不同酚類與乳清蛋白共價(jià)交聯(lián)對(duì)松仁油Pickering 乳液的影響

趙鑫磊，包怡紅，2*，駱嘉原，高 博，賈銘杰，蔣世龍

（1 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 哈爾濱150040 2 黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150040 3 黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司 北京 100015）

蛋白質(zhì)與酚類化合物相互作用可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和疏水特性，進(jìn)而影響功能性質(zhì)，如溶解性、乳化性、膠凝性、熱穩(wěn)定性等，也會(huì)影響植物多酚的生物活性和生物利用度等[1]。疏水性不僅與蛋白質(zhì)表面的接觸程度有關(guān)，還與從水相向有機(jī)相間遷移的氨基酸殘基的自由能有關(guān)，加工條件、加工方法、蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征等都可對(duì)表面疏水性產(chǎn)生干預(yù)作用[2]，性能也會(huì)因蛋白的性質(zhì)發(fā)生變化。乳清分離蛋白（Whey protein isolate，WPI）是干酪、酪蛋白制備工業(yè)中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，在食品行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，作為食品中的雙親性生物大分子，WPI 表面含有大量的氨基酸，具有帶電親水區(qū)域和疏水性區(qū)域以及復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)[3]。另外，WPI 能在油-水界面上均勻分布，并能有效阻止油脂氧化[4]，因此，它在乳液遞送體系中廣泛應(yīng)用，并有作為Pickering 乳液乳化劑的潛力。Zhao 等[5]制備了沒食子酸-玉米醇溶蛋白納米粒子，并將其用作Pickering 乳液液滴的界面穩(wěn)定劑，其乳液中的顆粒層通過物理屏障效應(yīng)防止相鄰乳液液滴聚結(jié)，并通過脂質(zhì)氧化抑制劑擴(kuò)散來延緩脂質(zhì)氧化。

酚類化合物的基本骨架結(jié)構(gòu)是芳香環(huán)，整體結(jié)構(gòu)是由1 個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)結(jié)合羥基組成，將其按照結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類，可分為羥基苯甲酸、羥基肉桂酸、黃烷醇、黃酮醇和花色苷等。沒食子酸（Gallic acid，GA）又名3，4，5-羥基苯甲酸，常作低分子質(zhì)量的天然抗氧化劑廣泛使用[6]。香草酸（Vanillic acid，VA），又稱4-羥基-3-甲氧基苯甲酸，是植物中常見的羥基苯甲酸類成分之一。食品加工中，蛋白質(zhì)與酚類物質(zhì)間容易發(fā)生相互作用，酚類中的酚羥基與蛋白質(zhì)的氨基或羧基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物。沒食子酸可以通過對(duì)魚肌原纖維蛋白的表面疏水性、巰基和羰基含量的改變，使蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且對(duì)其添加量有劑量依賴性[7]。Cao 等[8]研究表明，沒食子酸能抑制豬肉肌原纖維蛋白質(zhì)羰基的形成，而高濃度的沒食子酸降低了蛋白質(zhì)的凝膠性能。松仁油含有約90%的不飽和脂肪酸，可降低血壓和血膽固醇[9]，由于易氧化以及其它特性限制了其在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用。乳液是最常見的食用油脂的形式，含有不飽和脂肪酸的乳狀液食品在加工和儲(chǔ)存過程中容易發(fā)生脂質(zhì)氧化，也會(huì)促使蛋白質(zhì)氧化，從而產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)，甚至形成有毒化合物，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。Pickering 乳液由吸附在油-水界面的固體顆粒組成，通過乳液液滴表面的固體顆粒界面層吸附到油-水界面，產(chǎn)生強(qiáng)烈的空間排斥，防止液滴聚集[10]，從而防止油滴的積累，穩(wěn)定體系[11]。

深入了解不同結(jié)構(gòu)、劑量的酚類與WPI 共價(jià)結(jié)合后在結(jié)構(gòu)、功能特性上的差異，可為松仁油Pickering 乳液在食品體系的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。本研究測(cè)定了與不同劑量的羥基苯甲酸化合物（沒食子酸和香草酸）共價(jià)結(jié)合的WPI 的表面疏水性和巰基含量，并通過紅外光譜和熒光光譜表征蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，探討顆粒表面疏水性與松仁油Pickering 乳液乳化性能、流變性質(zhì)及氧化穩(wěn)定性的關(guān)系，為進(jìn)一步提高蛋白性能，拓寬應(yīng)用領(lǐng)域，以及充分利用松仁油等農(nóng)林資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

