植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與氮肥對(duì)鹽脅迫下水稻幼苗生理特性的影響

王亞新 馮乃杰， 趙黎明， 鄭殿峰， 沈雪峰， 劉美玲 杜有為

（1廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2國(guó)家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心華南中心，廣東 湛江 524088；3廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108）

水稻（OryzasativaL.）是全世界重要的糧食作物之一。近年來(lái)，氣候變化導(dǎo)致海平面上升，從而導(dǎo)致土壤鹽漬化，嚴(yán)重威脅水稻生長(zhǎng)發(fā)育［1］。土壤鹽漬化影響全球20%以上的耕地，其中灌溉區(qū)占其一半，這一比例在未來(lái)仍將繼續(xù)增加［2］。中國(guó)有1 億公頃鹽堿地和234萬(wàn)公頃海灘，預(yù)計(jì)到2050年，50%以上的可耕地將鹽堿化［3］。鹽脅迫是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要制約因素之一，它會(huì)阻礙作物生長(zhǎng)和發(fā)育，降低作物產(chǎn)量，主要表現(xiàn)在形態(tài)和生理生化方面。鹽脅迫對(duì)植物最直觀的影響是抑制地上部和根系生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致植物生物量減少［4］。因此，提高作物耐鹽性不僅可以提高鹽堿地利用率，還是保護(hù)全球糧食安全的重要保障。相關(guān)研究表明，鹽脅迫抑制水稻的光合作用和生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致生物量減少，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降［5-6］。因此，提高水稻耐鹽性是增加水稻產(chǎn)量的重要途經(jīng)之一。

化學(xué)調(diào)控作為預(yù)防或緩解非生物脅迫的重要措施之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。相關(guān)研究表明，葉面噴施5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid，5-ALA）具有克服不同作物應(yīng)激環(huán)境有害影響的作用［7］，能夠通過(guò)增強(qiáng)番茄（SolanumtuberosumL.）幼苗抗氧化系統(tǒng)和在冷脅迫下清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和光合作用［8］，還可以通過(guò)減輕丹參（SalviamiltiorrhizaBunge）的氧化損傷來(lái)增強(qiáng)其耐鹽性等［9］。乙酸二乙基氨基乙酯（2-diethylaminoethyl hexanoate，DTA-6）是一種促進(jìn)性植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（plant growth regulators，PGRs），參與水稻作物的生理代謝反應(yīng)［10-12］。前人研究表明，噴施DTA-6 可以提高決明子（CatsiatoraL.）的耐鹽性［12］和番茄［13］、黑麥（SecalecerealeL.）［14］對(duì)鎘脅迫的抗性，并通過(guò)促進(jìn)鹽脅迫下植物的光合作用來(lái)促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，緩解鹽脅迫［12，15］。氮素作為作物必需營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)水稻的生命活動(dòng)和產(chǎn)量的形成具有重要意義。然而，過(guò)度施肥和施肥不當(dāng)是我國(guó)農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題［16］。有研究表明，施氮可以緩解鹽脅迫，氮肥通過(guò)促進(jìn)氮有機(jī)化合物的積累改善滲透調(diào)節(jié)、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，從而緩解鹽脅迫對(duì)植物的不利影響［17-18］。隨著近年來(lái)農(nóng)田氮肥的過(guò)量施用，對(duì)環(huán)境造成的污染也日益加重。近年來(lái)，利用調(diào)節(jié)劑提高氮素利用率已成為減施增效的有效措施，為解決環(huán)境問(wèn)題提供了新途徑。

