不同光周期對湛江等鞭金藻生長、巖藻黃素含量和光合作用及相關基因表達的影響

宋奕珩 龔一富， 劉博悅 酈露群 王何瑜

（1寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315832；2寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315832）

湛江等鞭金藻（Isochrysiszhanjiangensis）是一種生長繁殖快、容易人工培養(yǎng)的海洋微藻，湛江等鞭金藻可產(chǎn)生一種重要的海洋藥物——巖藻黃素（fucoxanthin，F(xiàn)x），其最大產(chǎn)量可達23.29 mg·L-1［1］。巖藻黃素是硅藻、金藻和褐藻等特有的光合色素，在光合過程中起著關鍵作用［2］。巖藻黃素富含羰基、羥基和羧基等含氧官能團，使其具有更強的抗氧化活性［3］。巖藻黃素還被認為在抗衰老、抗肥胖以及對高血壓和糖尿病的治療中有獨特的功能［4-5］。但是，目前巖藻黃素的生產(chǎn)存在產(chǎn)量低、難以滿足市場需求的問題。因此，如何提高巖藻黃素含量是當前研究熱點。

光照作為一個復雜的生態(tài)因子，對微藻生長發(fā)育的影響最為重要。在培養(yǎng)中改變光周期已經(jīng)成為微藻次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的常用策略。有研究表明，新月柱鞘藻（Cylindrothecaclosterium）巖藻黃素的合成量在光周期為18L∶6D 時達到最大值23.6 mg·g-1DW［6］。而假微型海鏈藻（Thalassiosirapseudonana）在8L∶16D的光周期下獲得最大的巖藻黃素產(chǎn)量（1.18 mg·g-1DW）［7］。但光周期是否促進湛江等鞭金藻細胞生長和巖藻黃素含量，目前還未見相關報道，優(yōu)化光周期對湛江等鞭金藻細胞生長和巖藻黃素積累以及實現(xiàn)巖藻黃素規(guī)?；a(chǎn)具有重要價值。

巖藻黃素生物合成受多種代謝通路的影響。章麗等［8］發(fā)現(xiàn)三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）中八氫番茄紅素脫氫酶基因（pds）、番茄紅素β-環(huán)化酶基因（lcyb）和玉米黃素環(huán)氧酶基因（zep）等基因與巖藻黃質(zhì)積累具有相關性。巖藻黃素含量還與光合作用相關，三角褐指藻經(jīng)光合促進因子光合誘導素（photosynthetic induction factor，PIF）和抑制劑二氯苯基二甲基脲（dichlorophenyl dimethyl urea，DCMU）分別處理后，巖藻黃素含量相應的提高和下降［9-10］，說明光合作用直接影響巖藻黃素積累。Li等［11］發(fā)現(xiàn)，隨著光照時間減少，假微型海鏈藻和細孔海鏈藻（Thalassiosirapunctigera）的Rubisco 酶大亞基含量提高，可能與rbcL基因表達有關。光周期是否調(diào)控湛江等鞭金藻巖藻黃素合成通路和光合作用相關基因的表達，目前還未見相關報道。本試驗通過研究不同光周期對湛江等鞭金藻細胞生長、巖藻黃素含量、葉綠素熒光參數(shù)及相關基因表達的影響，優(yōu)化促進湛江等鞭金藻細胞生長和巖藻黃素積累的最佳光周期，探明巖藻黃素積累的光合生理和基因表達調(diào)控機理，旨在為進一步提高巖藻黃素含量和探明巖藻黃素的誘導表達調(diào)控分子機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湛江等鞭金藻（I.zhanjiangensis）藻種，寧波大學海洋學院植物資源開發(fā)與利用實驗室。植物RNA提取Plant RNA Kit，OMEGA 公司（美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）和實時熒光定量聚合酶連鎖反應（quantitative real-time PCR，RTq-PCR）試劑ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，諾唯贊生物科技有限公司（南京）；其他藥品及試劑，上海國藥集團化學有限公司。

1.2 儀器與設備

cytoFLEX流式細胞儀，貝克曼公司（美國）；UV-5200分光光度計，上海元析儀器有限公司；AquaPen-C AP 110-C 葉綠素熒光儀，F(xiàn)luorCam 公司（捷克）；LC96 實時熒光定量PCR儀，Roche公司（瑞士）。

