灰氈毛忍冬抑制CRPA群體感應(yīng)系統(tǒng)的活性成分篩選研究

摘要：目的 通過篩選灰氈毛忍冬抑制碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的主要活性成分，并研究其抑制作用。方法 通過Discovery Studio的兩種對(duì)接模塊模擬分子間作用虛擬篩選抑菌成分，分析其結(jié)合模式，并檢測(cè)其對(duì)碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌生長活性、生物膜的抑制作用，構(gòu)建秀麗隱桿線蟲感染模型，評(píng)估藥物治療效果。結(jié)果 3種小分子均能不同程度抑制碳青霉烯類銅綠假單胞菌生長及生物膜形成，且顯著提高線蟲感染后存活率。結(jié)論 3種灰氈毛忍冬小分子藥物對(duì)碳青霉烯類銅綠假單胞菌的生長具有顯著抑制作用，有望成為新型作用于QS系統(tǒng)的CRPA抑制劑。

關(guān)鍵詞：灰氈毛忍冬；碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌；群體感應(yīng)系統(tǒng)；分子對(duì)接

中圖分類號(hào)：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on screening of active components from Lonicera macranthoides to inhibit carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa quorum sensing system

Tang Xiao， Pu Zhiting， and Yin Tieqiu

（Guilin Medical College， School of Laboratory Medicine，" Guilin 541004））

Abstract Objective To screen and identify the major active components of Lonicera macranthoides that inhibit the quorum sensing （QS） system of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa and investigate the inhibitory effects of these components. Methods Virtual screening of antibacterial components was conducted using two docking modules in Discovery Studio to simulate molecular interactions and analyze their binding modes. The inhibitory effects of the screened components on the growth activity and biofilm formation of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa were determined. A Caenorhabditis elegans infection model was established to evaluate the therapeutic effects of the drugs. Results All three small molecules exhibited varying degrees of growth inhibition and biofilm formation reduction in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. Furthermore， all three small-molecule drugs significantly improved the survival rate of Caenorhabditis elegans after infection. Conclusion The three small molecule drugs derived from Lonicera macranthoides demonstrated significant inhibitory effects on the growth of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa， highlighting their potential as novel CRPA inhibitors targeting the QS system.

Key words Lonicera macranthoides; Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa; Quorum sensing system; Molecular docking

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）對(duì)亞胺培南和美羅培南兩種藥物的耐藥率居高不下，導(dǎo)致碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa，CRPA）近年來的檢出率居高不下，其感染率仍處于一個(gè)較高水平，且預(yù)后較差。目前，CRPA已被世界衛(wèi)生組織列為最高級(jí)別病原體[1]，其致病基因來自于大量多變的毒力因子和基因組中的抗生素抗藥性決定因子[2-4]。群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）使細(xì)菌能夠通過其自身釋放的特定的信號(hào)分子感知種群密度與環(huán)境中其他細(xì)菌的變化，從而控制一系列的基因進(jìn)行特異性表達(dá)細(xì)菌的毒力因子與形成生物膜，與細(xì)菌耐藥密切相關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)PA的QS系統(tǒng)主要由las系統(tǒng)、rhl系統(tǒng)、喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)及IQS系統(tǒng)構(gòu)成[5]。因此，以QS系統(tǒng)為靶點(diǎn)研究新型PA抗生素成為了當(dāng)下的熱點(diǎn)。

灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides）自古便以其獨(dú)特的藥用價(jià)值而聞名于世，多用于治療熱血毒痂、風(fēng)寒感冒、瘡瘍潰爛等病癥[6]，同時(shí)兼具抗炎、抗氧化等多種功效而備受關(guān)注，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。目前已被證實(shí)含有多種抗菌成分如黃酮類、酚酸類等，但針對(duì)灰氈毛忍冬治療細(xì)菌感染或炎癥感染的研究多集中于提取物，關(guān)于灰氈毛忍冬中藥小分子成分對(duì)抑菌作用的研究還稍顯不足。為進(jìn)一步闡明灰氈毛忍冬發(fā)揮抑菌效果的具體小分子成分，本研究選擇QS系統(tǒng)關(guān)鍵受體蛋白LasR、PqsR、PqsE作為靶點(diǎn)，通過分子對(duì)接技術(shù)從灰氈毛忍冬中篩選出可抑制3種受體蛋白的中藥小分子，通過分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合抑菌試驗(yàn)，探討中藥小分子對(duì)CRPA的生長、生物膜形成的抑制作用，并通過線蟲體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證，為CRPA的中藥抗生素開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑及藥物

