT-PCR檢測(cè)方法 用TRIzol試劑提取CAL-62細(xì)胞的總RNA,使用SMA 400 UV檢測(cè)分離RNA的濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒從RNA樣品中合成cDNA。TGIF2和miR-449a的實(shí)時(shí)PCR分別使用標(biāo)準(zhǔn)的SYBR Green PCR試劑盒和TaqMan miRNA檢測(cè)在實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。將以GAPDH或U6為內(nèi)參,并通過2-ΔΔCt方法計(jì)算。定量PCR的反應(yīng)條件為:95 ℃10 min,95 ℃20 s,60 ℃30 s,72 ℃20 s循環(huán)45次。

    1.2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 四組細(xì)胞分別以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板,在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后,加入CCK-8,在相同條件下孵育4 h。每組由5口平行組成。然后,添加10 μL/孔的CCK-8染料(5 mg/ml),然后在37 ℃下在5%的CO2氣氛中再培養(yǎng)4 h。然后用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)量吸光度。

    1.2.5 BrdU檢測(cè)細(xì)胞活力 用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)試劑盒測(cè)定細(xì)胞的增殖。簡(jiǎn)單地說,將四組CAL-62細(xì)胞接種到96孔板(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)中,在37 ℃孵育過夜。然后用1 mg/mL BrdU溶液標(biāo)記細(xì)胞3 h。此外,使用fixtenta溶液使細(xì)胞變性30 min,然后用過氧化物酶結(jié)合的抗BrdU抗體培養(yǎng)90 min[10]。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。在熒光顯微鏡下觀察BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。

    1.2.6 雙重?zé)晒馑孛笇?shí)驗(yàn) 收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的CAL-62細(xì)胞,接種于24孔板中,并在37 ℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后,將1 g PGL3-TGIF2-WT(SP1野生型)或PGL3-TGIF2-MUT(SP1突變型)以及miR-NC或miR-449a mimic和PRL-CMV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入CAL-62細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,CAL-62細(xì)胞裂解15 min,雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶的相對(duì)活性,熒光素酶的相對(duì)活性(R/F)=螢火蟲熒光素酶活性/腎熒光素酶活性。

    1.2.7 試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激 通過試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中SOD、MDA含量,實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

    1.2.8 DCF染色 參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]方法測(cè)量ROS含量。CAL-62細(xì)胞在含5 mM H2DCFDA的Hank平衡鹽溶液中培養(yǎng)1 h。氧化后,非熒光H2DCFDA轉(zhuǎn)化為高熒光2′,7′-二氯熒光素(DCF)。用Olympus共焦顯微鏡在488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和515-540 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量了DCF的熒光。用數(shù)字干涉對(duì)比法(DIC)獲得細(xì)胞圖像。用Image J軟件分析每個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和每個(gè)視野中ROS陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。

    1.2.9 蛋白免疫印跡(Western blot) 將各組CAL-62細(xì)胞加裂解液后提取總蛋白,用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,加入一抗(TGIF2,E-cadherin, N-cadherin,Fibronectin),4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,加入二抗HRP-IgG,室溫孵育1 h,TBST洗膜。通過Image LabTM軟件行灰度值分析。

    2 結(jié)果

    2.1 CAL-62細(xì)胞轉(zhuǎn)染 與Control組相比,mimic-NC組CAL-62細(xì)胞中miR-449a和TGIF2相對(duì)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-449a mimic組miR-449a相對(duì)水平顯著提升,TGIF2相對(duì)水平顯著降低(均P<0.05)。與Control組比較,pcDNA組CAL-62細(xì)胞中TGIF2蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),pcDNA-TGIF2組TGIF2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與pcDNA-TGIF2組比較,mimic+TGIF2組CAL-62細(xì)胞中TGIF2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1。