1.3 試驗方法

1.3.1 湛江等鞭金藻的培養(yǎng)及處理 湛江等鞭金藻使用滅菌海水進行培養(yǎng)，配方參照DB3302/T 162-2018《海洋微藻餌料規(guī)模化培養(yǎng)技術規(guī)范》［12］。藻種培養(yǎng)于光照12 h/黑暗12 h（12L∶12D）、光照強度50 μmol·m-2·s-1、溫度25 ℃的培養(yǎng)箱中。將生長至對數(shù)期的藻種以初始濃度為680 nm 下吸光度=0.1（A680=0.1）接種于海水培養(yǎng)基中，分別于不同光周期條件（0L∶24D、6L∶18D、12L∶12D、18L∶6D、24L∶0D）下培養(yǎng)，每組設3個生物學重復。

1.3.2 湛江等鞭金藻生長曲線測定 取生長至對數(shù)期的湛江等鞭金藻30 mL，在4 ℃下以5 000 r·min-1離心10 min后棄上清液，用海水培養(yǎng)基將藻泥以2倍逐級稀釋后，用cytoFLEX 流式細胞儀計數(shù)各稀釋組中湛江等鞭金藻的細胞密度，同時用UV-5200 分光光度計測定其A680。以細胞密度為橫坐標、A680為縱坐標繪制標準生長曲線并建立回歸方程。從試驗處理開始，每24 h取藻液測定A680，并根據(jù)標準曲線回歸公式換算成細胞密度，繪制生長曲線。每組設3個生物學重復。

1.3.3 湛江等鞭金藻巖藻黃素和葉綠素含量的測定 在第6天時，每瓶取3 mL藻液樣品，使用分光光度法測定葉綠素含量［13］。以5 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入3 mL無水乙醇，混勻，在60 ℃下避光浸提2 h。提取液以5 000 r·min-1離心10 min，取上清液在分光光度計下測定445 nm 下的吸光度（A445），根據(jù)吸光度計算巖藻黃素產(chǎn)量和含量，公式參照徐潤潔等［14］并做修改。每組設3個生物學重復。

式中，F(xiàn)xc為巖藻黃素產(chǎn)量（μg·L-1）；Fxh為巖藻黃素含量（μg·105cells-1）；A445為提取液在445 nm 下的吸光度；N為稀釋倍數(shù)；V1為提取液體積（mL）；V2為樣品體積；A′為巖藻黃素濃度為1 g·L-1時在1 cm 光徑比色皿中的理論吸收值，即1 600；細胞數(shù)單位為105個細胞。

1.3.4 湛江等鞭金藻葉綠素熒光參數(shù)測定 在不同光周期處理后24、48 和72 h 分別取各組湛江等鞭金藻藻液3 mL，稀釋到近似A680后暗適應15 min，使用AquaPen-C AP 110-C葉綠素熒光儀分別測定光系統(tǒng)Ⅱ（photosynthesis Ⅱ，PSⅡ）最大量子產(chǎn)率（photochemical effiency，F(xiàn)m/Fv）、PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)率［Y（Ⅱ）］、光化學淬滅系數(shù)（photochemical quenching，qP）和非光化學淬滅系數(shù)（non-photochemical quenching，NPQ）。根據(jù)儀器說明書，將測量光強（Flash pulse）和飽和光強（Super pulse）設置為10%強度，光化光強（Actinic pulse）設置為培養(yǎng)時的光照強度，即50 μmol·m-2·s-1。每組設3 個生物學重復。

1.3.5 湛江等鞭金藻巖藻黃素相關合成通路的基因表達分析 根據(jù)實驗室測得的湛江等鞭金藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選取巖藻黃素合成通路的關鍵酶基因（pds、lcyb、zep1、zep2、zep3）和光合作用相關基因（rbcL，psbA），利用Primer Primer 5.0 軟件設計定量引物（表1）。取不同光周期處理24 h后的藻液使用OMEGA 植物RNA 提取試劑盒提取總RNA，每組設3 個生物學重復，然后用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）試劑盒反轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑進行擴增，每組設3 個技術重復。反應體系為10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix （2×）、0.4 μL 上游引物、0.4 μL 下游引物、8.2 μL 超純水、1 μL 模板，共計20 μL。反應程序為95 ℃預變性30 s，40輪循環(huán)反應（94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s）。熔解曲線采集程序95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Sequences of primers for real-time quantitative RT-qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Microsoft Excel 2016 進行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 26.0 軟件進行顯著性檢驗、使用皮爾森（Pearson）相關系數(shù)來分析不同光周期下巖藻黃素含量與總?cè)~綠素（total chlorophyll，chlT）含量、葉綠素熒光參數(shù)、基因表達量之間的相關性并進行主成分分析，以P＜0.05為差異顯著（*），P＜0.01為差異極顯著（**）。