LB肉湯（西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司）；瓊脂粉、胰蛋白胨、M9緩沖液、M-H營養(yǎng)瓊脂（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；TTC染色液（北京索萊寶科技有限公司）；木犀草苷（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111720-202111）；綠原酸（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-202119）；柯伊利素-7-O-葡萄糖苷（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：J29HB189870）；香葉木素-7-O-葡萄糖苷（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：M10HB177806）。

1.2 菌株、秀麗隱桿線蟲

臨床分離的泛耐藥菌株CRPA（P201）由本課題組保存。秀麗隱桿線蟲AU37購自美國線蟲遺傳中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）。

1.3 儀器

VITEK-2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（法國BioMerieux公司）、細(xì)菌比濁儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司）、恒溫?fù)u床（美國New Brunswick Scientific）、二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）、A2型生物安全柜（ESCO）、酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分子對(duì)接篩選灰氈毛忍冬抑制CRPA群體感應(yīng)系統(tǒng)的活性成分

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7]并借助Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載灰氈毛忍冬小分子成分的二維結(jié)構(gòu)作為配體，最終收集灰氈毛忍冬小分子成分共140種，從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb）中下載蛋白LasR（ID：3IX3）和蛋白PqsR（ID：4JVD）以及蛋白PqsE（ID：7KGX）的三維結(jié)構(gòu)，將配體與受體導(dǎo)入Discovery Studio 2020進(jìn)行優(yōu)化處理，根據(jù)PDB數(shù)據(jù)庫提供的相關(guān)研究選擇對(duì)接活性位點(diǎn)。使用Libdock對(duì)接模塊將灰氈毛忍冬化學(xué)成分分別與3個(gè)CRPA受體蛋白進(jìn)行對(duì)接。因此前已有相關(guān)研究證明綠原酸對(duì)PA具有較好抑制作用[8-12]，且綠原酸屬于有機(jī)酸類，為灰氈毛忍冬主要活性成分之一，故選用綠原酸為對(duì)照組，并以綠原酸與3個(gè)受體蛋白的Libdock Score作為初步篩選的閾值。

匯總Libdock Score高于綠原酸的小分子化合物，使用Discovery Studio 2020的CDOCKER模塊進(jìn)行更精確的對(duì)接。根據(jù)活性位點(diǎn)結(jié)合情況，以及CDOCKER INTERACTION ENERGY排名評(píng)分模塊進(jìn)一步篩選出合適的中藥小分子藥物。

2.2 篩選藥物抑菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 牛津杯法檢測(cè)抑菌活性

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液稀釋后使用無菌接種環(huán)均勻涂布在MH固體培養(yǎng)上，放置牛津杯，用移液器向牛津杯中各加入200 μL的木犀草苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷、柯伊利素-7-O-葡萄糖苷、LB液體培養(yǎng)基和DMSO，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

2.2.2 藥敏試驗(yàn)與最小抑菌濃度檢測(cè)

根據(jù)CLSI M100（第30版）標(biāo)準(zhǔn)，選擇銅綠假單胞菌的抗菌藥物A組4種：頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦，使用VITEK-2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)P201進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)P201對(duì)臨床抗生素的耐藥情況；配置初始濃度為1024 μg/mL的抗菌藥物，分別將各藥物于96孔板中通過微量肉湯稀釋法用LB肉湯配制濃度為1024～2 μg/mL，加入濃度約為1.5×108 CFU/mL的菌液，并設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后放入酶標(biāo)儀中測(cè)定A570值，后每孔加入30 μL濃度為0.4% TTC染色液，根據(jù)A值和顏色變化判斷最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值[13]。

2.3 生物膜抑制實(shí)驗(yàn)

依次倍比稀釋3種藥物，獲得（0、1/8、1/4、1/2、1）MIC梯度，96孔板中每孔加入等量藥物與菌液，每組重復(fù)3次，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用1×PBS（pH 7.4）輕輕漂洗2次去除未結(jié)合的浮游菌，室溫下干燥后加入200 μL甲醇固定生物膜，室溫下靜置30 min后加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫染液，染色15 min后用PBS清洗未結(jié)合的染液，然后每孔加入200 μL無水乙醇溶解著色的生物膜，待附著在孔壁上的生物膜完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)A570，取平均值。

2.4 篩選藥物對(duì)CRPA感染秀麗隱桿線蟲的治療效果評(píng)估

2.4.1 秀麗隱桿線蟲感染CRPA模型的建立

使用M9緩沖液將同步化的秀麗隱桿線蟲從線蟲標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（nematode growth media）平板上沖洗至離心管中，加入M9緩沖液沖洗，6000～8000 r/min離心30 s后棄上清液。將菌液分別稀釋至1×108、1×107、1×106、1×105和1×104 CFU/mL，于96孔板中加入各濃度菌液100 μL，使用移液器將線蟲平均分布于96孔板各孔中，與相應(yīng)濃度菌液置于25 ℃，85%濕度下共同培養(yǎng)，使用顯微鏡觀察線蟲存活情況。