    圖1 CAL-62細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果Figure 1 Transfection results of CAL-62 cells注:A.miR-449a mimic成功轉(zhuǎn)染CAL-62細(xì)胞;B.miR-449a mimic轉(zhuǎn)染CAL-62細(xì)胞中TGIF2的表達(dá);C.pcDNA-TGIF2成功轉(zhuǎn)染CAL-62細(xì)胞;D、E.miR-449a mimic與pcDNA-TGIF2共轉(zhuǎn)染CAL-62細(xì)胞中TGIF2的表達(dá)。與Control相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

    2.2 miR-449a與TGIF2靶向關(guān)系 運(yùn)用TargetScan軟件對(duì)二者的關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。提示miR-449a可與TGIF2基因的3′-UTR區(qū)直接結(jié)合(見圖2A)。為了進(jìn)一步確定CAL-62細(xì)胞中miR-449a與TGIF2的表達(dá)關(guān)系,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法進(jìn)一步確認(rèn)。結(jié)果顯示miR-449a可以顯著抑制TGIF2 3′-UTR-wt載體的熒光強(qiáng)度(P<0.05),但對(duì)TGIF2 3′-UTR-mut載體的熒光強(qiáng)度幾乎無影響(見圖2B)。結(jié)果表明,miR-449a和TGIF2具有良好的靶向關(guān)系。

    圖2 miR-449a與TGIF2靶向關(guān)系Figure 2 The targeting relationship between miR-449a and TGIF2注:A.TargetScan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果;B.雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)結(jié)果。與Luc-TGIF2 3’UTR wt相比,①P<0.05。

    2.3 miR-449a過表達(dá)對(duì)CAL-62細(xì)胞活力的影響 與Control相比,pcDNA-TGIF2組CAL-62細(xì)胞活力顯著增強(qiáng),miR-449a mimic組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)。而與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組的細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)。表明miR-449a過表達(dá)可抑制TGIF2過表達(dá)引起的CAL-62細(xì)胞活力提升。見圖3。

    圖3 miR-449a過表達(dá)對(duì)CAL-62細(xì)胞活力的影響Figure 3 The effect of miR-449a overexpression on CAL-62 cell viability注:與Control相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

    2.4 miR-449a過表達(dá)可抑制CAL-62細(xì)胞增殖 與Control組相比,pcDNA-TGIF2組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著提升,miR-449a mimic組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著下降(均P<0.05)。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著下降(P<0.05)。這些結(jié)果表明miR-449a過表達(dá)可抑制TGIF2過表達(dá)引起的CAL-62細(xì)胞增殖。見圖4。

    圖4 BrdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖Figure 4 BrdU staining was used to detect cell proliferation注:A.BrdU染色典型圖像(×100);B.BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率。與Control組相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

    2.5 miR-449a過表達(dá)對(duì)CAL-62細(xì)9胞氧化應(yīng)激的影響 與Control組相比,pcDNA-TGIF2組CAL-62細(xì)胞中SOD的含量顯著增加,MDA的含量顯著降低(P<0.05),miR-449a mimic轉(zhuǎn)染起到了相反的作用。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組細(xì)胞中SOD的含量顯著降低,MDA積累顯著增加(P<0.05)。運(yùn)用DCF染色檢測(cè)了ROS的產(chǎn)生。pcDNA-TGIF2組ROS的產(chǎn)生量顯著減少,miR-449a mimic組ROS含量顯著提升(P<0.05)。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組細(xì)胞中ROS的含量顯著增加(P<0.05)。這些結(jié)果表明miR-449a過表達(dá)可加劇CAL-62細(xì)胞氧化應(yīng)激。見圖5。

    圖5 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)水平Figure 5 Levels of oxidative stress indexes in each group 注:A.各組細(xì)胞中SOD水平;B.各組細(xì)胞中MDA水平;C.DCF染色典型圖像;D.各組細(xì)胞中ROS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。與Control組相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