目前，關(guān)于氮肥和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)緩解水稻幼苗鹽脅迫影響的對(duì)比研究較少，盡管有研究表明5-ALA、DTA-6 和氮肥在改善植物逆境方面具有積極作用［12，19-20］，但有關(guān)鹽脅迫下5-ALA、DTA-6 和氮肥提高水稻耐鹽性的研究較少，且調(diào)節(jié)劑與氮肥在改善水稻鹽脅迫中的差異效果仍然未知?；诖?，本研究設(shè)置兩個(gè)氮肥處理，在三葉一心期葉面噴施調(diào)節(jié)劑，研究其對(duì)水稻幼苗形態(tài)、膜損傷、抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)的影響，以期為氮肥和調(diào)節(jié)劑在水稻幼苗抗鹽栽培中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021—2022年在廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院日光連棟溫室中進(jìn)行，采用盆栽試驗(yàn)，室內(nèi)溫度白天平均溫度（33±2）℃，夜晚（30±2）℃，濕度控制在80%±5%。供試品種為黃華占，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所選育，深圳隆平金谷種業(yè)有限公司提供。供試肥料分別為尿素、過(guò)磷酸鈣、硫酸鉀。供試調(diào)節(jié)劑為5-ALA（阿拉丁，北京）和DTA-6（鄭州信聯(lián)生化科技有限公司）。試驗(yàn)用土為磚紅土與河沙3∶1混合均勻。土壤理化性質(zhì)為：pH值7.02、有機(jī)質(zhì)3.52 g·kg-1、堿解氮1.26 mg·kg-1、速效磷2.62 mg·kg-1、速效鉀83.39 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)為盆栽試驗(yàn)，每盆3 kg土，試驗(yàn)各處理詳情見表1，即（1）N1（0.1 g N/盆）；（2）N2（0.15 g N/盆）；（3）N1A：N1+40 mg·L-15-氨基乙酰丙酸（5-ALA）；（4）N1D：N1+30 mg·L-1乙酸二乙基氨基乙酯（DTA-6）；（5）N1S：N1+0.3% NaCl；（6）N2S：N2+0.3% NaCl；（7）N1AS：N1+40 mg·L-15-ALA+0.3% NaCl；（8）N1DS：N1+30 mg·L-1DTA-6+0.3% NaCl。

表1 不同處理調(diào)節(jié)劑、NaCl和N化肥養(yǎng)分用量Table 1 Different treatment regulators，NaCl and nitrogen fertilizer nutrient dosages

選擇飽滿完好的水稻種子，3%雙氧水消毒15 min后，用蒸餾水沖洗5次，在30 ℃恒溫箱中于黑暗條件下蒸餾水浸種和催芽各24 h。隨后取露白一致的種子點(diǎn)播于無(wú)孔花盆中，盆的規(guī)格為上口徑20 cm、下口徑15 cm、高18 cm，每盆均勻播種69 粒，株距0.5 cm。于播前1 d 澆肥水，每盆施P2O50.48 g、K2O 0.32 g，氮肥（尿素）播前施用，按表1 施入。正常水分管理到幼苗三葉一心期時(shí)進(jìn)行葉面噴施5-ALA和DTA-6，噴施時(shí)間為天黑后19：00左右，施用劑量分別為40和30 mg·L-1［21］，清水做對(duì)照。調(diào)節(jié)劑處理24 h 后進(jìn)行鹽處理，即按土施加0.3%NaCl（W/W），將9 g鹽溶于1 L清水中緩慢澆入盆中，模擬大田試驗(yàn)保留2 cm 的水層。每天用TR-6D 土壤鹽度計(jì)（山東恒美科技有限公司）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鹽分，維持鹽濃度。每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)10 盆，共計(jì)每處理30 盆，采用完全隨機(jī)擺放設(shè)計(jì)，鹽處理后1、4、7、10、13 d進(jìn)行取樣用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 水稻地上部形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 分取各個(gè)處理水稻幼苗，用水沖洗干凈，從中選取具有普遍代表性幼苗20 株，地上和地下分開，分別用直尺、游標(biāo)卡尺測(cè)量其苗高和莖基寬。地上部和地下部分樣包裝后放入烘箱于105 ℃殺青30 min、80 ℃烘干48 h 至恒重后，稱量地上和地下干物質(zhì)量，根據(jù)以下公式計(jì)算充實(shí)度和壯苗指數(shù)［22］：

1.3.2 膜 損 傷 指 數(shù) 的 測(cè) 定 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）含量參照許向陽(yáng)等［23］的方法采用硫代巴比妥酸法測(cè)定。用0.75 mL 上清酶提取液和1.0 mL 硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）混合測(cè)定。將混合物在沸水浴中加熱30 min，冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心15 min，得到上清液。分別測(cè)定450、532 和600 處的吸光度OD450、OD532、OD600，每個(gè)處理3 次重復(fù)。根據(jù)以下公式計(jì)算葉片中丙二醛含量：

過(guò)氧化氫含量參照J(rèn)essup 等［24］的方法測(cè)定。取0.5 g 葉樣品，加入 5 mL 0.1% 三氯乙酸（trichloroaceticacid，TCA）溶液，在液氮中研磨，并以10 000 r·min-1離心10 min。然后將0.5 mL 上清液加入0.5 mL 的10 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）和1 mL 碘化鉀（potassium iodide，KI）溶液中，并于28 ℃黑暗反應(yīng)1 h，使用GENESYS 180 紫外可見光分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛公司）測(cè)定180 nm處的吸光度。

