二次脫鈣法在臨床病理骨組織HE制片中的應(yīng)用研究

李 彬,黨裔武,邱健峰,陳 罡,李 奇,黃志廣

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,廣西 南寧 530021)

被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”的病理診斷已在眾多疾病和科研中得到廣泛應(yīng)用,蘇木精-伊紅(HE)切片的質(zhì)量會對疾病診斷產(chǎn)生較大的影響[1]。而在臨床病理切片技術(shù)中,骨組織、鈣化組織等因其含有豐富的鈣鹽沉積,質(zhì)地十分堅硬,必須使用強(qiáng)酸進(jìn)行脫鈣處理才能制片[2]。因此,一種良好的脫鈣技術(shù)在臨床病理HE制片中十分重要。

脫鈣是制作骨組織HE切片及骨病理診斷中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[3]。目前,使用較多的脫鈣液為復(fù)合類型的脫鈣液,是將強(qiáng)酸與中性福爾馬林固定液按比例配制而成,可將骨組織中較難溶于水的磷酸鈣和碳酸鈣轉(zhuǎn)變?yōu)槿苡谒牧姿猁}和鈣鹽[4]。目前,國內(nèi)實驗室常采用常規(guī)脫鈣法處理骨組織,即將骨組織放入脫鈣液中進(jìn)行脫鈣,脫鈣時間的長短取決于骨組織的類型和脫鈣液的種類。常規(guī)脫鈣法如脫鈣時間過短會出現(xiàn)脫鈣不足、鈣化灶、砂礫體等情況,如再直接進(jìn)行切片處理會出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)不全、HE染色不均勻、切片合格率低下等情況[5]。而脫鈣時間過長會破壞組織細(xì)胞,影響HE制片及病理診斷[6]。此外骨組織在強(qiáng)酸溶液中脫鈣時間過長組織內(nèi)的抗原物質(zhì)易受到破壞,導(dǎo)致抗原的免疫活性低下,在免疫組織化學(xué)染色中抗原無法表達(dá),常導(dǎo)致誤診[7]。

近年來,作者常采用二次脫鈣方法制作骨組織HE切片,即骨組織常規(guī)脫鈣與蠟塊表面脫鈣相結(jié)合的方法。其中常規(guī)脫鈣法時間較短,一般鈣化組織在甲酸-甲醛脫鈣液中脫鈣7～8 h即可,而堅硬的骨組織則選擇過夜脫鈣。在常規(guī)脫鈣結(jié)束后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋,制作成的蠟塊粗修后在蠟塊表面敷20%鹽酸液,敷1 min左右即可將蠟塊表面的鈣質(zhì)去除。本研究選取本院收集的脫鈣不充分、骨組織塊或含鈣化組織的蠟塊100塊,對二次脫鈣法在臨床病理骨組織HE制片中的應(yīng)用價值進(jìn)行了探討,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料 收集2022年6-12月本院病理科脫鈣不充分、骨組織塊或含鈣化組織的蠟塊100塊。

1.1.2試劑 20%鹽酸、脫鈣液(20%甲酸20 mL、10%中性福爾馬林80 mL)等。

1.1.3儀器及設(shè)備 LEICA ASP300S自動組織脫水機(jī)、LEICA石蠟包埋機(jī)、LEICA RM2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)、TKD-TP攤片機(jī)、LEICA ST5020全自動HE染色機(jī)、全自動封片機(jī)等。

1.2方法

1.2.1脫鈣方法 將收集的100個蠟塊分別經(jīng)常規(guī)脫鈣法(對照組)和二次脫鈣法(研究組)脫鈣后制片,2種方法均使用同一個蠟塊進(jìn)行制片,分析2種方法制片效果的差異。同一蠟塊均在同一條件下經(jīng)常規(guī)脫鈣法脫鈣,對照組在蠟塊經(jīng)冷凍之后直接進(jìn)行切片[8],研究組則在經(jīng)常規(guī)脫鈣法制片后用鑷子夾取和蠟塊大小一致的吸水紙,蘸取20%鹽酸液后貼在蠟塊的最大面上,使蠟塊的最大面脫鈣,脫鈣1 min。二次脫鈣法只需去除蠟塊表面的鈣質(zhì),1 min即可去除,因此,對組織大小和厚度無特殊要求。表面脫鈣后保持刀架不移動并更換鋒利的切片刀,用冷凍的包埋框貼在蠟塊表面使其冷凍后進(jìn)行切片。切片完成后采用LEICA ST5020全自動HE染色機(jī)進(jìn)行染色。見圖1、2。

注:將取材后的組織放入復(fù)合脫鈣液中脫鈣。圖1 常規(guī)脫鈣法

1.2.2觀察指標(biāo)

1.2.2.1切片組織結(jié)構(gòu)完整性 切片外觀組織完整、無掉片、卷片等,以及鏡下觀察組織完整、無掉片缺損判定為優(yōu);否則判定為差[8]。

1.2.2.2HE染色效果 鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)完好、核質(zhì)染色分明、核仁清晰、細(xì)胞質(zhì)染色鮮艷判定為滿意,否則判定為不滿意[8]。