    2.6 miR-449a過表達(dá)對(duì)CAL-62細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響 觀察各組細(xì)胞形態(tài)可以看出,pcDNA-TGIF2組CAL-62細(xì)胞EMT程度明顯增強(qiáng),miR-449a mimic組CAL-62細(xì)胞EMT情況有所緩解。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組細(xì)胞中EMT情況顯著緩解(P<0.05)。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果,用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和Fibronectin在各組細(xì)胞中的表達(dá)。與Control組相比,pcDNA-TGIF2組CAL-62細(xì)胞中N-cadherin和Fibronectin的表達(dá)水平顯著提升,E-cadherin表達(dá)水平顯著降低,miR-449a mimic組CAL-62細(xì)胞中N-cadherin和Fibronectin的表達(dá)水平顯著降低,E-cadherin表達(dá)水平顯著提升(均P<0.05)。與pcDNA-TGIF2組相比,mimic+TGIF2組CAL-62細(xì)胞中N-cadherin和Fibronectin的表達(dá)水平顯著降低,E-cadherin表達(dá)水平顯著提升(均P<0.05)。這些結(jié)果表明miR-449a過表達(dá)可抑制CAL-62細(xì)胞EMT情況。見圖6。

    圖6 各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換情況Figure 6 EMT in each group 注:A.EMT典型圖像;B.Western Blot檢測(cè)相對(duì)蛋白水平。與Control相比,①P<0.05;與pcDNA-TGIF2組相比,②P<0.05。

    3 討論

    隨著醫(yī)學(xué)研究和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,甲狀腺癌治療方法不斷創(chuàng)新,有所突破,超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查是良惡性疾病診斷的主要手段,但5年癌癥特異性生存率仍不令人滿意[13-14]。因此,繼續(xù)尋找新型甲狀腺治療方法和藥物勢(shì)在必行。

    近年來,生物醫(yī)學(xué)研究成為熱點(diǎn),在甲狀腺癌治療研究領(lǐng)域也得到了應(yīng)用。其中最常見的是以miRNAs為靶點(diǎn)或調(diào)控因子的研究[15]。Lei 等[16]發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1通過靶向miR-145可抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、遷移和EMT的形成。Nixon 報(bào)道[17]稱一系列miRNAs可以作為甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin,Tg)的替代性標(biāo)志物用于診斷和術(shù)后監(jiān)測(cè)。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的活性物質(zhì)超出機(jī)體的清除能力時(shí),則導(dǎo)致氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡失調(diào),會(huì)對(duì)正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成不可逆的損傷,進(jìn)一步導(dǎo)致體細(xì)胞突變和轉(zhuǎn)化,激活致癌通路促進(jìn)細(xì)胞癌變[18]。EMT關(guān)鍵蛋白E-cadherin介導(dǎo)了細(xì)胞間黏附,在多種惡性腫瘤中被檢測(cè)到表達(dá)降低[19]。N-cadherin和Fibronectin在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演了關(guān)鍵角色,其表達(dá)高低可判定EMT的進(jìn)展[20]。本研究將miR-449a運(yùn)用于甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62惡性增殖,氧化應(yīng)激和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換抑制的研究,結(jié)果令人鼓舞。結(jié)果顯示miR-449a轉(zhuǎn)染可降低CAL-62細(xì)胞中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率,降低SOD含量,增加MDA和ROS含量,并且抑制N-cadherin和Fibronectin表達(dá)水平,提升了E-cadherin表達(dá)水平。上述結(jié)果預(yù)示miR-449a可抑制甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62的增殖和EMT,促進(jìn)其氧化應(yīng)激損傷。為了進(jìn)一步探討這些成果背后的潛在機(jī)制,本研究分析了實(shí)驗(yàn)過程中TGIF2的調(diào)控水平。