2 結(jié)果與分析

2.1 光周期對湛江等鞭金藻生長的影響

根據(jù)流式細胞儀計數(shù)得到的細胞數(shù)和分光光度計測得的吸光度A680繪制標準生長曲線（R2為0.998 2），得到回歸公式（3）：

式中，Y為細胞密度（105cells·mL-1）；X為吸光值（A680）。

由圖1可知，0L∶24D處理下湛江等鞭金藻細胞無法生長。隨著光照時間的延長，湛江等鞭金藻細胞密度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，以光周期為18L∶6D時的細胞密度最大，最高達到了148×105cells·mL-1，且與6L∶18D相比差異極顯著（P＜0.01），說明18L∶6D是湛江等鞭金藻細胞生長最適合的光周期。

圖1 光周期對湛江等鞭金藻生長趨勢和藻細胞密度（第8天）的影響Fig.1 Effects of different photoperiod on cell growth trend and cell density（8th day） of I.zhanjiangensis

2.2 光周期對湛江等鞭金藻巖藻黃素含量的影響

研究不同光周期對湛江等鞭金藻巖藻黃素含量的影響，結(jié)果表明（圖2-A），6L∶18D下巖藻黃素含量達到最高（0.041 μg·105cells-1）。相較于光周期為6L∶18D時，光周期12L∶12D、18L∶6D、24L∶0D 下巖藻黃素含量分別下降了5.3%、39.1%和63.5%（P＜0.01），即隨著周期中光照時間的延長，巖藻黃素含量呈下降趨勢。巖藻黃素產(chǎn)量隨周期中光照時間的延長呈先上升后下降趨勢（圖2-B）。與6L∶18D相比，12L∶12D下巖藻黃素產(chǎn)量極顯著增加，達到了4.35 mg·L-1的最大值（P＜0.01），隨著光照時間的繼續(xù)延長，巖藻黃素產(chǎn)量逐漸下降，在24L∶0D下達到1.62 mg·L-1的最小值（P＜0.01），說明巖藻黃素產(chǎn)量受到細胞密度和單細胞巖藻黃素含量的共同影響。

圖2 光周期對湛江等鞭金藻巖藻黃素含量和產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of photoperiod on the content and production of fucoxanthin in I.zhanjiangensis

2.3 光周期對湛江等鞭金藻葉綠素含量的影響

研究不同光周期對湛江等鞭金藻葉綠素含量的影響，結(jié)果表明（圖3），葉綠素a（chlorophyll a，chla）和葉綠素c（chlorophyll c，chlc）含量均隨光照時間的延長而下降。在光周期為6L∶18D時，總?cè)~綠素（chlT）含量達到最高（0.033 μg·105cells-1），相較于光周期為6L∶18D時，光周期12L∶12D、18L∶6D、24L∶0D下的chlT含量分別下降21.7%、42.4%和60.1%。說明長時間光照不利于細胞積累葉綠素。根據(jù)相關性分析結(jié)果（表2），chlT含量與巖藻黃素含量之間呈顯著正相關，相關系數(shù)為0.972。

圖3 光周期對湛江等鞭金藻葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of photoperiod on the production and content of chlorophyll in I.zhanjiangensis

表2 巖藻黃素含量與各指標間的相關系數(shù)Table 2 Correlation coefficient between fucoxanthin content and each index

2.4 光周期對湛江等鞭金藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

研究不同光周期對湛江等鞭金藻葉綠素熒光參數(shù)的影響，結(jié)果表明（圖4），隨著處理時間延長，F(xiàn)v/Fm在24L∶0D下第3天有極顯著下降，其他組總體保持平穩(wěn)。隨著處理時間延長，Y（Ⅱ）和qP在6L∶18D下逐漸提高（P＜0.01），在12L∶12D 和18L∶6D 下先上升后下降，在24L∶0D 下逐漸下降（P＜0.01）。相關性分析結(jié)果顯示（表2），Y（Ⅱ）和qP 與巖藻黃素含量間的相關性較強，相關系數(shù)分別為0.845和0.858。在所有組中都未測得非光化學熒光猝滅系數(shù)（non-photochemical quenching，NPQ），說明測定周期內(nèi)所有處理未啟動熱耗散機制。

