MR mDxion-Quant技術(shù)評(píng)價(jià)早期糖尿病腎病大鼠腎臟脂質(zhì)沉積的實(shí)驗(yàn)研究*

程金梅 潘健 羅煒蕭 周海鷹

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.放射科;2.全科醫(yī)學(xué)科,四川 南充 637000)

近年來(lái),隨著人們物質(zhì)條件的好轉(zhuǎn)及飲食習(xí)慣的改變,2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)發(fā)病率逐年上升[1]。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)作為T2DM患者常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一,已成為導(dǎo)致終末期腎病的主要原因[2]。但DN的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,目前尚未明了。不少學(xué)者[3-4]認(rèn)為脂代謝紊亂在DN的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用,增多的TG 和TC 沉積于腎臟并影響腎功能,導(dǎo)致腎小球硬化。因此,準(zhǔn)確評(píng)估腎臟脂肪含量并判斷其嚴(yán)重程度對(duì)指導(dǎo)DN治療、延緩DN發(fā)展及提高T2DM患者的預(yù)后具有重要意義。病理活檢是評(píng)估臟器脂肪含量的金標(biāo)準(zhǔn),但因其有創(chuàng)、受操作者取材影響且不能反映臟器全貌,不能作為臨床診斷和隨訪的最佳選擇。磁共振脂肪定量技術(shù)因其無(wú)輻射、多參數(shù)及可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)已越來(lái)越多地應(yīng)用于科研及臨床工作中,但目前應(yīng)用該技術(shù)評(píng)估DN腎臟脂肪含量的文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此,本研究擬運(yùn)用MR mDxion-Quant技術(shù)無(wú)創(chuàng)性評(píng)估早期DN大鼠腎臟脂質(zhì)沉積,并與病理金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照,分析其與血脂水平、T2DM病程的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NSMC倫理動(dòng)物審[2021]99號(hào))。采用6周齡健康清潔級(jí)(SPF級(jí))雄性SD大鼠70只(川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重160 g左右。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。檸檬酸鈉緩沖液購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司。血脂試劑盒購(gòu)自高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)高瑞生物試劑銷售中心。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及T2DM模型構(gòu)建 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,選取血糖、尿微量白蛋白陰性者列入實(shí)驗(yàn)對(duì)象(n=70),并隨機(jī)分為對(duì)照組(n=20)和實(shí)驗(yàn)組(n=50)。實(shí)驗(yàn)組采用高脂飲食配合小劑量STZ建立T2DM模型。即給予高脂飼料喂養(yǎng)6周,禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg,72 h后采尾部血測(cè)血糖,以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)。排除T2DM模型構(gòu)建不成功的大鼠18只,將T2DM模型構(gòu)建成功者32只繼續(xù)喂養(yǎng)4～16周,依其自然病程發(fā)展成DN模型。對(duì)照組采用普通喂養(yǎng),一次性腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液35 mg/kg。T2DM模型構(gòu)建成功后,將實(shí)驗(yàn)組(n=32)、對(duì)照組(n=20)大鼠隨機(jī)分為4個(gè)亞組,每組13只(實(shí)驗(yàn)組8只,對(duì)照組5只),分別于T2DM模型建立成功后第4、8、12、16周末,隨機(jī)選擇1個(gè)亞組進(jìn)行腎臟MRI掃描、實(shí)驗(yàn)室檢查及病理學(xué)檢查。在T2DM模型構(gòu)建成功后繼續(xù)喂養(yǎng)的過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)組大鼠共死亡15只,余下17只納入研究;對(duì)照組共死亡5只,余下15只納入研究。最后,根據(jù)病理結(jié)果將實(shí)驗(yàn)組中病理分級(jí)為Ⅰ、Ⅱ級(jí)的大鼠納入早期DN組(n=15),將對(duì)照組中腎臟未見(jiàn)異常的大鼠納入正常對(duì)照組(n=13)。