松仁油，由黑龍江省伊春市林業(yè)局提供；乳清分離蛋白（91%），新西蘭Fonterra 公司；沒食子酸（GA）、香草酸（VA）、疊氮鈉，美國(guó)MP Biomedicals公司；β-巰基乙醇、磷酸鹽、ANS 等，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；NaCl、NaOH、NaN3等，科龍化工試劑廠。

FE20 pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV2550 紫外-可見分光光度計(jì)、PL203 型電子分析天平，日本島津公司；Discovery DHR-1 流變儀，美國(guó)TA 公司；F-7000 熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；LSM 800 激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)卡爾蔡司光學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50 型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；T6 新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Zetasizer ZS90 型激光粒度儀，英國(guó)Malvern 儀器有限公司；TENSOR27 傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 WPI-酚類化合物復(fù)合顆粒的制備 制備4 g/L 的乳清分離蛋白溶液，室溫（25.0 ℃）下以200 r/min 的速度磁力攪拌2 h 后，于4 ℃條件下過夜備用，使其充分水合。將沒食子酸和香草酸2 種酚類化合物溶于水，沒食子酸和香草酸的添加量均為5～10 g/L，使用1 mol/L NaOH 溶液將酚酸溶液的pH 值調(diào)至9.0。以1∶1 的體積比將pH 值同樣調(diào)至9.0 的蛋白溶液與酚類混合均勻，在持續(xù)接觸氧氣的條件下，不間斷攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后，重新調(diào)整溶液pH 值為7.0，透析48 h，間隔6 h 換水，隨后真空冷凍干燥獲得粉末狀顆粒，放置于干燥皿中備用。

1.2.2 游離巰基和總巰基含量的測(cè)定 參考Huang 等[12]的方法測(cè)定游離巰基和總巰基含量。

1.2.3 表面疏水性的測(cè)定 使樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，將ANS（8mmol/L）溶解于10 mmol/L PBS 中，取4 mL 的樣品溶液放入5 mL 離心管中，加入20 μL 的ANS，渦旋30 s，靜置3 min。在激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)光波長(zhǎng)為400～600 nm[13]的條件下，最大熒光強(qiáng)度最大值即為表面疏水性。

1.2.4 紅外光譜的測(cè)定 通過傅里葉紅外光譜儀配備衰減全反射池測(cè)定FT-IR 光譜，在4 000～500 cm-1的掃描范圍內(nèi)以4 cm-1的分辨率測(cè)量樣品光譜。

1.2.5 熒光光譜的測(cè)定 室溫下通過熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品的熒光光譜[14]。將樣品用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋，以獲得0.05 mg/mL 的樣品溶液，然后在波長(zhǎng)295 nm 處激發(fā)WPI 并記錄其在280～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜，其中激發(fā)和發(fā)射狹縫的長(zhǎng)度均為5 nm。

1.2.6 松仁油Pickering 乳液的制備 取1.2.1 制備所得的顆粒500 mg 分散于10 mL 去離子水中，將顆粒分散液和松仁油油相混合（50 wt%顆粒分散液，50 wt%松仁油）后，利用高速剪切乳化分散機(jī)（11 000 r/min）乳化3 min。向樣品中加入0.2 g/L NaN3以防止微生物生長(zhǎng)。

1.2.7 界面蛋白含量的測(cè)定 取適量乳液進(jìn)行離心（10 000×g，30 min），收集下層清液（水相），用0.22 μm 濾膜進(jìn)行過濾。BCA 試劑盒測(cè)定濾液及乳液中的蛋白質(zhì)含量代入公式（1）：

式中，Ctotal——原乳液中蛋白質(zhì)含量（mg）；Cserum——離心分離后濾液中的蛋白質(zhì)含量（mg）；B——用于BCA 試劑盒檢測(cè)體系的溶液體積（m3）。

1.2.8 粒徑和Zeta 電位的測(cè)定 使用激光納米粒度儀測(cè)量乳液的粒徑和電位，為避免多重散射效應(yīng)，測(cè)量分析前將樣品溶液稀釋200 倍。

1.2.9 流變學(xué)行為的測(cè)定 靜態(tài)流變特性：向具有1.0 mm 間隙的厚度50 mm 的平行板的流變儀上添加樣品，剪切速率范圍為0～1 000 s-1，于20 ℃下測(cè)定各樣品的表觀黏度，對(duì)所得流變特性曲線進(jìn)行擬合。

動(dòng)態(tài)流變特性：在線性黏彈區(qū)域內(nèi)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行頻率掃描，其中固定振蕩應(yīng)變?yōu)?.1%，振蕩頻率范圍為0.1～100 rad/s，測(cè)定樣品的貯能模量G′和損耗模量G′′。