1.3.3 光合色素含量的測(cè)定 參考Xu 等［25］的方法，并略有改動(dòng)。通過(guò)鉆孔取樣，并在室溫為30～45 ℃的暗室中用乙醇提取24 h，直到葉片完全變白。然后測(cè)定提取液在470、649、665 nm 波長(zhǎng)下的吸光度OD470、OD649、OD665，并根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素a（chlorophyll a，Chl a）、葉綠素b（chlorophyll b，Chl b）、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素（carotenoid，Car）含量。每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.3.4 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 按照Lee 等［26］的方法提取粗酶，稱取0.5 g 水稻鮮葉，用10 mL（pH 值7.8）PBS 均質(zhì)，并在4 ℃下，10 000 r·min-1離心15 min 得到粗酶提取物，每個(gè)處理3 次重復(fù)。用Macadam 等［27］描述的硝基四唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）法計(jì)算超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，根據(jù)Macadam等［27］描述的愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性，根據(jù)Li 等［28］描述的過(guò)氧化氫法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性，根據(jù)Nakano 等［29］描述的方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。根據(jù)Ellman［30］描述的方法測(cè)定還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，參考Bradford［31］的方法測(cè)定可溶性蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS X9軟件進(jìn)行單因素或雙因素方差分析（ANOVA），多重比較采用鄧肯多重檢驗(yàn)（Duncan’s Test），用Origin 2021軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGRs和施氮量對(duì)水稻幼苗形態(tài)的影響

2.1.1 PGRs 和施氮量對(duì)苗高、莖基寬和地上干重的影響 由表2 可知，調(diào)節(jié)因子（Re）主效應(yīng)和鹽濃度×調(diào)節(jié)因子（Sc×Re）互作均顯著或極顯著影響了苗高、莖基寬和地上干重。NaCl 脅迫整體降低了苗高、莖基寬和地上干重，其中NaCl 脅迫后1～13 d，苗高、莖基寬和地上干重表現(xiàn)為，N1S 處理較N1分別下降2.26%～7.92%、4.67%～15.96%和12.21%～25.12%，N2S 處理較N2處理分別下降1.24%～4.78%、2.88%～12.82%和5.69%～19.61%，說(shuō)明鹽脅迫抑制了水稻幼苗生長(zhǎng)。從氮肥角度看，增施氮肥能夠促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，尤其在NaCl 脅迫下，N2S 處理苗高、莖基寬和地上干重分別較N1S 處理提高3.23%～20.76%、7.94%～14.78% 和17.18%～39.30%，這說(shuō)明增施氮肥能夠緩解NaCl 脅迫對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的毒害作用。從PGRs 角度看，在鹽脅迫后1～13 d，N1A 處理苗高和地上干重分別較N1顯著增加6.29%～22.71% 和15.37%～41.02%，N1AS處理苗高、莖基寬和地上干重分別較N1S 處理顯著提高12.61%～27.59%、19.61%～32.91% 和31.08%～78.95%，其次是N1DS 處理也顯著提高了苗高、莖基寬和地上干重，說(shuō)明噴施兩種PGRs 不僅對(duì)幼苗形態(tài)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，還能夠緩解鹽脅迫帶來(lái)的傷害。在NaCl 脅迫4 d 時(shí)，N1AS 和N1DS 處理各指標(biāo)較N2S 處理增幅較大，苗高分別顯著增加20.00%和24.00%、莖基寬分別顯著增加19.43%和18.40%、地上干重分別顯著增加36.82%和29.38%。兩種PGRs 在促進(jìn)水稻幼苗生長(zhǎng)，特別是改善鹽脅迫對(duì)水稻的損傷中均能達(dá)到增施定量氮肥效果。

表2 PGRs和施氮量對(duì)NaCl脅迫下水稻幼苗的影響Table 2 Effects of PGRs and nitrogen application on rice seedlings under NaCl stress

2.1.2 PGRs和施氮量對(duì)水稻幼苗充實(shí)度和壯苗指數(shù)的影響 由圖1 可知，NaCl脅迫后1～13 d，充實(shí)度和壯苗指數(shù)表現(xiàn)為，N1S處理較N1分別下降7.35%～22.97%和10.53%～23.38%；N2S 處理較N2處理分別下降4.50%～18.20%和7.71%～12.14%。說(shuō)明NaCl脅迫抑制了水稻生長(zhǎng)。從氮肥角度看，增施氮肥能夠促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，尤其在NaCl脅迫下，N2S處理充實(shí)度和壯苗指數(shù)較N1S 處理整體分別顯著提高8.23%～25.76%和7.84%～44.71%，這說(shuō)明增施氮肥能夠緩解水稻NaCl脅迫。從PGRs角度看，在NaCl脅迫后4～13 d，N1A處理充實(shí)度和壯苗指數(shù)分別較N1處理顯著提高10.77%～17.57%和29.17%～69.31%，N1AS、N1DS 處理充實(shí)度和壯苗指數(shù)分別較N1S 處理提高10.65%～40.26%和9.80%～66.47%、15.04%～33.98%和41.18%～75.23%，說(shuō)明噴施兩種PGRs 不僅對(duì)幼苗形態(tài)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，還能夠緩解NaCl 脅迫帶來(lái)的傷害。從綜合角度看，在NaCl脅迫13 d 時(shí)，N1AS 和N1DS 處理壯苗指數(shù)較N2S 處理增幅較大，分別增加43.33%和36.93%。說(shuō)明兩種PGRs 改善NaCl脅迫下水稻生長(zhǎng)效果均優(yōu)于增施氮肥效果，以5-ALA效果最佳。