圖4 光周期對湛江等鞭金藻葉綠素熒光參數(shù)的影響Fig.4 Effect of photoperiod on chlorophyll fluorescence parameters of I.zhanjiangensis

2.5 光周期對湛江等鞭金藻光合作用和巖藻黃素合成相關基因的影響

本試驗選取了湛江等鞭金藻光合作用和巖藻黃素合成途徑中較關鍵的一些基因，利用RTq-PCR 檢測了光周期對這些基因相對表達量的影響，結(jié)果表明（圖5），psbA和zep2基因相對表達量隨著周期中光照時間的延長呈先下降后上升趨勢，pds、rbcL、zep1、zep3和lcyb基因相對表達量呈下降趨勢，但幅度有所不同。相關性分析表明（表2），zep家族的3個基因中，與zep1和zep2相比，zep3基因相對表達量與巖藻黃素含量的相關性系數(shù)最高，達到了0.863，為強相關性（P＞0.8），說明zep3基因可能是響應光周期變化中最相關的zep基因。巖藻黃素含量與rbcL、pds、lcyb、zep3基因變化的相關系數(shù)都超過了0.7，存在較強的相關性，說明巖藻黃素的變化是基因表達水平改變的結(jié)果。

圖5 不同光周期下湛江等鞭金藻各基因轉(zhuǎn)錄的差異Fig.5 Differences in gene transcription of I.zhanjiangensis under different photoperiod

2.6 光周期對湛江等鞭金藻各參數(shù)的主成分分析結(jié)果

主成分分析結(jié)果表明（圖6），所有的參數(shù)被降維到了兩個主成分中（RC1、RC2），其中，RC1為葉綠素熒光參數(shù)，貢獻率為51.54%，RC2 為光合作用和巖藻黃素合成通路相關基因，貢獻率為42.77%，累計貢獻率為94.31%。主成分分析表明，光合作用和巖藻黃素合成相關基因的變化是影響巖藻黃素含量變化的主要因素。光合生理參數(shù)中的chlT 含量、Y（Ⅱ）和qP 與巖藻黃素含量（Fx）距離較接近，說明巖藻黃素含量的變化受到光合作用的影響。結(jié)合相關性分析結(jié)果，說明巖藻黃素合成受到光合作用和基因表達的共同影響，且rbcL、pds、lcyb和zep3基因是影響巖藻黃素合成的主要基因。

圖6 湛江等鞭金藻各參數(shù)的主成分分析結(jié)果Fig.6 Results of principal component analysis of parameters of I.zhanjiangensis

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，湛江等鞭金藻生長的最適光周期為18L∶6D，與等鞭金藻（Isochrysisgalbana）、微擬球藻（Nannochloropsisgaditana）細胞生長的最適光周期相一致，但與布朗葡萄藻（Botryococcusbraunii）細胞（24L∶0D）和蠣甲藻屬微藻（Ostreopsiscf.ovata）細胞生長的最適光周期（12L∶12D）不同［15-18］，這可能和微藻的種類有關。微藻以在黑暗下進行分裂，在光照中進行生長的節(jié)律來提高光合效率［19］，本試驗發(fā)現(xiàn)24L∶0D 光周期下細胞密度降低，可能是因為這種節(jié)律被打破，導致藻細胞的光合效率降低，細胞密度下降。