1.2.10 乳析指數(shù)的測(cè)定 取新鮮的乳液于透明玻璃瓶中，室溫下存放14 d，定期測(cè)量乳液的高度（Ht）與分層后下層清液的高度（Hq），代入公式（2）進(jìn)行計(jì)算：

式中，Hq——乳液的高度（cm）；Ht——乳清層的高度（cm）。

1.2.11 初級(jí)氧化產(chǎn)物的測(cè)定 根據(jù)Shao 等[15]的方法測(cè)定POV 值，根據(jù)氫過氧化物標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算乳液樣品中脂質(zhì)氫過氧化物值。

1.2.12 次級(jí)氧化產(chǎn)物的測(cè)定 根據(jù)Shen 等[16]的方法測(cè)定TBARS 值，根據(jù)1，1，3，3-四乙氧基丙烷的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乳液樣品中脂質(zhì)過氧化物值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)做3 次重復(fù)，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用Origin Pro 9.5 軟件分析數(shù)據(jù)。運(yùn)用SPSS 25.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過單因素方差分析確定統(tǒng)計(jì)差異（ANOVA），P ＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類化合物對(duì)WPI 理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)變化的影響

2.1.1 酚類化合物對(duì)WPI 游離巰基和總巰基含量的影響 巰基是蛋白質(zhì)分子中存在的具有較高化學(xué)活性的組分，對(duì)蛋白質(zhì)的功能起著重要作用。酚類化合物很容易被氧化成醌，再通過Michael 加成與巰基反應(yīng)生成巰基-醌的加成物，酚和巰基發(fā)生的共價(jià)交聯(lián)降低了巰基含量[17]，巰基基團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)有很大影響。由表1 可知，酚類化合物顯著降低了WPI 的游離巰基和總巰基含量（P＜0.05），WGA 與WVA 的巰基含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照WP 的游離巰基含量為（2.319±0.068）μmol/g；而試驗(yàn)組中，隨著酚類化合物添加量的增加，WGA 的游離巰基含量分別為（1.672±0.238），（1.543±0.284）μmol/g 和（1.878±0.427）μmol/g，WVA 的游離巰基含量分別為（1.351±0.113），（1.105±0.106）μmol/g 和（1.042±0.046）μmol/g。由于綠原酸和EGCG 之間共價(jià)交聯(lián)生成巰基-醌加成產(chǎn)物，可顯著降低肌原纖維中的巰基含量[18]，該結(jié)果與本研究一致。巰基含量降低還可能是因?yàn)閹€基之間生成二硫鍵。疏水基團(tuán)的暴露加速了蛋白質(zhì)的疏水性聚集，使其結(jié)構(gòu)更加緊湊[19]。

表1 不同酚類化合物添加量對(duì)WPI 總巰基和游離巰基含量的影響Table 1 The influence of different phenolic compound concentration on the total sulfhydryl and free sulfhydryl content of WPI

總巰基含量包括暴露在蛋白質(zhì)表面以及埋在蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)分子的所有巰基含量。表1 中，當(dāng)酚類化合物添加量增加時(shí)，WGA 的總巰基含量分別為（3.209±0.154），（2.529±0.280）μmol/g 和（2.600±0.219）μmol/g，WVA 的總巰基含量分別為（4.013±0.084），（3.974±0.193）μmol/g 和（3.851±0.156）μmol/g，與對(duì)照（6.291±0.290）μmol/g 相比，總巰基含量呈急劇下降的趨勢(shì)，分析原因?yàn)楣矁r(jià)鍵可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)分子展開，包埋于蛋白質(zhì)分子中的巰基團(tuán)暴露出來。而當(dāng)酚類化合物添加量增加時(shí)，這些暴露的巰基會(huì)氧化鄰近蛋白質(zhì)鏈上的2 個(gè)半胱氨酸殘基，從而降低蛋白質(zhì)的巰基含量[20]。

總體而言，巰基含量隨著酚類化合物添加量的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)，表明酚類化合物對(duì)WPI 的結(jié)構(gòu)有顯著影響，使其三級(jí)結(jié)構(gòu)的解折疊程度發(fā)生改變。隨著酚類化合物添加量的增加，蛋白質(zhì)分子越裸露，共價(jià)交聯(lián)程度越大；當(dāng)酚類物質(zhì)達(dá)到一定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)構(gòu)象變化趨向穩(wěn)定。