圖1 PGRs和施氮量對(duì)水稻幼苗充實(shí)度和壯苗指數(shù)的影響Fig.1 Effects of PGRs and nitrogen application on filling degree and seedling index of rice seedlings

2.2 外源5-ALA、DTA-6 和氮肥對(duì)水稻幼苗光合色素含量的影響

由表3 可知，Sc、Re 主效應(yīng)和Sc×Re 互作均極顯著影響了水稻葉片葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量（P＜0.01）。首先，NaCl 脅迫影響幼苗的光合色素合成。NaCl 處理1～13 d，與N1相比，N1S 處理水稻葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量分別下降1.25%～25.50%、9.45%～27.29%、3.86%～25.45% 和5.67%～21.36%；NaCl處理1～10 d，與N2相比，N2S處理的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量分別下降2.70%～26.98%、4.79%～47.91%、9.09%～24.68%和7.48%～17.25%。說(shuō)明NaCl 脅迫抑制了幼苗的光合色素合成。其次，在氮肥利用效率上，NaCl 脅迫處理1～13 d，N2S 處理的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量分別較N1S處理增加4.32%～29.41%、4.67%～34.39%、4.43%～29.34% 和4.01%～26.46%，這說(shuō)明增施氮肥能夠促進(jìn)NaCl 脅迫下葉片光合色素合成。再次，從PGRs調(diào)控效果看，N1A處理的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量分別較N1處理增加4.21%～15.37%、6.05%～89.66%、9.90%～29.97%和1.66%～52.74%；N1AS 處理的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量分別較N1S 處理增加13.06%～35.31%、24.31%～197.63%、15.90%～69.35%和14.82%～44.24%，N1DS 處理葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量則分別增加18.42%～42.45%、2.76%～129.26%、15.11%～60.65%和4.19%～45.41%。說(shuō)明5-ALA 和DTA-6 均能夠緩解NaCl 脅迫對(duì)水稻幼苗葉片光合色素合成的抑制，以葉面噴施5-ALA 調(diào)控效果最佳。N1AS 和N1DS 處理總?cè)~綠素含量較N2S 處理在NaCl 脅迫13 d 時(shí)的增幅較大，分別增加30.93%和24.21%。說(shuō)明兩種PGRs 在減小NaCl 脅迫下光合色素降解速度方面的效果均強(qiáng)于增施定量氮肥，這有利于逆境條件下水稻植株進(jìn)行光合作用，減輕鹽脅迫對(duì)水稻幼苗的傷害。

表3 PGRs和施氮量對(duì)水稻幼苗光合色素含量的影響Table 3 Effects of PGRs and nitrogen application on photosynthetic pigment content of rice seedlings

2.3 PGRs和施氮量對(duì)水稻幼苗膜損傷程度的影響

由表4 可知，Sc、Re 主效應(yīng)和Sc×Re 互作均極顯著影響了水稻葉片MDA 和H2O2含量（P＜0.01）。NaCl 脅迫處理1～13 d，與N1相比，N1S 處理丙二醛和過(guò)氧化氫含量分別顯著增加5.75%～22.11%和7.45%～16.39%；與N2相比，N2S 處理上述指標(biāo)分別顯著增加5.97%～19.54%和3.67%～11.62%，這說(shuō)明NaCl 脅迫使葉片產(chǎn)生過(guò)量活性氧，引起膜脂過(guò)氧化物MDA 的積累，破壞細(xì)胞膜，阻礙水稻生長(zhǎng)。而增施氮肥能夠維持葉片活性氧的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，尤其在NaCl脅迫處理4～13 d，與N1S 處理相比，N2S 處理的丙二醛和過(guò)氧化氫含量分別顯著降低17.93%～36.54%和10.11%～20.95%，這說(shuō)明增施氮肥可以有效提高水稻抗逆性。

表4 PGRs和施氮量對(duì)水稻幼苗膜損傷程度的影響Table 4 Effects of PGRs and nitrogen application on the degree of membrane damage of rice seedlings