1.2.2.3切片優(yōu)良率 切片厚薄均勻、沒有污染計2分,切片完整、透明度好、無皺褶、無刀痕及裂縫、封片整潔無溢膠及氣泡、核質(zhì)染色分明,切片無松散及貼片位置適當(dāng)、切片整潔分別計1分。8分以上為優(yōu),6～<8分為良好,<6分為差。優(yōu)良率=(優(yōu)+良)/總HE片數(shù)×100%[8]。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示,采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組切片組織結(jié)構(gòu)完整性比較 研究組切片中有81張切片外觀組織結(jié)構(gòu)完整,無卷片及缺損,顯微鏡觀察組織結(jié)構(gòu)完整,無卷片及缺損,切片質(zhì)量優(yōu),切片組織結(jié)構(gòu)完整率為81.00%。對照組切片中只有25張切片組織結(jié)構(gòu)完整,其余組織切片在外觀和顯微鏡觀察均有不同程度的卷片及缺損,切片組織結(jié)構(gòu)完整率為25.00%。研究組切片組織結(jié)構(gòu)完整率明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組切片組織結(jié)構(gòu)完整性比較[n(%)]

2.22組切片HE染色效果比較 研究組切片中符合HE染色滿意切片85張,HE染色滿意度為85.0%。對照組切片中符合HE染色滿意切片57張,HE染色滿意度為57.0%。研究組切片HE染色滿意度明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖3、4。

表2 2組切片HE染色效果比較[n(%)]

注:核質(zhì)對比分明,染色鮮艷。圖3 二次脫鈣法(HE染色,40×)

2.32組切片優(yōu)良率比較 研究組切片中評價為優(yōu)的切片62張,評價為良的切片27張,切片優(yōu)良率為89.0%。對照組切片中評價為優(yōu)的切片16張,評價為良的切片33張,切片優(yōu)良率為49.0%。研究組切片優(yōu)良率明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組切片優(yōu)良率比較[n(%)]

3 討 論

近年來,骨組織疾病發(fā)病率一直處于上升階段,因此,學(xué)者加強(qiáng)了對骨組織疾病的相關(guān)研究[9]。在常規(guī)骨組織HE制片過程中一種良好的脫鈣方法不僅能保證組織結(jié)構(gòu)和組織抗原不被破壞,還能保證良好的HE染色效果[10]。

本研究中對照組切片采用常規(guī)脫鈣法,其組織結(jié)構(gòu)完整率為25.0%,HE染色滿意度為57.0%,切片優(yōu)良率為49.0%。研究組切片采用二次脫鈣法,其組織結(jié)構(gòu)完整率為81.0%,HE染色滿意度為85.0%,切片優(yōu)良率為89.0%。二次脫鈣法HE制片后組織結(jié)構(gòu)完整性、HE染色滿意度、切片優(yōu)良率均高于常規(guī)脫鈣法,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明二次脫鈣法在骨組織制片中較常規(guī)脫鈣法具有更高的應(yīng)用價值及意義。

在本研究中,常規(guī)脫鈣法采用甲酸-甲醛復(fù)合型脫鈣液,相比目前多數(shù)實驗室使用的鹽酸、硝酸等強(qiáng)酸,骨組織經(jīng)甲酸-甲醛復(fù)合型脫鈣液脫鈣后,組織損失較小,結(jié)構(gòu)較完整,HE染色對比度較高,染色鮮艷較且均勻,但缺點(diǎn)是完全脫鈣所需時間較長[11]。一般鈣化組織在甲酸-甲醛復(fù)合型脫鈣液中脫鈣7～8 h即可,而堅硬的骨組織則選擇過夜脫鈣。常規(guī)脫鈣結(jié)束后脫鈣時間過短不可避免地會出現(xiàn)脫鈣不足、鈣化灶和砂礫體的情況[5]。因此,在常規(guī)脫鈣結(jié)束后再次對制成的蠟塊采用表面脫鈣法,在粗修后的蠟塊表面敷20%鹽酸液,敷1 min左右即可將蠟塊表面的鈣質(zhì)處理干凈。因表面脫鈣法脫鈣時間短,所以,要使用比甲酸脫鈣能力更強(qiáng)的鹽酸液[11]。

與國內(nèi)大多數(shù)脫鈣方法比較,二次脫鈣法能保證骨組織結(jié)構(gòu)的完整性,提高HE染色的紅藍(lán)對比度,使染色鮮艷且均勻。此外,二次脫鈣法大大縮短了脫鈣時間,從取材到HE制片完成、鈣化組織只需要2 d,堅硬的骨組織最多需要3 d。采用此方法可制作出優(yōu)質(zhì)的骨組織切片,并能將其運(yùn)用在多種染色方法上,對臨床病理診斷工作具有十分重要的意義。

綜上所述,二次脫鈣法在骨組織HE制片中有較高的應(yīng)用價值,使用二次脫鈣法制片能保證切片組織結(jié)構(gòu)完整性、提高骨組織切片優(yōu)良率和HE染色滿意度。此外,二次脫鈣法可大大縮短組織脫鈣時間,且操作方法簡單、快捷,值得推廣應(yīng)用。