2.1.2 酚類化合物對(duì)WPI 表面疏水性的影響 表面疏水性用于表征表面蛋白疏水基團(tuán)，它反映了蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能的變化[21]，對(duì)蛋白質(zhì)的整體功能特性的影響發(fā)揮著主要作用，是表征與外界極性水環(huán)境相連的蛋白質(zhì)的表面疏水性基團(tuán)數(shù)量的一個(gè)重要標(biāo)志[22]。由圖1 可知，WGA 與WVA 的表面疏水性之間存在顯著差異（P＜0.05），這可能與表面疏水性殘基的暴露程度，蛋白質(zhì)的氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)展開程度等因素密切相關(guān)[23]。當(dāng)酚類化合物添加量增加時(shí)，表面疏水性顯著增加（P＜0.05），酚類化合物添加量為7.5 g/L 時(shí)，表面疏水性分別達(dá)到最大值。由于酚類化合物與蛋白發(fā)生相互作用，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，使其內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露在表面，因此表面疏水性增加[24]。隨著體系中酚類化合物添加量的增加，表面疏水性也發(fā)生顯著變化（P＜0.05），蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化趨于穩(wěn)定。由此，WPI 的表面疏水性指數(shù)為218.74；WGA 的表面疏水性指數(shù)最高可達(dá)532.47，而WVA 的表面疏水性指數(shù)最高則為468.05，表明發(fā)生共價(jià)反應(yīng)后的WGA 分子表面有更多的疏水基團(tuán)，分子結(jié)構(gòu)被拉伸的程度更大，該結(jié)果與巰基含量的測(cè)定結(jié)果一致，原因可能是與VA 相比，GA含有的羥基數(shù)量較多（3 個(gè)），暴露了較多疏水性氨基酸，使表面疏水性更強(qiáng)。

圖1 酚類化合物添加量對(duì)WPI 表面疏水性的影響Fig.1 The effect of phenolic compound addition on the surface hydrophobicity of WPI

2.1.3 酚類化合物對(duì)WPI 的熒光光譜的影響 一般可由波長(zhǎng)約340 nm 處的蛋白質(zhì)的熒光來反映色氨酸殘基的變化，而發(fā)射強(qiáng)度之差則反應(yīng)色氨酸殘基周邊環(huán)境的改變，而最大發(fā)射強(qiáng)度（λmax）的位移量則能反映出色氨酸分子及蛋白疏水空穴的極性變化[25]。色氨酸殘基的吲哚基團(tuán)被掩埋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中時(shí)，發(fā)生λmax藍(lán)移，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開時(shí)，發(fā)生紅移[26]。隨著酚類化合物添加量的增加，顆粒的熒光強(qiáng)度均顯著下降，證明WGA 與WVA均發(fā)生猝滅，在堿處理?xiàng)l件下，WPI 與2 種酚類化合物之間均發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)。圖2 中WPI 的最大發(fā)射峰出現(xiàn)在波長(zhǎng)360.00 nm 左右處，WGA 和WVA 最大發(fā)射峰均紅移到波長(zhǎng)361.07 nm 處。然而，隨著酚類添加量的增加，熒光強(qiáng)度隨之下降，其中WGA 的熒光強(qiáng)度猝滅率分別為91.05%，89.98%，94.02%，而WVA 的熒光強(qiáng)度猝滅率分別為20.12%，27.49%，31.19%。熒光強(qiáng)度的降低也可以證明羥基苯甲酸類化合物對(duì)于蛋白質(zhì)具有熒光猝滅的作用，Yue 等[27]也得出了同樣的結(jié)論。這是由于發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，酚類物質(zhì)被氧化成醌，從而與WPI 中的氨基發(fā)生親核反應(yīng)。由于分子質(zhì)量的增大，醌主要結(jié)合在蛋白質(zhì)表面位點(diǎn)處，因此發(fā)生了熒光猝滅。

圖2 酚類化合物共價(jià)復(fù)合處理對(duì)WPI 內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.2 Effect of covalent compound treatment of phenolic compounds on intrinsic fluorescence spectra of WPI

2.1.4 酚類化合物對(duì)WPI 紅外光譜的影響 4000～500 cm-1范圍內(nèi)的WGA 與WVA 顆粒的FTIR 紅外譜圖，如圖3 所示。所有樣品的光譜都包含4 個(gè)主峰，且都在酰胺Ⅰ帶都具有最強(qiáng)的吸收強(qiáng)度。WPI 與酚類物質(zhì)共價(jià)交聯(lián)后，酰胺I 帶的峰位置發(fā)生變化，表明WPI 的構(gòu)象即三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[28]。WGA 和WVA 酚羥基的O-H 振動(dòng)具體表現(xiàn)為在3 365～3 368 cm-1范圍內(nèi)均有廣泛的吸收峰，-C-O 和C-O-C 振動(dòng)表現(xiàn)為1 093 cm-1和1 039 cm-1的吸收峰。譜帶向更低波數(shù)位移，變化越明顯，表明共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)越強(qiáng)烈[29]。與酚類化合物共價(jià)交聯(lián)后，隨酚類化合物添加量的增加，WPI 的酰胺I 帶向低波數(shù)移動(dòng)的幅度越大；復(fù)合顆粒酰胺I帶面積和峰位置均發(fā)生了變化，表明酚基接枝到蛋白質(zhì)上，與蛋白質(zhì)中某些基團(tuán)發(fā)生了共價(jià)結(jié)合。與WGA 類似的是，WVA 的-OH 吸收峰變寬，且向低波數(shù)移動(dòng)，表明WPI 與VA 同樣通過共價(jià)交聯(lián)結(jié)合形成復(fù)合物。