外源施加兩種PGRs 對(duì)水稻幼苗有一定的調(diào)控效果。N1A 處理MDA 和過(guò)氧化氫含量整體分別較N1處理顯著降低25.90%～51.61%和4.10%～14.45%，N1AS處理丙二醛和過(guò)氧化氫含量分別較N1S 處理顯著降低37.38%～50.29%和6.43%～20.95%，N1DS 處理的丙二醛和過(guò)氧化氫較N1S 處理分別降低21.75%～46.07%和14.71%～18.14%，這說(shuō)明外源施加兩種PGRs 均可減少葉片ROS積累，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性。在NaCl脅迫10 d時(shí)，N1AS和N1DS處理MDA含量較N2S處理降幅較大，分別降低24.07%和26.08%；H2O2含量則分別降低8.24%和7.43%。說(shuō)明兩種PGRs 在緩解水稻膜損傷方面的效果均優(yōu)于增施定量氮肥。

2.4 PGRs和施氮量對(duì)水稻葉片抗氧化物質(zhì)的影響

2.4.1 對(duì)水稻葉片SOD 活性的影響 由圖2-A 可知，鹽脅迫影響水稻葉片SOD 活性，調(diào)節(jié)因子可以改善鹽脅迫對(duì)水稻的傷害。隨NaCl 脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。NaCl脅迫處理第1、第4 和第7 天，N1S 處理SOD 活性分別較N1處理顯著增加16.32%、12.65%和9.82%；N2S 處理上述指標(biāo)分別較N2增加6.66%、6.63%和3.92%。NaCl 脅迫處理第13 天，與N1、N2處理相比，N1S、N2S 處理SOD 活性分別顯著下降13.72%、6.09%。表明在NaCl 脅迫下，水稻先產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，SOD 活性增加。隨著脅迫時(shí)間的增加，抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，SOD活性降低。從氮肥角度看，增施氮肥可以增加SOD 活性，尤其在NaCl 脅迫處理4～13 d，N2S 處理SOD 活性較N1S 處理顯著增加5.21%～17.18%，表明施加氮肥可以提高NaCl 脅迫下水稻葉片SOD 活性。從PGRs 角度看，N1A 和N1D 處理的SOD 活性分別較N1處理顯著增加7.30%～21.11%和5.49%～28.68%，N1AS 處理和N1DS 處理分別較N1S處理增加15.59%～23.60%和6.24%～20.86%，說(shuō)明兩種PGRs 均可以提高NaCl 脅迫下水稻葉片的SOD 活性。從綜合角度看，N1AS 和N1DS 處理SOD 活性較N2S處理在NaCl 脅迫13 d 時(shí)的增幅較大，分別增加11.01%和8.55%。說(shuō)明兩種PGRs 對(duì)NaCl 脅迫下水稻葉片SOD活性的提升效果優(yōu)于增施定量氮肥。

圖2 PGRs和施氮量對(duì)水稻葉片抗氧化物質(zhì)的影響Fig.2 Effects of PGRs and nitrogen application on antioxidant substances in rice leaves

2.4.2 對(duì)水稻葉片POD 活性的影響 由圖2-B 可知，NaCl 脅迫使葉片POD 活性增加。NaCl 脅迫處理第1～第13 天，N1S 處理POD 活性較N1整體顯著增加6.31%～11.94%；N2S 處理POD 活性較N2增加6.15%～9.39%。表明在NaCl 脅迫下，水稻先產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，POD 活性增加。增施氮肥可以增加POD 活性，尤其在NaCl脅迫處理4～13 d，N2S處理的POD 活性較N1S處理整體顯著增加10.37%～12.25%，這說(shuō)明施加氮肥可以提高NaCl 脅迫下水稻葉片的POD活性。從PGRs調(diào)控效果分析，N1A和N1D處理POD活性較N1處理分別顯著增加20.63%～36.25%和17.04%～35.27%，N1AS和N1DS處理POD 活性較N1S 處理分別增加了4.07%～35.64%和9.81%～32.42%，說(shuō)明兩種PGRs 均可以提高NaCl脅迫下水稻葉片的POD 活性。N1AS 和N1DS 處理POD活性較N2S處理在NaCl脅迫7 d時(shí)的增幅較大，分別增加20.84%和17.97%。說(shuō)明兩種PGRs 提高NaCl 脅迫下水稻葉片POD活性的效果優(yōu)于增施定量氮肥。