1.2.2 MRI檢查方法及數(shù)據(jù)處理 分別于T2DM模型建立成功后第4、8、12、16周末,隨機(jī)選擇1個(gè)亞組進(jìn)行腎臟MRI掃描。采用聯(lián)影3.0T磁共振掃描儀(uMR790),大鼠線圈。在MRI檢查前,所有大鼠禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉(2%,2.3 ml/kg)進(jìn)行麻醉。取俯臥位頭先進(jìn)方式,腹部近腎臟部位緊貼線圈中心,行腎臟冠狀位掃描。T2加權(quán)成像(T2WI)采用快速自旋回波序列,成像參數(shù)為:TR=4815.5 ms,TE=96 ms,翻轉(zhuǎn)角90°,層厚2.0 mm,FOV 120×120 mm,矩陣325×384。 mDxion-Quant序列成像參數(shù)為:TR=21.1 ms,TE=1.45、3.06、4.67、6.28、7.89、9.5 ms,激勵(lì)次數(shù) 4,翻轉(zhuǎn)角4°,層厚1.3 mm,FOV 90×146 mm,矩陣102×208。將所得圖像傳入聯(lián)影后處理工作站,自動(dòng)生成腎臟脂肪分?jǐn)?shù) (Fat fraction, FF) 圖。由2名觀察者(觀察者分別具有2年、12年腹部MRI診斷經(jīng)驗(yàn))參考T2WI圖像,選取腎門平面FF圖,分別在雙腎實(shí)質(zhì)上份、中份及下份勾畫感興趣區(qū)(Region of interest,ROI)[5]。勾畫 ROI 時(shí),避開(kāi)腎竇脂肪組織及偽影,系統(tǒng)自動(dòng)生成所畫區(qū)域的FF值(見(jiàn)圖1)。每個(gè)部位測(cè)量3次,取平均值作為腎臟FF值。1個(gè)月后,觀察者1以同樣的方法再一次測(cè)量腎臟FF值。

圖1 早期DN組大鼠腎臟MRI圖像Figure 1 Coronal T2-weighted image and fat fraction image of the kidneys in early-stage diabetic nephropathy group注:A.冠狀位T2WI(腎門平面);B.冠狀位脂肪分?jǐn)?shù)圖,圓圈所示從上到下依次為左腎上份、中份及下份ROI放置位置(腎門平面,白箭示左腎門),右腎ROI的分布與左腎類似。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查及病理學(xué)檢查 MRI掃描結(jié)束后,在麻醉狀態(tài)下解剖大鼠,取大鼠中心靜脈血檢測(cè)血TG、TC、LDL、HDL的含量。取出大鼠腎臟組織進(jìn)行HE、PAS及油紅O染色(見(jiàn)圖2)。根據(jù)腎小球形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行病理分級(jí),Ⅰ、Ⅱ級(jí)即為早期DN[6]。觀察腎組織有無(wú)脂肪染色及染色的部位,用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)油紅O染色圖片進(jìn)行分析,計(jì)算腎臟細(xì)胞內(nèi)脂滴累計(jì)光密度值/細(xì)胞總面積值(Integrated optical density/ total area of all the cells,IOD/TAC)。

圖2 大鼠腎組織油紅O染色(200×)Figure 2 Oil red O staining of renal tissue注:A.正常對(duì)照組;B.早期DN組。脂質(zhì)(黑箭示紅色顆粒)主要沉積于腎小管上皮細(xì)胞,數(shù)量明顯多于對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 基本資料 實(shí)驗(yàn)組(n=17)大鼠腎臟HE及PAS染色結(jié)果顯示,腎小球基底膜增厚、系膜增生,病理分級(jí)Ⅰ級(jí)3只、Ⅱ級(jí)14只,為早期DN。排除2只MRI圖像質(zhì)量不佳者后,共15只大鼠納入早期DN組;對(duì)照組(n=15)大鼠腎臟HE及PAS染色均未見(jiàn)異常,排除2只MRI圖像質(zhì)量不佳者后,共13只大鼠納入正常對(duì)照組。

2.2 觀察者內(nèi)及觀察者間測(cè)量腎臟FF值的一致性 2名觀察者對(duì)納入研究的28只大鼠左腎及右腎FF值測(cè)量(見(jiàn)表1)。一致性分析結(jié)果顯示,觀察者內(nèi)及觀察者間一致性良好(ICC均>0.9),采用觀察者1和觀察者2三次測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)。

表1 觀察者內(nèi)及觀察者間一致性分析Table 1 Intra-observer and inter-observer concordance analysis