圖3 酚類化合物共價(jià)復(fù)合處理對(duì)WPI 傅里葉紅外光譜的影響Fig.3 Effect of covalent compound treatment of particles on fourier infrared spectroscopy of WPI

2.2 酚類化合物對(duì)松仁油Pickering 乳液性質(zhì)的影響

2.2.1 酚類化合物對(duì)Pickering 乳液粒徑分布和Zeta 電位的影響 如圖4 所示，WGAP、WVAP 和WPP 的粒徑分布均呈單峰分布，與對(duì)照WPP 相比，WGAP 粒度分布的主峰向小粒子尺寸方向移動(dòng)，主峰位置集中在204.1～276.4 nm 之間；與之類似的是，WVAP 的主峰也逐漸向小粒子尺寸方向移動(dòng)，主峰位置集中于217.7～256.2 nm 之間；而WPP 的主峰位置則集中于475.5 nm 處。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因?yàn)镚A 和VA 提供了反應(yīng)性羥基和疏水基團(tuán)，與蛋白結(jié)合后，蛋白質(zhì)相互排斥展開，使乳液平均粒徑變小。該結(jié)果與Li 等[30]的研究結(jié)果一致。酚類化合物所能提供羥基基團(tuán)數(shù)量的不同可使乳液粒徑之間產(chǎn)生顯著差異，具體表現(xiàn)為，羥基基團(tuán)數(shù)量多的酚類物質(zhì)更容易與蛋白質(zhì)結(jié)合[31]。對(duì)于反映乳液平均粒徑的d4，3，WGAP、WVAP 和WPP 之間也存在顯著差異。當(dāng)酚類化合物添加量為7.5 g/L 時(shí)，平均粒徑最小，WGAP 和WVAP 的平均粒徑分別為204.1 nm 和217.7 nm，GA 添加量為5.0 g/L 時(shí)，WGAP 的d4，3最大，為276.4 nm；當(dāng)VA 添加量為10.0 g/L 時(shí)，WVAP 的d4，3達(dá)到最大值（256.2 nm），表明添加適度劑量的酚類化物形成的乳液液滴d4，3較小。原因可能為酚類化合物添加量增加，WPI 容易吸附在表面，造成復(fù)合物之間產(chǎn)生空間位阻，從而阻止乳液液滴之間發(fā)生相互作用，有利于改善穩(wěn)定性[32]。

圖4 不同添加量酚類化合物對(duì)WGPP、WVPP 和WPP 乳液粒徑分布的影響Fig.4 The effect of different concentrations of phenolic compounds on the particle size distribution of WGPP，WVPP and WPP emulsions

Zeta 電位是判斷分散體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，在一定程度上能夠反映乳液液滴之間相互作用的強(qiáng)度，其絕對(duì)值越大，液滴之間的排斥越大，從而避免乳液液滴聚結(jié)，體系因此更加穩(wěn)定[33]。不同酚類化合物添加量制備乳液結(jié)果如圖5 所示。隨著酚類化合物添加量的增加，Zeta 電位的絕對(duì)值呈先增加后減小的趨勢(shì)。酚類化合物添加量為7.5 g/L 時(shí)，絕對(duì)值最大。綜上所述，酚類化合物添加量為7.5 g/L 時(shí)，此時(shí)粒子間的靜電斥力最大，分子不易聚集，穩(wěn)定性最高，該結(jié)果與粒徑分布結(jié)果一致。酚類化合物添加量為7.5 g/L 時(shí)，電位絕對(duì)值分別為40.33 mV（WGAP）和20.14 mV（WVAP），此時(shí)電位絕對(duì)值達(dá)到最大值，產(chǎn)生的靜電斥力大[34]，意味著乳液穩(wěn)定性最好。在該制備條件下，更多顆粒吸附在液滴表面，電位絕對(duì)值增加，油滴表面電荷和靜電斥力也隨之增加，因此阻止了液滴聚集情況的發(fā)生，提高了體系的穩(wěn)定性。分析WGAP 與WVAP 電位值存在差異的原因，可能為沒食子酸水溶性較好，沒食子酸在乳液微環(huán)境中的分布對(duì)油滴表面電荷產(chǎn)生了影響，進(jìn)而改變?nèi)橐旱摩?電勢(shì)[35]。