2.4.3 對(duì)水稻葉片APX活性的影響 由圖2-C可知，NaCl 脅迫使葉片APX 活性增加。NaCl 脅迫處理第1～第13 天，N1S 處理的APX 活性較N1增加13.35%～32.34%；N2S 處理APX 活性較N2增加10.42%～35.25%。表明在NaCl 脅迫下，水稻先產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，APX 活性增加。從氮肥角度看，增施氮肥可以增加APX 活性，尤其在NaCl 脅迫處理4～13 d，N2S 處理APX活性較N1S 處理顯著增加19.38%～22.85%，這說(shuō)明施加氮肥可以提高NaCl 脅迫下葉片APX 活性。從PGRs角度看，N1A 和N1D 處理的APX 活性分別較N1處理顯著增加32.40%～46.77%和31.07%～54.41%，N1AS 和N1DS處理APX活性分別較N1S 處理顯著增加21.53%～68.06%和19.79%～40.99%，說(shuō)明兩種PGRs 均可以提高NaCl 脅迫下葉片的APX 活性，以5-ALA 效果最佳。從綜合角度看，N1AS和N1DS處理APX 活性較N2S處理在NaCl 脅迫4 d 時(shí)的增幅較大，分別顯著增加41.63%和13.01%。說(shuō)明兩種PGRs 對(duì)NaCl 脅迫下水稻葉片APX活性的提升效果優(yōu)于增施定量氮肥。

2.4.4 對(duì)水稻葉片CAT 活性的影響 由圖2-D 可知，NaCl脅迫下的CAT 活性有所增加。NaCl脅迫處理第1～第10 天，N1S 處理的CAT 活性較N1顯著增加18.44%～36.15%；N2S 處理CAT 活性較N2顯著增加17.33%～33.71%。表明在NaCl脅迫下，水稻產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，CAT 活性增加。氮肥方面，增施氮肥可以增加CAT 活性，尤其在NaCl 脅迫處理1～10 d，N2S 處理CAT活性較N1S處理增加5.70%～29.00%，這說(shuō)明施加氮肥可以提高NaCl脅迫下葉片CAT 活性。PGRs方面，N1A和N1D處理CAT活性較N1處理分別顯著增加16.60%～73.31%和23.72%～55.05%，N1AS和N1DS處理CAT 活性分別較N1S 處理增加0.95%～79.95% 和5.84%～31.94%，說(shuō)明兩種PGRs 均可提高NaCl 脅迫下葉片的APX 活性。整體來(lái)看，N1AS 和N1DS 處理CAT 活性較N2S 處理在NaCl 脅迫10 d 時(shí)的增幅較大，分別增加39.49%和2.27%。說(shuō)明兩種PGRs 對(duì)NaCl 脅迫下水稻葉片CAT活性的提升效果優(yōu)于增施定量氮肥。

2.5 PGRs 和施氮量對(duì)水稻葉片可溶性蛋白和GSH含量的影響

由圖3-A可知，Sc、Re主效應(yīng)和Sc×Re交互作用均對(duì)葉片的可溶性蛋白含量有極顯著影響（P＜0.01）。NaCl 脅迫下，與N1和N2相比，N1S 和N2S 處理的可溶性蛋白含量均呈上升趨勢(shì)。與N1相比，N1S 處理可溶性蛋白含量在NaCl 脅迫處理第1～第13 天增加1.82%～10.11%；在NaCl脅迫處理第1～第13天，N2S處理可溶性蛋白含量較N2增加2.16%～9.76%。表明NaCl 脅迫使水稻產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，可溶性蛋白含量增加。從氮肥角度看，增施氮肥可以增加可溶性蛋白含量，在NaCl脅迫處理1～13 d，N2S 處理較N1S 處理增加2.25%～4.38%。從PGRs角度看，N1A和N1D處理的可溶性蛋白含量較N1處理分別顯著增加5.75%～13.24%和8.74%～10.66%，N1AS 和N1DS 處理可溶性蛋白含量較N1S 處理分別增加4.58%～7.61%和4.68%～8.09%，說(shuō)明兩種PGRs 均能促進(jìn)葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的產(chǎn)生，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

圖3 PGRs和施氮量對(duì)水稻葉片可溶性蛋白含量和GSH含量的影響Fig.3 Effects of PGRs and nitrogen application on soluble protein and GSH content of rice leaves