    TGIF2是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其異常表達(dá)已在多種癌癥中得到顯現(xiàn)[21-22]。Du等[5]研究發(fā)現(xiàn)TGIF2可通過介導(dǎo)EGFR/RAS/ERK信號(hào)通路加速肺腺癌的發(fā)展進(jìn)程。Lu 等[23]報(bào)道稱miR-541-3p可通過直接靶向TGIF2逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌的惡化。在本研究中,TGIF2在CAL-62細(xì)胞中的異常之高,pcDNA-TGIF2轉(zhuǎn)染可誘發(fā)細(xì)胞惡性增殖,降低其氧化應(yīng)激水平,促進(jìn)細(xì)胞EMT發(fā)生。先前的研究人員所得結(jié)論與我們的相似。楊亞麗等[24]發(fā)現(xiàn)TGIF2可以通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞遷移而參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生。尹希燕等[25]報(bào)道稱沙利度胺通過調(diào)控miR-29c-3p/TGIF2途徑抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)miR-449a和TGIF2具有良好的靶向關(guān)系。miR-449a mimic和pcDNA-TGIF2共轉(zhuǎn)染顯著降低了TGIF2水平并抑制細(xì)胞惡性增殖和EMT水平,加劇氧化應(yīng)激。這些結(jié)論表明TGIF2是調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的靶點(diǎn),而miR-449a過表達(dá)對(duì)其具有很好的調(diào)控作用。

    鑒于近年來甲狀腺癌的全球發(fā)病率有增無減,深入了解和揭示甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制,并尋求有效的預(yù)防、診斷和治療方法與策略是必不可少的,也是刻不容緩的。在本研究中miR-449a過表達(dá)可以通過下調(diào)TGIF2水平抑制CAL-62細(xì)胞增殖和EMT,促進(jìn)其氧化應(yīng)激損傷。這預(yù)示miR-449a靶向TGIF2水平的調(diào)控可能是有前途的甲狀腺癌的治療策略。由于本研究在有限的樣本和局限的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下進(jìn)行,切實(shí)的實(shí)驗(yàn)效果還需在更進(jìn)一步的驗(yàn)證。

    4 結(jié)論

    本研究結(jié)果提示,miR-449a過表達(dá)可通過靶向TGIF2抑制甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62惡性增殖,加劇其氧化應(yīng)激和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。