2.4.2 篩選藥物對(duì)CRPA感染秀麗隱桿線蟲存活率的干預(yù)

收集同步化后的線蟲，使用M9緩沖液清洗3次，選擇對(duì)應(yīng)的感染濃度和感染時(shí)間，將線蟲與稀釋后的菌液混合于EP管中25 ℃共同培養(yǎng)至所需時(shí)間。使用移液器將感染后的線蟲液100 μL轉(zhuǎn)移至96孔板中，實(shí)驗(yàn)組各孔加入100 μL MIC濃度的篩選藥物，陽性對(duì)照組加入100 μL培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入200 μL未感染P201的線蟲，置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，分別于8、12、24和36 h顯微鏡下觀察藥物治療后線蟲的存活情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（ANOVA），否則使用非參數(shù)檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行線蟲生存分析，以Plt;0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 分子對(duì)接篩選灰氈毛忍冬抑制CRPA群體感應(yīng)系統(tǒng)的活性成分

3.1.1 分子對(duì)接篩選

對(duì)接結(jié)果顯示，綠原酸與3種受體蛋白LasR、PqsR、PqsE的Libdock Score分別是138.56、118.00、124.27。LasR對(duì)接結(jié)果中，有11種小分子成分高于陽性對(duì)照；PqsR對(duì)接結(jié)果中，有31種小分子成分高于陽性對(duì)照；PqsE對(duì)接結(jié)果中，有47種小分子成分高于陽性對(duì)照，這說明灰氈毛忍冬具有作為CRPA抑制劑的潛力，并更傾向作用于PqsE受體蛋白。結(jié)果匯總，共8種小分子在3次對(duì)接中均優(yōu)于綠原酸，分別是黃酮類的香葉木素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素7-O-半乳糖苷、芹菜素-7-O-鼠李糖苷、木犀素-3-O-鼠李糖苷、木犀草苷、柯伊利素-7-O-葡萄糖苷，以及首次從灰氈毛忍冬中提取的shomaside F和kankanoside E[14]。如圖1所示，8種小分子均能與3種受體蛋白通過氫鍵、碳?xì)滏I和范德華力等作用力在活性位點(diǎn)處相互結(jié)合，形成穩(wěn)定的化合物。

根據(jù)比較分析結(jié)果顯示（表1），在2種對(duì)接模式中，木犀草素-7-O-半乳糖苷與LasR對(duì)接參數(shù)最高；另一方面，shomaside F和芹菜素-7-O-鼠李糖苷與PqsR對(duì)接參數(shù)最高；木犀素-3-O-鼠李糖苷在與PqsE對(duì)接參數(shù)最高。

3.1.2 篩選藥物結(jié)合模式分析

由于部分中藥小分子相關(guān)研究較匱乏，提取難度大且無標(biāo)準(zhǔn)品，因此在選擇后續(xù)研究對(duì)象時(shí)需要綜合考慮多個(gè)因素，包括與受體的結(jié)合能力、小分子含量以及藥物上市情況等?；谶@些考慮，我們選擇了木犀草苷、柯伊利素-7-O-葡萄糖苷以及香葉木素-7-O-葡萄糖苷作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的中藥小分子，并以LasR蛋白作為主要研究對(duì)象。

3種小分子與LasR對(duì)接相互作用的主要氨基酸殘基位點(diǎn)如圖2所示，這些小分子與LasR蛋白的結(jié)合主要通過常規(guī)氫鍵、疏水相互作用和π-π堆疊力來實(shí)現(xiàn)。值得注意的是，這3種小分子均能與LasR蛋白中的4個(gè)特定位點(diǎn)結(jié)合，分別是亮氨酸殘基Leu110、Leu36；天冬氨酸殘基Asp73和酪氨酸殘基Tyr64。這些位點(diǎn)與Bottomley等[15]研究中確定的LasR與QS系統(tǒng)信號(hào)分子OdDHL關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)一致。推測(cè)這4個(gè)氨基酸殘基在小分子和受體蛋白的結(jié)合中發(fā)揮著重要作用，因此可能成為抑制LasR的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

3.2 藥物抑菌實(shí)驗(yàn)