由圖3-B可知，Sc、Re主效應(yīng)和Sc×Re交互作用均對(duì)葉片的GSH 含量有極顯著影響（P＜0.01）。NaCl 脅迫下，與N1相比，N1S處理GSH 含量呈先增加再降低趨勢(shì)。與N1和N2相比，N1S 和N2S 處理CSH 含量在NaCl脅迫處理第1～第7天分別相應(yīng)增加26.47%～49.63%和18.10%～33.41%；與N1相比，N1S 處理CSH 含量在NaCl脅迫第10～第13天降低18.18%～28.81%。這表明NaCl 脅迫使水稻先產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，抗氧化劑GSH 含量增加，隨著脅迫時(shí)間增加，脅迫程度加劇，GSH 含量降低。從氮肥角度看，增施氮肥可以促進(jìn)GSH 合成，在NaCl脅迫處理1～13 d，N2S處理GSH 含量較N1S處理增加7.77%～58.14%。PGRs 調(diào)控效果顯示，N1A 和N1D處理的GSH 含量較N1處理分別增加16.82%～65.44%和21.22%～76.68%，N1AS 和N1DS 處理較N1S 處理分別增加8.58%～86.42%和8.02%～76.52%，表明兩種PGRs 均能提高水稻抗氧化脅迫能力。從綜合角度分析，N1AS 和N1DS 處理GSH 含量較N2S 處理在NaCl 脅迫13 d 時(shí)的增幅較大，分別提高15.50%和11.62%。說(shuō)明在NaCl 脅迫下，兩種PGRs 對(duì)水稻葉片GSH 合成的促進(jìn)效果均優(yōu)于增施定量氮肥。

2.6 各指標(biāo)間的相關(guān)性

本研究對(duì)17 個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析（圖4），結(jié)果表明，水稻的形態(tài)指標(biāo)（株高、莖基寬、地上干重、充實(shí)度及壯苗指數(shù)）均與葉綠素a、葉綠素b、可溶性蛋白和GSH含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與MDA含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。GSH 含量與SOD、POD、APX 及CAT 活性呈極顯著正相關(guān)，MDA 含量與POD 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。

圖4 所測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between measured indicators

3 討論

3.1 PGRs和施氮量對(duì)水稻幼苗建成的影響

NaCl 脅迫會(huì)抑制植物生長(zhǎng)，降低植物生物量，在甜高粱［32］、小麥［33］和水稻［34-35］等多種作物中均有報(bào)道。本研究表明，隨著NaCl 脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，幼苗形態(tài)指標(biāo)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明NaCl 脅迫抑制幼苗生長(zhǎng)。在NaCl 脅迫下，氮肥和葉面噴施兩種PGRs 均能提高幼苗的耐鹽性，增加莖基寬、壯苗指數(shù)和地上干重，達(dá)到壯苗效果，一定程度上緩解NaCl 脅迫。這與前人研究氮肥、5-ALA 和DTA-6 均可促進(jìn)逆境中植物生長(zhǎng)的結(jié)果一致［36］。總體看來(lái)，在低氮基礎(chǔ)上葉噴兩種GPRs 對(duì)水稻幼苗形態(tài)的影響均達(dá)到在低氮基礎(chǔ)上每盆增施0.05 g純氮效果。

3.2 PGRs和施氮量對(duì)水稻幼苗光合色素含量的影響

NaCl 脅迫會(huì)破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，降低葉綠素含量，導(dǎo)致光合作用減弱，影響植物生命活動(dòng)［32］。光合色素可以穩(wěn)定類囊體膜以減少光氧化損傷［37］。本研究顯示，在NaCl 脅迫下，水稻葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镹aCl脅迫減弱光合色素合成酶活性，損壞葉綠體結(jié)構(gòu)，從而加速光合色素的分解。5-ALA、DTA-6和氮肥均調(diào)節(jié)了NaCl脅迫下光合色素的含量，維持葉片光合作用光反應(yīng)過(guò)程，這與前人有關(guān)5-ALA、DTA-6 和氮肥提高葉綠素含量和光合能量轉(zhuǎn)換效率的結(jié)果相一致［38-40］。本研究表明，NaCl 脅迫下，葉噴兩種調(diào)節(jié)劑處理光合色素含量高于增施定量氮肥，其中5-ALA 效果優(yōu)于DTA-6，這可能是因?yàn)镈TA-6是通過(guò)提高δ-氨基乙酰丙酸（δ-aminolevulinic acid，ALA）向膽色素原（porphobilinogen，PBG）及PBG 向尿卟啉原Ⅲ的轉(zhuǎn)化效率來(lái)促進(jìn)葉綠素合成，而5-ALA 是所有卟啉化合物生物合成的共同前體，是植物體內(nèi)的非蛋白型氨基酸，直接參與葉綠素合成，顯著改善光合色素積累［41］。