    猜你喜歡
    熒光素酶陽(yáng)性細(xì)胞甲狀腺癌
    NNMT基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗(yàn)證
    不同雙熒光素酶方法對(duì)檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    分化型甲狀腺癌切除術(shù)后多發(fā)骨轉(zhuǎn)移一例
    分化型甲狀腺癌肺轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展
    重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    大口黑鱸鰓黏液細(xì)胞的組織化學(xué)特征及5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的分布
    全甲狀腺切除術(shù)治療甲狀腺癌適應(yīng)證選擇及并發(fā)癥防治
    人多巴胺D2基因啟動(dòng)子區(qū)—350A/G多態(tài)位點(diǎn)熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測(cè)
    人胎腦額葉和海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育性變化
    精細(xì)解剖保護(hù)甲狀旁腺技術(shù)在甲狀腺癌Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)中的應(yīng)用
    av在线老鸭窝| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产成年人精品一区二区| 日韩免费av在线播放| 91狼人影院| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产人妻一区二区三区在| 一级毛片久久久久久久久女| 国产成人福利小说| 757午夜福利合集在线观看| 国产精品久久久久久久久免 | 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲五月天丁香| 一二三四社区在线视频社区8| 少妇丰满av| 999久久久精品免费观看国产| 免费看光身美女| 99久久精品一区二区三区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产视频内射| 国产成人av教育| 成人av在线播放网站| 午夜免费激情av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲成a人片在线一区二区| 性色avwww在线观看| 欧美日韩乱码在线| av在线天堂中文字幕| 中文字幕熟女人妻在线| 国产精品三级大全| av欧美777| av国产免费在线观看| 波多野结衣高清无吗| 精品国产亚洲在线| 日本黄色视频三级网站网址| 在线a可以看的网站| 91九色精品人成在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 成人一区二区视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲第一电影网av| 国内精品久久久久久久电影| 一个人观看的视频www高清免费观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产三级在线视频| 免费在线观看影片大全网站| 精品不卡国产一区二区三区| 中文资源天堂在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩欧美三级三区| av国产免费在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 国产老妇女一区| 国产激情偷乱视频一区二区| 老女人水多毛片| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品,欧美在线| 日本与韩国留学比较| 国产午夜福利久久久久久| 99国产精品一区二区三区| 欧美最黄视频在线播放免费| 中文字幕免费在线视频6| 国产视频内射| 在现免费观看毛片| 一区二区三区四区激情视频 | 国产av在哪里看| 久久精品91蜜桃| 国产精品国产高清国产av| 中文资源天堂在线| 18+在线观看网站| 日日夜夜操网爽| 国产精品一区二区免费欧美| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲第一电影网av| 成年女人毛片免费观看观看9| 99热6这里只有精品| 久久午夜亚洲精品久久| 桃红色精品国产亚洲av| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美一区二区亚洲| 亚洲国产欧美人成| 国产成年人精品一区二区| 欧美精品国产亚洲| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产成人福利小说| 麻豆国产97在线/欧美| 男女床上黄色一级片免费看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日本与韩国留学比较| 欧美又色又爽又黄视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲成人久久性| 国内精品美女久久久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲,欧美,日韩| 99精品在免费线老司机午夜| 丁香六月欧美| 99精品在免费线老司机午夜| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 老司机福利观看| 国产日本99.免费观看| 国产中年淑女户外野战色| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 性色avwww在线观看| 日韩欧美精品免费久久 | 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲不卡免费看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 精品无人区乱码1区二区| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲av免费高清在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲成人久久性| 精品一区二区三区人妻视频| 色哟哟哟哟哟哟| 永久网站在线| 国产精品国产高清国产av| 窝窝影院91人妻| 99热精品在线国产| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久久久久久久久成人| 成人国产综合亚洲| 一级黄色大片毛片| 国产高潮美女av| 日韩欧美 国产精品| 欧美区成人在线视频| 亚洲,欧美,日韩| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 最新中文字幕久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| or卡值多少钱| 天美传媒精品一区二区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 99riav亚洲国产免费| 男女视频在线观看网站免费| 俺也久久电影网| 日韩亚洲欧美综合| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| xxxwww97欧美| 亚洲欧美精品综合久久99| 观看免费一级毛片| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 成年版毛片免费区| 12—13女人毛片做爰片一| 国产男靠女视频免费网站| 一级a爱片免费观看的视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲精品色激情综合| 亚洲无线在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品一区二区三区视频在线| 