3.2.1 牛津杯法抑菌結(jié)果

培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小，如圖3所示，木犀草苷、柯伊利素-7-O-葡萄糖苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷的牛津杯周圍明顯可見無細(xì)菌生長圓環(huán)，DMSO和LB液體培養(yǎng)基牛津杯周圍生長細(xì)菌，證明3種篩選藥物對(duì)P201具有抑菌活性，且溶劑DMSO和LB液體培養(yǎng)基無抑菌效果。

3.2.2 藥敏試驗(yàn)與最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

如表2所示，P201對(duì)臨床常用的4種傳統(tǒng)抗生素全部耐藥；4種抗菌藥物綠原酸、木犀草苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷、柯伊利素-7-O-葡萄糖苷對(duì)P201的MIC測(cè)定結(jié)果如圖4所示，孔內(nèi)呈紅色表示有細(xì)菌生長。木犀草苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷、柯伊利素-7-O-葡萄糖苷的MIC值均為128 μg/mL，綠原酸的MIC值為512 μg/mL，3種篩選藥物的MIC值均低于綠原酸與傳統(tǒng)抗生素哌拉西林/他唑巴坦。

3.3 生物膜結(jié)晶紫染色定量分析

綠原酸、木犀草苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷和柯伊利素-7-O-葡萄糖苷對(duì)P201生物膜的抑制作用進(jìn)行了結(jié)晶紫染色法定量分析。結(jié)果顯示（圖5），在所測(cè)的亞抑菌濃度下，與對(duì)照組相比，經(jīng)3種藥物處理過的P201生物膜產(chǎn)量均顯著減少，并且隨著濃度增加，它們對(duì)生物膜形成的抑制作用顯著增強(qiáng)。且與對(duì)照藥物綠原酸相比，其他3種藥物在MIC濃度下的抑制效果均高于綠原酸。此外，香葉木素-7-O-葡萄糖苷在1/4×MIC和1/8×MIC濃度下的抑制效果相對(duì)較弱，推測(cè)香葉木素-7-O-葡萄糖苷在這些濃度下的抑制機(jī)制或作用方式與其他濃度存在差異，需要進(jìn)一步深入研究。

3.4 篩選藥物對(duì)CRPA感染秀麗隱桿線蟲的治療效果評(píng)估

3.4.1 秀麗隱桿線蟲感染CRPA模型的建立

顯微鏡下觀察到線蟲呈正弦型，有覓食活動(dòng)，輕微刺激有反應(yīng)，則線蟲為存活狀態(tài)（圖6A），線蟲呈剛性直線型，刺激無明顯反應(yīng)，則判定為死亡（圖6B）。使用不同濃度CRPA感染線蟲后，結(jié)果如圖6C所示，線蟲的存活率隨細(xì)菌感染的時(shí)間延長而不斷降低，除空白組外，其余感染組線蟲在24 h后全部死亡，其中，1×108 CFU/mL組在感染后1 h便開始死亡，4 h時(shí)半數(shù)線蟲死亡，線蟲活動(dòng)頻率明顯降低，1×107、1×106、1×105和1×104" CFU/mL組達(dá)到半數(shù)線蟲死亡的時(shí)間分別為5、7、8和12 h。各濃度感染組與空白組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=30.49，Plt;0.0001）。不同濃度組CRPA均能使線蟲造成初步感染，使線蟲自主活動(dòng)幾乎喪失，為避免細(xì)菌過度繁殖生長，線蟲死亡速度過快，導(dǎo)致藥物作用不明顯，最終選擇1×105 CFU/mL終濃度下感染8 h為實(shí)驗(yàn)起始濃度和時(shí)間，進(jìn)行后續(xù)藥物治療線蟲感染實(shí)驗(yàn)。

3.4.2 篩選藥物對(duì)CRPA感染秀麗隱桿線蟲存活率的干預(yù)

秀麗隱桿線蟲經(jīng)藥物治療后，結(jié)果如圖7所示，3種篩選藥物可以提高CRPA感染后線蟲存活率。從8 h開始，線蟲存活率顯著升高，8 h時(shí)各藥物組存活率為100%，未治療組線蟲死亡數(shù)量達(dá)到50%。12 h后，各藥物組有80%左右存活率，香葉木素-7-O-葡萄糖苷組存活率最高。而超過24 h，治療組存活率仍然高于50%，36 h時(shí)，木犀草苷組、柯伊利素-7-O-葡萄糖苷組線蟲死亡率開始過半，香葉木素-7-O-葡萄糖苷組仍保持50%左右存活率。綜上所述，3種篩選藥物具有治療CRPA感染秀麗隱桿線蟲作用，經(jīng)藥物治療后，與對(duì)照組相比，存活率得到極大提升，其中，香葉木素-7-O-葡萄糖苷治療組存活率最高，柯伊利素-7-O-葡萄糖苷組其次。