2.3 早期DN組與正常對(duì)照組大鼠血脂水平及腎組織脂肪染色結(jié)果 與正常對(duì)照組比較,早期DN組大鼠TC、TG、LDL含量升高,HDL含量降低(P均<0.001)。據(jù)圖2腎組織脂肪染色顯示,早期DN組大鼠腎組織脂質(zhì)沉積增多,主要位于腎小管上皮細(xì)胞,腎臟細(xì)胞內(nèi)脂滴IOD/TAC大于正常對(duì)照組(P<0.001),且與糖尿病病程呈正相關(guān)(r=0.97,P<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 正常對(duì)照組與早期DN組大鼠血脂水平及細(xì)胞內(nèi)脂滴IOD/TAC 比較[M(P25,P75)]Table 2 Comparison of blood lipid parameters and IOD/TAC between control and early-stage DN groups

2.4 早期DN組及正常對(duì)照組大鼠腎臟FF值之間的比較 早期DN組及正常對(duì)照組大鼠左側(cè)腎臟FF值與右側(cè)腎臟FF值之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),故取右腎FF值進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)。與正常對(duì)照組比較,早期DN組大鼠腎臟FF值升高(Z=-4.26,P<0.001)。見(jiàn)表3。

表3 正常對(duì)照組與早期DN組大鼠雙側(cè)腎臟FF值Table 3 Comparison of bilateral renal FF values between control and early-stage DN groups

2.5 早期DN組大鼠腎臟FF值與腎組織脂肪染色結(jié)果、血脂水平及糖尿病病程之間的相關(guān)性 早期DN組大鼠腎臟FF值與腎臟細(xì)胞內(nèi)脂滴IOD/TAC、TC、TG、LDL含量及糖尿病病程均呈正相關(guān)(r分別為0.85、0.66、0.71、0.76、0.85)(均P<0.01),與HDL含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.71)(P<0.01),見(jiàn)表4。

表4 早期DN組大鼠腎臟FF值與各指標(biāo)之間的相關(guān)性Table 4 Correlations between renal FF and the IOD/TAC, blood lipid parameters, and the progression of diabetes in early-stage DN group

3 討論

脂毒性與DN發(fā)展密切相關(guān),大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7-10]已證實(shí)DN常伴有脂代謝紊亂,包括高脂血癥與脂質(zhì)異位沉積。但脂代謝紊亂導(dǎo)致DN的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,目前尚未完全闡明。有研究[11-12]提示,脂代謝紊亂既可通過(guò)破壞腎臟正常脂質(zhì)代謝直接損傷腎臟,也可通過(guò)全身炎癥、氧化應(yīng)激、血管損傷以及激素和其它信號(hào)分子的變化,間接影響腎臟功能。調(diào)節(jié)脂代謝紊亂對(duì)延緩DN的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。目前降血脂治療已成為DN綜合治療中的重要組成部分,但效果仍存在爭(zhēng)議。學(xué)者們?cè)絹?lái)越關(guān)注改善腎臟脂質(zhì)沉積對(duì)于DN發(fā)生、發(fā)展的意義。調(diào)節(jié)腎臟脂質(zhì)沉積有望成為治療DN的潛在靶點(diǎn)[11]。

隨著磁共振技術(shù)的不斷發(fā)展,氫質(zhì)子MR波譜(1H-magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)和基于化學(xué)位移的水脂分離技術(shù)等磁共振脂肪定量技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床及科研工作中。相較于1H-MRS及病理學(xué)穿刺活檢,MR mDxion-Quant技術(shù)具有無(wú)創(chuàng)、能反映臟器全貌、克服了磁場(chǎng)不均勻性、消除了組織T2*效應(yīng)[13]等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)脂肪肝藥物治療的療效、量化分析肝內(nèi)鐵沉積以及椎體骨髓脂肪含量的研究,并取得了較好的效果[14-17]。但國(guó)內(nèi)外對(duì)于腎臟脂肪含量的研究較少,運(yùn)用該技術(shù)無(wú)創(chuàng)性定量評(píng)估早期DN腎臟脂質(zhì)沉積,并與腎組織脂肪染色結(jié)果進(jìn)行對(duì)照,分析其與血脂水平相關(guān)性的研究更少。