最新在线观看一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| av专区在线播放| 网址你懂的国产日韩在线| av在线蜜桃| 国产精品影院久久| 午夜a级毛片| 亚洲av电影在线进入| 99久久无色码亚洲精品果冻| 99riav亚洲国产免费| 精品一区二区三区视频在线| 最新在线观看一区二区三区| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲专区国产一区二区| 1000部很黄的大片| 成人国产一区最新在线观看| av国产免费在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 99精品久久久久人妻精品| 极品教师在线视频| 99热这里只有是精品50| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 中文字幕av成人在线电影| 国产成+人综合+亚洲专区| 成人美女网站在线观看视频| 91九色精品人成在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 在线观看舔阴道视频| 18+在线观看网站| 成年版毛片免费区| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩成人在线观看一区二区三区| 一区福利在线观看| 国产精品,欧美在线| 嫩草影院精品99| 国产黄色小视频在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 在线免费观看不下载黄p国产 | 性欧美人与动物交配| 欧美高清性xxxxhd video| 99热精品在线国产| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产极品精品免费视频能看的| 村上凉子中文字幕在线| 婷婷六月久久综合丁香| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美成人一区二区免费高清观看| 中文字幕免费在线视频6| 中文字幕av在线有码专区| 日本成人三级电影网站| 久久久久亚洲av毛片大全| www.999成人在线观看| 51国产日韩欧美| 可以在线观看毛片的网站| 全区人妻精品视频| 国产精品久久久久久精品电影| 国产成年人精品一区二区| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲美女黄片视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 天天躁日日操中文字幕| xxxwww97欧美| 国产综合懂色| 99国产精品一区二区三区| 免费在线观看影片大全网站| www日本黄色视频网| 精品久久国产蜜桃| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久99久视频精品免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜视频国产福利| 一级黄色大片毛片| 国产三级在线视频| www.999成人在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 精品人妻熟女av久视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩欧美国产在线观看| 赤兔流量卡办理| 永久网站在线| 搡老岳熟女国产| 国产亚洲欧美在线一区二区| 午夜精品在线福利| 一本精品99久久精品77| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲精品在线观看二区| 午夜福利免费观看在线| 午夜激情福利司机影院| av专区在线播放| 91久久精品电影网| 久久精品影院6| 久久午夜亚洲精品久久| av在线老鸭窝| 久久国产精品影院| 午夜福利欧美成人| 我要搜黄色片| 亚洲成av人片免费观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 成人永久免费在线观看视频| 精品人妻1区二区| 亚洲熟妇熟女久久| 性色avwww在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 白带黄色成豆腐渣| 日韩欧美国产一区二区入口| 天堂√8在线中文| 最后的刺客免费高清国语| 精品久久久久久成人av| 欧美乱色亚洲激情| 午夜福利高清视频| 一进一出好大好爽视频| 丝袜美腿在线中文| 久久久久性生活片| 成人欧美大片| 悠悠久久av| 长腿黑丝高跟| 嫩草影院入口| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 色综合婷婷激情| 在线观看av片永久免费下载| 脱女人内裤的视频| 91狼人影院| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一本久久中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 日本五十路高清| 午夜福利免费观看在线| 久久久国产成人免费| 黄色丝袜av网址大全| 国产毛片a区久久久久| 黄色女人牲交| 国产黄色小视频在线观看| 免费黄网站久久成人精品 | 成人三级黄色视频| 麻豆国产97在线/欧美| 一级黄片播放器| 91在线观看av| 嫩草影视91久久| 午夜福利免费观看在线| 国产麻豆成人av免费视频| 成人欧美大片| 91字幕亚洲| 久久人人爽人人爽人人片va | 日本三级黄在线观看| 国产精品国产高清国产av| 亚洲精品成人久久久久久| 18禁在线播放成人免费| 美女 人体艺术 gogo| 午夜视频国产福利| 在线观看av片永久免费下载| 有码 亚洲区| 亚洲国产色片| 怎么达到女性高潮| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲激情在线av| 男女视频在线观看网站免费| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产熟女xx| 国产男靠女视频免费网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 免费在线观看亚洲国产| 激情在线观看视频在线高清| 久久精品国产清高在天天线| 精品一区二区三区视频在线| 波多野结衣巨乳人妻| 精品人妻视频免费看| 免费人成视频x8x8入口观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 在线a可以看的网站| 国产精品久久久久久精品电影| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 91九色精品人成在线观看| 深夜a级毛片| 国产精品女同一区二区软件 | 久久久国产成人精品二区| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品一及| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品福利观看| avwww免费| 久久久久国内视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 此物有八面人人有两片| 欧美一区二区亚洲| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 一本综合久久免费| av欧美777| 好男人在线观看高清免费视频| 丁香六月欧美| 午夜影院日韩av| 一级毛片久久久久久久久女| 麻豆av噜噜一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| av中文乱码字幕在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜精品在线福利| 日韩欧美在线乱码| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲av一区综合| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲成av人片在线播放无| 精品人妻视频免费看| av视频在线观看入口| 色综合欧美亚洲国产小说| 激情在线观看视频在线高清| 免费电影在线观看免费观看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲自拍偷在线| 