圖5 酚類化合物添加量對(duì)Pickering 乳液Zeta 電位的影響Fig.5 The effect of the addition of phenolic compounds added on the Zeta potential of Pickering emulsion

2.2.2 酚類化合物對(duì)Pickering 乳液界面蛋白含量的影響 圖6 可知，所有乳液的界面蛋白含量均在1.5～4 mg/m2之間，WGAP 和WVAP 的界面蛋白含量最大分別可達(dá)3.22 mg/m2和2.51 mg/m2。與WPP 相比，界面蛋白含量提高了57.84%和18.82%（P ＜0.05）。酚類化合物添加量越大，乳液的界面蛋白含量也越高。在界面面積相同的情況下，界面蛋白含量越高，油水界面可吸附蛋白質(zhì)的量就越多[36]。WGAP 和WVAP 的界面蛋白含量顯著高于WPP（P＜0.05），分析原因?yàn)榻缑娴鞍缀康淖兓山缑婷娣e和蛋白吸附率兩種因素決定。酚類化合物共價(jià)結(jié)合在乳清分離蛋白上，由于疏水性的增加，油-水界面吸附更多蛋白質(zhì)，從而在液滴表面形成較厚的界面膜，該界面膜可防止液滴之間發(fā)生聚集，有助于保持乳狀液的穩(wěn)定性。Ding 等[37]研究結(jié)果表明，在蛋白含量不變的條件下，粒徑越小，界面空隙越大，可吸附的蛋白含量越高，乳液越穩(wěn)定。界面蛋白含量的差異與WGA和WVA 分子的聚集狀態(tài)有關(guān)，根據(jù)疏水性結(jié)果可知，WGA 分子疏水性更強(qiáng)，因此蛋白分子可吸附程度更大，有較多的蛋白聚集體吸附在油-水界面上，導(dǎo)致其界面蛋白含量較高。

2.2.3 酚類化合物對(duì)Pickering 乳液流變特性的影響 液滴間的聚集程度及穩(wěn)定性與乳液的表觀黏度關(guān)聯(lián)性很大[38]。圖7 顯示了在剪切掃描中測(cè)定的不同顆粒所穩(wěn)定乳液的流動(dòng)特性。在0.1～1 000 s-1的范圍內(nèi)，隨剪切速率增加，乳液的表觀黏度逐漸減小，該變化趨勢(shì)表明Pickering 乳液均為剪切稀化的非牛頓流體，乳液內(nèi)部單元的取向與剪切方向一致或者平行，外部的剪切應(yīng)力拉伸了乳液中的分子，因而不同分子之間發(fā)生解纏作用，降低了乳狀液體系的流動(dòng)阻力，具體表現(xiàn)為Pickering 乳液的流變學(xué)行為呈現(xiàn)剪切變稀的特性。根據(jù)Stokes 規(guī)律可知，顆粒的表觀黏度越大，液滴越不容易發(fā)生沉降或上浮現(xiàn)象，因此乳液的物理穩(wěn)定性也因此提高[39]。當(dāng)酚類化合物添加量增加時(shí)，乳液的表觀黏度在整個(gè)剪切速率變化范圍內(nèi)也會(huì)增加。不同種類的酚類化合物穩(wěn)定的Pickering 乳液的表觀黏度存在差異，具體表現(xiàn)為WVAP 的表觀黏度大于WGAP。

圖7 酚類化合物對(duì)Pickering 乳液的表觀黏度的影響Fig.7 Effects of phenolic compounds on apparent viscosity of pickering emulsion

由表2 可知，由酚類化合物穩(wěn)定的乳液的擬合精度都達(dá)到0.99 以上，說明其是典型的屈服-假塑性流體且曲線與模擬度良好。隨酚類化合物添加量的增加，K 逐漸降低，n 逐漸靠近1，乳液的流體性質(zhì)變強(qiáng)。以上結(jié)果可以看出，屈服應(yīng)力值隨著酚類添加量的增加而增大。這表明酚類化合物添加量越大，乳液的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越強(qiáng)，結(jié)構(gòu)就越堅(jiān)固，抗應(yīng)變能力就越強(qiáng)。因此，屈服應(yīng)力增加可能為蛋白顆粒間靜電斥力的降低和空間位阻的增加等多種原因綜合引起。當(dāng)VA 添加量增至10.0 g/L時(shí)，乳液的表觀黏度最大，分析其原因?yàn)榱髯兲匦耘c乳液穩(wěn)定性相關(guān)。