本研究運(yùn)用mDxion-Quant技術(shù)活體無(wú)創(chuàng)性量化早期DN大鼠腎臟的脂肪含量,并與病理金標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)照,結(jié)果顯示,早期DN組大鼠腎臟FF值與腎組織脂肪染色所得結(jié)果-細(xì)胞內(nèi)脂滴IOD/TAC值呈高度正相關(guān),證實(shí)了該技術(shù)無(wú)創(chuàng)性活體定量評(píng)估腎臟脂質(zhì)沉積的準(zhǔn)確性,肯定了其在腎臟這種脂肪含量極少的小器官中的應(yīng)用價(jià)值,為揭示DN患者腎臟脂代謝紊亂的發(fā)生、發(fā)展以及未來(lái)相關(guān)臨床藥物治療效果的評(píng)估提供了無(wú)創(chuàng)、便捷、有效、動(dòng)態(tài)的檢測(cè)手段。同時(shí),本研究結(jié)果提示腎臟脂質(zhì)沉積與DN的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系,且隨著糖尿病病程延長(zhǎng)、血脂升高,持續(xù)高血糖、高血脂可促進(jìn)脂肪酸合成和TG積累,大量游離脂肪酸通過(guò)酯化作用轉(zhuǎn)化為TG,沉積于腎臟組織,導(dǎo)致腎臟脂質(zhì)含量不斷增加。沉積在腎臟的脂質(zhì)可能通過(guò)促進(jìn)線粒體損傷和組織炎癥等機(jī)制損害各種細(xì)胞,包括足細(xì)胞、近端腎小管上皮細(xì)胞和腎小管間質(zhì)組織,從而導(dǎo)致腎小球和腎小管病變,引發(fā)和/或加重DN[18-19]。

Yokoo等[20]運(yùn)用Dixon技術(shù)測(cè)量29例T2DM患者與40例非T2DM患者的腎臟FF,結(jié)果顯示T2DM患者的腎臟脂肪含量高于非T2DM患者,這提示T2DM患者發(fā)生腎臟脂肪沉積的風(fēng)險(xiǎn)增加,與本研究結(jié)果部分相似。但該研究缺乏腎臟病理學(xué)檢查這一金標(biāo)準(zhǔn)作為對(duì)照,且未進(jìn)一步研究腎臟脂質(zhì)沉積與DN的關(guān)系;此外,該研究對(duì)照組所納入的非糖尿病患者并非健康志愿者,而是腎臟或胰腺惡性腫瘤患者,這些惡性腫瘤對(duì)腎臟本身脂肪含量有無(wú)影響尚不明確。在此研究之后,Wang等[21]應(yīng)用Dixon技術(shù)測(cè)量61例T2DM患者(其中包括40例正常白蛋白尿和21例微量白蛋白尿)和34例非T2DM志愿者腎臟FF,結(jié)果顯示微量白蛋白尿組的FF值顯著高于正常白蛋白尿組和對(duì)照組,該結(jié)果表明Dixon技術(shù)所測(cè)腎臟FF對(duì)T2DM患者的早期腎損害具有提示意義,與本研究結(jié)果基本一致,但同樣缺乏金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

本研究實(shí)驗(yàn)組僅納入早期DN大鼠,增加中晚期DN大鼠能更好地反映DN不同時(shí)期腎臟脂質(zhì)沉積情況。其次,在本研究中,早期DN組納入大鼠腎臟病理分級(jí)包括Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí),但Ⅰ級(jí)樣本量較小,僅3只,故未分析腎臟FF值與腎臟病理分級(jí)之間的相關(guān)性;最后,采用人工放置ROI的方法對(duì)FF值進(jìn)行測(cè)量,可能存在選擇偏倚和操作誤差,但本研究采用同一區(qū)域重復(fù)測(cè)量三次取平均值的方法盡量減少這種誤差。

4 結(jié)論

MR mDxion-Quant技術(shù)可無(wú)創(chuàng)性定量評(píng)估早期DN大鼠腎臟脂質(zhì)沉積。與對(duì)照組比較,早期DN大鼠腎臟脂肪含量增加,且與糖尿病病程、血TC、TG、LDL水平呈正相關(guān),與HDL水平呈負(fù)相關(guān)。