18美女黄网站色大片免费观看| av在线老鸭窝| 中文字幕av成人在线电影| 一级毛片久久久久久久久女| 中文字幕免费在线视频6| 全区人妻精品视频| 精品久久国产蜜桃| 国产亚洲欧美98| 亚洲欧美日韩东京热| 国产伦精品一区二区三区视频9| 性色avwww在线观看| 免费人成在线观看视频色| 亚洲精品在线观看二区| 一区二区三区四区激情视频 | 首页视频小说图片口味搜索| 麻豆成人av在线观看| 十八禁网站免费在线| 一级黄片播放器| 亚洲国产精品合色在线| 99久久精品热视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 午夜福利18| 欧美成人a在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 日韩人妻高清精品专区| 搡老妇女老女人老熟妇| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 免费在线观看影片大全网站| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产真实乱freesex| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美日韩乱码在线| www.熟女人妻精品国产| 我的老师免费观看完整版| 最近视频中文字幕2019在线8| 婷婷丁香在线五月| 欧美区成人在线视频| 国产一区二区在线av高清观看| 很黄的视频免费| 天天一区二区日本电影三级| 成年女人毛片免费观看观看9| 搡老熟女国产l中国老女人| 在线观看一区二区三区| 亚洲最大成人手机在线| 色5月婷婷丁香| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久9热在线精品视频| 欧美乱色亚洲激情| 国产欧美日韩一区二区三| av女优亚洲男人天堂| 91狼人影院| 国产精品一及| 免费在线观看成人毛片| 国产乱人伦免费视频| 国产成人福利小说| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久热精品热| 亚洲最大成人手机在线| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 1000部很黄的大片| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲在线观看片| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费观看的影片在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 99久久精品热视频| 一级黄片播放器| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲熟妇熟女久久| 精品日产1卡2卡| 亚洲成人久久性| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 成人三级黄色视频| 成年人黄色毛片网站| 日韩国内少妇激情av| 亚洲18禁久久av| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲电影在线观看av| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久性视频一级片| 黄色一级大片看看| 精品久久久久久久久av| 99热这里只有精品一区| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 午夜久久久久精精品| 村上凉子中文字幕在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 99久久99久久久精品蜜桃| 香蕉av资源在线| 成年免费大片在线观看| 国内精品美女久久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 赤兔流量卡办理| 长腿黑丝高跟| 老女人水多毛片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 一进一出抽搐动态| 不卡一级毛片| 一区二区三区免费毛片| 国产伦在线观看视频一区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产人妻一区二区三区在| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产色婷婷99| 婷婷六月久久综合丁香| 美女高潮的动态| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久国内视频| 亚洲最大成人中文| 综合色av麻豆| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产成人欧美在线观看| 亚洲成人久久性| 天天躁日日操中文字幕| 国产熟女xx| 国产三级黄色录像| 亚洲天堂国产精品一区在线| 在线观看一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 大型黄色视频在线免费观看| 国模一区二区三区四区视频| 天天一区二区日本电影三级| a级毛片a级免费在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美3d第一页| 97碰自拍视频| 麻豆成人午夜福利视频| 九九在线视频观看精品| 国产高清有码在线观看视频| 国产熟女xx| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 最新中文字幕久久久久| 美女高潮的动态| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成年人黄色毛片网站| 一级黄色大片毛片| 亚洲av熟女| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费高清视频大片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲 国产 在线| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 男人的好看免费观看在线视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 看免费av毛片| 亚州av有码| 真实男女啪啪啪动态图| 国产免费av片在线观看野外av| 日本 欧美在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美一区二区亚洲| 看黄色毛片网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人一区二区视频在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜久久久久精精品| 亚洲av.av天堂| 亚洲天堂国产精品一区在线| 十八禁网站免费在线| 99热这里只有是精品50| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产久久久一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 精品免费久久久久久久清纯| 国产成+人综合+亚洲专区| 99国产综合亚洲精品| 免费av观看视频| 九九热线精品视视频播放| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产av不卡久久| 天堂网av新在线| 久久精品影院6| 国产av麻豆久久久久久久| 国产精品三级大全| 看片在线看免费视频| 久久久久久国产a免费观看| 成人欧美大片| 国产三级黄色录像| 免费一级毛片在线播放高清视频| 有码 亚洲区| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美潮喷喷水| 变态另类丝袜制服| 成人欧美大片| 色综合站精品国产| 成人美女网站在线观看视频| 一二三四社区在线视频社区8| 成人一区二区视频在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成人精品一区二区免费| 亚洲av电影在线进入| 国产午夜精品论理片| 一夜夜www| 激情在线观看视频在线高清| 最近最新免费中文字幕在线| 国产老妇女一区|