表2 酚類化合物添加量對(duì)乳液的流動(dòng)曲線特征指數(shù)的影響（Power-Law 模型）Table 2 Effect of phenolic compound addition on flow curve characteristic index of lotion（Power-Law model）

酚類化合物添加量對(duì)乳液儲(chǔ)能模量（G'）及損耗模量（G″）的影響見圖8，掃描一定頻率（0.1 Pa）可知，所有樣品的儲(chǔ)能模量（G′）始終大于損耗模量（G″），表明在此狀態(tài)下的乳液流變學(xué)性質(zhì)均以彈性為主。儲(chǔ)能模量越高，乳液在特定外力作用下發(fā)生形變的可能性就越低?？赡芤?yàn)樘砑恿朔宇惢衔?，所以試?yàn)組的黏彈性模量顯著高于對(duì)照組，酚類化合物與WPI 之間形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使乳液彈性模量增加。酚類化合物添加量增加，乳液的G′和G″均隨角速度的增加而降低。當(dāng)酚類化合物添加量為7.5 g/L 時(shí)，G′和G″顯著大于酚類化合物添加量為5.0 g/L 及10.0 g/L 條件下的乳液，這表示添加7.5 g/L 的酚類化合物時(shí)，乳液內(nèi)部的彈性更大，極有可能是酚類化合物可促進(jìn)大多數(shù)蛋白分子展開，提高了WPI 與酚類化合物之間的共價(jià)結(jié)合程度，從而使生成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不可逆。酚類化合物添加量增加，則蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開，分子之間重新排列，更加有利于共價(jià)反應(yīng)的發(fā)生。以上流變性質(zhì)表明，引入不同酚類化合物的乳液存在差異，其中引入GA 的Pickering 乳液可獲得更好的流變學(xué)特性，這是因?yàn)椴煌w粒所穩(wěn)定的乳液液滴之間有不同的共價(jià)結(jié)合程度，致使產(chǎn)生的流變學(xué)特性也存在差異。

圖8 Pickering 乳液的儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G″）隨角速度變化的關(guān)系Fig.8 The relationship between the storage modulus（G'）and loss modulus（G″）of Pickering emulsion with angular velocity

圖9 酚類化合物添加量對(duì)Pickering 乳液乳析指數(shù)的影響Fig.9 The influence of the addition of phenolic compounds on the emulsification index of Pickering emulsion

2.2.4 酚類化合物對(duì)Pickering 乳液乳析指數(shù)的影響 乳析指數(shù)是衡量乳液物理穩(wěn)定性的重要參數(shù)，乳析指數(shù)越大，液滴移動(dòng)越快，液滴越易聚集，乳液物理穩(wěn)定性越差。從圖10 可以看出，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，乳液的乳析指數(shù)也隨之增加，貯藏14 d 時(shí)，試驗(yàn)組的乳析指數(shù)均小于50%，其中WPP的乳析指數(shù)顯著高于WGAP 和WVAP 的乳析指數(shù)（P＜0.05），并且乳析指數(shù)先減小后增加。該結(jié)果表明共價(jià)復(fù)合顆粒所穩(wěn)定乳液的液滴間斥力較強(qiáng)，液滴可以有規(guī)則地分布并緊密堆積，乳脂層更厚，因此改善了乳液的分層穩(wěn)定性[40]。這是因?yàn)楫?dāng)酚類化合物添加量增加時(shí)，乳液的表觀黏度也隨之增加，液滴的移動(dòng)速度變慢，從而提高了分層穩(wěn)定性。

圖10 酚類化合物添加量對(duì)松仁油Pickering 乳液一級(jí)氧化產(chǎn)物的影響Fig.10 Effects of phenolic compounds addition on primary oxidation products of pine nut oil Pickering emulsion