4 討論

近年來，CRPA的治療難點(diǎn)主要在于抗生素耐藥性問題，傳統(tǒng)臨床抗生素治療的靶點(diǎn)主要包括細(xì)胞壁合成酶、蛋白合成酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶等，通過干擾細(xì)菌的合成過程實(shí)現(xiàn)抑菌，研究表明，CRPA對(duì)頭孢他啶、亞胺培南等傳統(tǒng)臨床抗生素的耐藥情況不容樂觀[16-17]，迫切需要新的藥物靶點(diǎn)以應(yīng)對(duì)這一公共衛(wèi)生問題，而QS系統(tǒng)作為菌群間的交流系統(tǒng)，通過產(chǎn)生和感應(yīng)特定的信號(hào)分子，協(xié)調(diào)細(xì)菌的群體行為，形成生物膜。生物膜是導(dǎo)致PA耐藥性逐年增加的主要原因之一，為細(xì)菌提供保護(hù)的同時(shí)將細(xì)菌附著于宿主組織表面。QS系統(tǒng)調(diào)控的群體行為較為穩(wěn)定，不易出現(xiàn)突變導(dǎo)致的耐藥性。同時(shí)，干擾信號(hào)分子的合成、阻斷信號(hào)傳導(dǎo)等針對(duì)QS系統(tǒng)的干預(yù)可能更具持久和有效的治療效果。因此，避開傳統(tǒng)抗生素的作用靶點(diǎn)，研究特異性針對(duì)QS系統(tǒng)的新型抗菌藥物已成為研究熱點(diǎn)。

基于此，課題組前期從灰氈毛忍冬提取物出發(fā)，發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬提取物可以有效抑制CRPA生長，為進(jìn)一步揭示灰氈毛忍冬發(fā)揮抑菌作用的具體成分，本研究應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)，圍繞QS系統(tǒng)對(duì)140種灰氈毛忍冬中的中藥小分子進(jìn)行篩選驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)木犀草苷、柯伊利素-7-O-葡萄糖苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷中的小分子與QS系統(tǒng)相關(guān)蛋白結(jié)合較穩(wěn)定，預(yù)示這3種藥物很可能是通過抑制QS系統(tǒng)蛋白的激活，參與CRPA生長、致病的過程，從而發(fā)揮出抑菌作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選結(jié)果，通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)、生物膜定量分析。結(jié)果表明，3種篩選藥物對(duì)CRPA P201的最小抑菌濃度均遠(yuǎn)低于對(duì)照組綠原酸以及傳統(tǒng)抗生素哌拉西林/他唑巴坦，通過結(jié)晶紫定量生物膜實(shí)驗(yàn)，所測(cè)藥物在MIC濃度下對(duì)生物膜的抑制作用也均優(yōu)于綠原酸，3種篩選藥物可通過破壞生物膜發(fā)揮抑菌效果。結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果，推測(cè)3種篩選藥物可能優(yōu)先結(jié)合LasR上的4個(gè)關(guān)鍵氨基酸活性位點(diǎn)，從而與QS系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL、OdDHL等競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抑制las系統(tǒng)對(duì)CRPA的作用，實(shí)現(xiàn)抑菌效果。體內(nèi)抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在經(jīng)過藥物處理后，被CRPA感染后的秀麗隱桿線蟲存活率有所提高，然而，在超過8 h后，線蟲依然會(huì)逐漸死亡。目前，秀麗隱桿線蟲感染CRPA的機(jī)制尚不完全清楚，可能通過釋放毒力因子，穿過線蟲的體壁，進(jìn)入其內(nèi)部組織，從而干擾線蟲的正常生理功能。因此，推測(cè)MIC濃度下的各藥物雖然能抑制細(xì)菌生長，但無法完全消除線蟲體內(nèi)的細(xì)菌或其他毒力因子等致病因素，或者由于藥物作用使得環(huán)境改變，不適宜線蟲生存。因此，最佳治療時(shí)間和最佳藥物濃度有待進(jìn)一步確認(rèn)，以優(yōu)化治療效果。

綜上，灰氈毛忍冬的小分子成分木犀草苷、柯伊利素-7-O-葡萄糖苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷對(duì)QS系統(tǒng)具有較顯著的抑制效果，有望成為針對(duì)QS系統(tǒng)的CRPA新型抗菌藥物。為了確保臨床應(yīng)用安全可靠，還需更進(jìn)一步生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小分子與蛋白的結(jié)合能力以及研究篩選藥物的具體作用機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)

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