3.3 PGRs和施氮量對(duì)水稻活性氧代謝的影響

NaCl 脅迫使植物體內(nèi)活性氧增加，活性氧過(guò)度積累造成氧化損傷［42-43］。MDA 是膜脂過(guò)氧化的重要指標(biāo)，其含量可以反映逆境條件下的膜損傷程度［44］。H2O2在植物代謝和信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，并影響作物生長(zhǎng)發(fā)育［45］。NaCl 脅迫下，抗氧化系統(tǒng)通過(guò)清除植物體內(nèi)過(guò)量ROS 來(lái)維持氧化還原穩(wěn)態(tài)［45-46］。超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶的活性常被作為衡量植物抗逆性的兩大指標(biāo)［47］。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl 脅迫下，鹽處理使MDA和H2O2含量增加，SOD和CAT活性隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減小，POD 和APX 活性則逐漸升高，與前人研究結(jié)果一致［38，48］。這可能是因?yàn)樗居酌缰鲃?dòng)調(diào)節(jié)自身保護(hù)酶活性來(lái)消除活性氧自由基帶來(lái)的傷害。氮肥、5-ALA和DTA-6均能降低NaCl脅迫引起的超氧自由基積累，從而減輕幼苗氧化損傷，維持其正常生長(zhǎng)。這與前人有關(guān)氮肥、5-ALA 和DTA-6 可以緩解逆境引起的膜損傷的結(jié)果一致［40］。其中DTA-6對(duì)膜損傷的緩解效果優(yōu)于5-ALA，5-ALA 提高植物保護(hù)酶活性效果最佳，這可能是由于5-ALA 作為抗氧化酶活性的啟動(dòng)子［49］，刺激抗氧化酶活性增加。

可溶性蛋白含量可以反映植物整體代謝水平，非生物脅迫對(duì)植物蛋白質(zhì)合成影響較大［50］。NaCl 脅迫使MDA 和可溶性蛋白含量增加，說(shuō)明NaCl 脅迫在損傷水稻葉片細(xì)胞膜的同時(shí)，提高了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累以適應(yīng)NaCl 脅迫。原型谷胱甘肽是一種強(qiáng)非酶抗氧化劑［51］，本研究表明，5-ALA、DTA-6 和氮肥均可促進(jìn)水稻葉片GSH 合成。在NaCl 脅迫下，水稻葉片中GSH 含量隨著NaCl 脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低趨勢(shì)，可能是由于GSH 消耗降低了植物細(xì)胞中的ROS［52］。在NaCl 脅迫下，5-ALA、DTA-6 和氮肥均使GSH 含量增加且增幅相似，說(shuō)明在氮肥減施的基礎(chǔ)上葉噴兩種PGRs 清除鹽脅迫下水稻葉片細(xì)胞內(nèi)自由基和過(guò)氧化物能力與增施氮肥相當(dāng)。

相關(guān)性分析表明，POD 活性與MDA 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)NaCl 脅迫下，水稻本身的POD 不能清除過(guò)量的活性氧，需要靠調(diào)節(jié)因子的調(diào)控作用緩解氧化損傷。GSH含量與SOD、POD、APX及CAT活性呈極顯著正相關(guān)，這可能是由于氮肥和PGRs 提高了抗氧化酶活性，調(diào)控GSH 的合成，保護(hù)NaCl 脅迫下水稻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，與前人研究報(bào)道中調(diào)節(jié)劑保護(hù)堿脅迫下煙草細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性的結(jié)果相一致［53］。然而，磚紅壤養(yǎng)分含量很低，本試驗(yàn)用土采用的是貧瘠的磚紅壤與沙3∶1混合，土壤養(yǎng)分含量相對(duì)較低，雖然氮水平N2較N1增幅達(dá)50%，但有關(guān)進(jìn)一步增加施氮量或改為其他養(yǎng)分含量較高的土壤是否有同樣的試驗(yàn)效果還有待進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

NaCl 脅迫抑制水稻生長(zhǎng)和代謝過(guò)程。增施氮肥與葉面噴施5-ALA 和DTA-6 均可改善NaCl 脅迫期間水稻幼苗的形態(tài)變化，提高光合色素含量和抗氧化水平，從而減輕活性氧對(duì)幼苗的損傷。施用調(diào)節(jié)劑（5-ALA和DTA-6）對(duì)減輕幼苗在NaCl脅迫下受到的氧化應(yīng)激損傷效果優(yōu)于增施定量氮肥，以5-ALA 對(duì)NaCl脅迫下幼苗的形態(tài)和抗氧化酶活性改善效果較好，DTA-6 在緩解NaCl 脅迫下水稻幼苗膜損傷方面的效果較好。說(shuō)明在緩解NaCl脅迫對(duì)水稻的損傷中，調(diào)節(jié)劑可以達(dá)到增施定量氮肥的效果，進(jìn)而推測(cè)在低氮基礎(chǔ)上外源施用兩種PGRs可以減少水稻氮肥施用量。