2.2.5 酚類化合物對(duì)Pickering 乳液脂質(zhì)氧化程度的影響 如圖10 所示，WPP 的POV 值高于引入酚類化合物Pickering 乳液的POV 值，表明在乳液中引入酚類化合物后，氫過氧化物的形成受到了很好的抑制。Staszewski 等[41]使用綠茶多酚-β-乳球蛋白納米復(fù)合物制備了魚油乳液，氫過氧化氫在整個(gè)貯存過程中保持相對(duì)較低的生成量，這表明酚類化合物明顯改善了乳液的氧化穩(wěn)定性。Pan 等[7]也發(fā)現(xiàn)多酚交聯(lián)能顯著降低乳清蛋白乳液的POV 和TBARS 值，提高乳液的氧化穩(wěn)定性。WPP 在貯藏第3 天開始POV 值有明顯的增加趨勢(shì)，而對(duì)于引入酚類化合物的乳液，整個(gè)一級(jí)氧化過程均表現(xiàn)得較為平緩，因此可知WPI-酚類化合物顆粒穩(wěn)定的乳液在一級(jí)氧化過程中更為穩(wěn)定。在貯藏的前2 d，較低質(zhì)量濃度酚類化合物（5.0，7.5 g/L）能夠促進(jìn)過氧化物的生成，相反較高質(zhì)量濃度（10.0 g/L）的酚類化合物表現(xiàn)出抑制油脂體過氧化物生成；而貯藏4 d 后，酚類化合物的抑制能力與劑量呈正相關(guān)。作為來自天然植物的天然無毒抗氧化劑，酚類化合物含有多個(gè)酚羥基，因此具有很強(qiáng)的提供氫原子的能力，在脂質(zhì)氧化過程中，脂肪酸自由基可以與之結(jié)合，自由基成為更穩(wěn)定的惰性化合物，阻止脂質(zhì)氧化連鎖反應(yīng)，從而起到抑制脂質(zhì)自動(dòng)氧化的作用[42]。2 種酚類化合物對(duì)乳液中過氧化物形成的不同影響，可能是由于它們吸收自由基的能力[43]和它們不同的氫原子釋放率導(dǎo)致[44]。

如圖11 所示，乳液二級(jí)氧化物TBARS 值隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，趨勢(shì)與一級(jí)氧化產(chǎn)物大致相同。WPP 的TBARS 值在第4 天后陡然增加，而WPI-酚類化合物穩(wěn)定的Pickering 乳液TBARS 值增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，而到達(dá)第14 天時(shí)，測(cè)得的TBARS 值分別達(dá)到最高值，WGAP 次級(jí)氧化物的生成量始終小于WVAP。在貯藏的14 d 內(nèi)，乳液的TBARS 值均呈上升趨勢(shì)。兩種酚類物質(zhì)均表現(xiàn)出抑制油脂體次級(jí)氧化產(chǎn)物生成的能力，這歸因于酚類抗氧化物可以將氫離子提供給過氧化自由基，從而避免進(jìn)一步降解。以上結(jié)論得出，酚類化合物的加入對(duì)Pickering 乳液中次級(jí)氧化物的生成起到了很好地抑制作用。本研究中，改善Pickering 乳液的氧化穩(wěn)定性與酚類化合物結(jié)構(gòu)中的酚羥基提供強(qiáng)大的氫原子儲(chǔ)備能力有關(guān)[42]，在油脂氧化過程中，能與油脂上的某些基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，生成不易氧化的物質(zhì)，使之氧化過程減緩。Wan 等[45]研究表明，脂質(zhì)過氧化物和揮發(fā)性己醛生成量顯著減少，大豆分離蛋白-白藜蘆醇復(fù)合物乳狀液的的氧化穩(wěn)定性得到改善。

圖11 酚類化合物添加量對(duì)松仁油Pickering 乳液二級(jí)氧化產(chǎn)物的影響Fig.11 Effects of phenolic compounds addition on secondary oxidation products of pine nut oil Pickering emulsion

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，沒食子酸和香草酸2 種酚類化合物對(duì)WPI 蛋白顆粒表面疏水性均有顯著影響，與酚類化合物共價(jià)結(jié)合后，WPI 蛋白顆粒游離巰基和總巰基含量降低；2 種酚類物質(zhì)均能不同程度提高乳液的理化性能和氧化穩(wěn)定性，高劑量的2 種酚類化合物均可誘導(dǎo)WPI 巰基和表面疏水性發(fā)生變化，對(duì)乳液特性產(chǎn)生影響顯著，并且表面疏水性的變化對(duì)乳液特性的改變起主導(dǎo)作用。WGP 和WVP 的最大發(fā)射峰均紅移到361.07 nm 處，WGP 的熒光強(qiáng)度猝滅率分別為91.05%，89.98%和94.02%，而WVP 的熒光強(qiáng)度猝滅率分別為20.12%，27.49%和31.19%。與對(duì)照WPP 相比，WGPP 粒徑分布的主峰位置集中在204.1～276.4 nm 之間；WVPP 粒徑分布的主峰位置則集中在217.7～256.2 nm 之間。一定劑量范圍內(nèi)，較高添加量的酚類可以降低Pickering 乳液粒徑，提高流變性能并且延緩油脂體的氧化，其中沒食子酸的作用較為顯著。因此，在開發(fā)天然乳化劑或乳液相關(guān)產(chǎn)品時(shí)，可以考慮通過添加相對(duì)高劑量的沒食子酸，以提高產(chǎn)品的理化穩(wěn)定性，抑制脂質(zhì)氧化。本研究可為食品研究人員開發(fā)出更健康的天然松仁油食品或?yàn)橄嚓P(guān)產(chǎn)品提供參考。