巖藻黃素會與葉綠素a/c 和某些蛋白結(jié)合形成捕光天線復合體并向后傳遞能量，推動暗反應進行［20］。作為一種天線色素，巖藻黃素含量與光照條件密切相關。Wang 等［6］發(fā)現(xiàn)，在24∶0D 下會導致新月柱鞘藻（Cylindrothecaclosterium）的Rubisco 酶等蛋白及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達下調(diào)，進而造成巖藻黃素含量減少，同時微藻會發(fā)生光抑制進而造成巖藻黃素含量降低。Palanisamy等［7］發(fā)現(xiàn)，假微型海鏈藻的巖藻黃素含量在8L∶16D 下獲得最大值，并且隨著光照時間從8 h 增加到24 h，巖藻黃素含量逐漸下降，與本研究趨勢一致。而巖藻黃素產(chǎn)量受到細胞密度和單細胞巖藻黃素含量的共同影響，這種變化趨勢是由光照時間導致的細胞密度變化和細胞內(nèi)巖藻黃素含量的變化所致。湛江等鞭金藻在12L∶12D 下獲得了最大的巖藻黃素產(chǎn)量，因此需要進一步研究巖藻黃素合成量和細胞生長之間的平衡點，從而在實際運用中達到最高的巖藻黃素產(chǎn)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素和巖藻黃素含量間存在較強的相關性，Nicklisch等［21］計算了不同藻中巖藻黃素含量與葉綠素含量的比值，發(fā)現(xiàn)光周期的長短對其影響很小，與本試驗的結(jié)果一致。因此，當光照時間不足時，微藻可能為了提高光合效率，通過負反饋持續(xù)增加葉綠素含量，造成巖藻黃素含量提高。同時也有研究表明，過長的光照時間不利于葉綠素的產(chǎn)生［22-23］，這可能和葉綠素合成相關酶受到的光調(diào)控有關。如植物中存在一些轉(zhuǎn)錄因子如HY5 等可在光照下促進基因的表達，而植物光敏色素互作因子PIFs 可在黑暗中抑制Chl 合成基因的表達［24］。Palanisamy 等［7］認為，在過長的光周期下，浮游植物細胞會減少葉綠素a 的合成和積累，從而改善過度光能引起的光損傷或光抑制，并且在24 h 光照下發(fā)生的光抑制現(xiàn)象也會造成葉綠素的降解［25］。

葉綠素熒光參數(shù)可以評價PSⅡ光能捕獲、電子傳遞和光能損耗等過程，并且具有較高的靈敏性［26］。24L∶0D 下湛江等鞭金藻Fv/Fm下降，說明PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率降低，植物發(fā)生了光抑制，這解釋了巖藻黃素與葉綠素含量的下降［27］。當光抑制發(fā)生時會產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），造成PSⅡ反應中心D1 蛋白破壞，但植物體存在損傷修復的機制，可以合成新的D1 蛋白保持PSⅡ功能［28］，這解釋了PsbA在24L∶0D 組中表達量的提高。6L∶18D 下Y（Ⅱ）和qP的逐漸提高，說明光合系統(tǒng)實際光能轉(zhuǎn)化效率和電子傳遞活性顯著增強，使微藻在縮短的光照時間內(nèi)提高光合效率從而利用更多的光能［27］。而24 h 光照下Y（Ⅱ）和qP 的逐漸下降表明PSⅡ的反應中心受損。在本試驗中未能測到NPQ 數(shù)據(jù)，表明在本試驗條件下湛江等鞭金藻并未啟動NPQ機制進行熱耗散。

pds和lcyb基因在巖藻黃素合成中十分關鍵，pds編碼的八氫番茄紅素脫氫酶是巖藻黃素合成的限速酶［29］，lcyb位于類胡蘿卜素合成的分支點［30］。zep基因位于巖藻黃素合成末端的位置［12］，對三角褐指藻的研究發(fā)現(xiàn)，3 個zep基因在藻中和不同因素影響下的表達情況不同［31-32］，胺處理和尿素處理使zep2大量表達，藍光處理使zep1和zep3表達水平上升，海帶提取物會使zep3的表達水平發(fā)生最顯著的上調(diào)。因此，3個zep基因在光周期下的不同變化趨勢可能說明這3 個基因具有不同的作用，zep3基因與巖藻黃素含量的相關性系數(shù)最高，可能說明光周期通過影響zep3表達改變了巖藻黃素合成。rbcL基因編碼暗反應關鍵酶Rubisco酶的大亞基［33］，Minoda等［34］發(fā)現(xiàn)，黑暗環(huán)境會提高紅藻（Cyanidioschyzon merolae）rbcL基因表達水平并在暗-光轉(zhuǎn)換時激活光合作用，因此6L∶18D組中rbcL基因表達水平上調(diào)可能是為了提高光合作用。

4 結(jié)論

光周期通過對湛江等鞭金藻光合作用和巖藻黃素合成相關基因的共同作用，影響了藻體中巖藻黃素的合成和積累，不同基因受光周期影響的變化趨勢不同，光周期可能主要通過影響zep3表達影響了巖藻黃素合成。通過改變光周期來提高巖藻黃素的含量，有利于巖藻黃素生產(chǎn)，但仍需解決細胞生長和巖藻黃素合成之間的平衡問題。