基于低共熔溶劑的分散液液微萃取法測定茶飲料中68種農(nóng)藥殘留

王華威 陳文輝 陳升凡 李倩倩 杜麗平 葉 豐李建勛 李 熠

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193； 2天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

茶是世界上最受歡迎的三種非酒精類飲料之一［1］，它擁有眾多健康益處，能預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病［2-3］。隨著生活方式和社會環(huán)境的變化，人們對即飲茶的需求不斷增長，大幅度促進(jìn)了茶飲料的發(fā)展。2021 年，全球茶飲料市場規(guī)模為443 億美元［4］。在有大需求量的同時，茶飲料飲用安全問題也不可忽視。在茶葉種植過程中，為減少病蟲害及提高茶葉產(chǎn)量，種植者會施用農(nóng)藥或其他農(nóng)化產(chǎn)品，過量或不當(dāng)施用往往會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留或飲用安全問題，威脅人類身體健康。因此，對茶飲料中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行監(jiān)測十分必要。

目前常用的樣品前處理技術(shù)主要有QuEChERS（快速、簡單、低廉、有效、穩(wěn)定和安全）［5-6］、固相萃取（solid phase extraction，SPE）［7-8］、固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）［9］和液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）［10-11］。為了有更高靈敏度和痕量化，國內(nèi)外不斷投入研究，以發(fā)展新型萃取技術(shù)［12］。2006年，Rezaee等［13］首次提出了分散液液微萃取技術(shù)（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME），并成功將其用于萃取水中的有機(jī)氯和有機(jī)磷農(nóng)藥。DLLME 因具有操作簡單、快速、有機(jī)試劑用量少、成本低、回收率高優(yōu)勢而備受關(guān)注，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于茶葉、果蔬、茶飲料、果汁等食品中農(nóng)藥的提取。然而，使用含氯的高毒性有機(jī)溶劑（如C2Cl4、CCl4）作為萃取溶劑會增加試驗人員中毒風(fēng)險與環(huán)境污染負(fù)擔(dān)。盡管基于離子液體（ionic liquid，IL）的DLLME 比基于有機(jī)溶劑的DLLME具有顯著的生態(tài)友好優(yōu)勢［14］，但I(xiàn)L 的缺點同樣不可忽視，如復(fù)雜的合成過程、較高的價格和潛在的毒性。因此，尋找低成本、無毒、綠色環(huán)保的溶劑是DLLME 開發(fā)和應(yīng)用中的重要任務(wù)。

低共熔溶劑（deep eutectic solvent，DES）是一種新型的環(huán)保溶劑，由氫鍵供體（hydrogen bond donor，HBD）和氫鍵受體（hydrogen bond acceptor，HBA）組成，熔點極低，其遠(yuǎn)低于各單一組分的熔點［15-16］。常用加熱攪拌法合成DES，還有真空蒸發(fā)法和冷凍干燥法等。DES制備簡單，成本低，且具有可降解和生物相容性好等特有性能［17-19］，成為近些年來研究的熱點，已被廣泛應(yīng)用于植物中有效成分的提?。?0］。

本研究使用的綠色低共熔溶劑以氯化膽堿（choline chloride，ChCl，無毒害）為氫鍵受體，六氟異丙醇（hexafluoroi-sopropanol，HFIP）為氫鍵供體。以該DES為萃取劑，利用DLLME法對茶飲料中的農(nóng)藥進(jìn)行萃取，結(jié)合高效液相質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）進(jìn)行檢測，并全面優(yōu)化前處理條件和分析方法。旨在為茶飲料食用與進(jìn)出口安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15 種茶飲料包括康師傅（茉莉清茶、冰紅茶、綠茶、茉莉蜜茶）、統(tǒng)一（冰紅茶、綠茶）、三得利（烏龍茶）、東方樹葉（紅茶、青柑普洱、綠茶、茉莉花茶）、茶π（柚子綠茶、檸檬紅茶、蜜桃烏龍茶、青提烏龍茶）；乙腈、甲醇（純度99.9%，色譜純），賽默飛世爾科技（中國上海）有限公司；甲酸（純度99.5%，分析純），北京市通廣精細(xì)化工有限公司；氯化膽堿（ChCl，純度98%）、六氟異丙醇（HFIP，純度99.5%），北京索萊寶科技有限公司；68種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），上海泰坦科技股份有限公司；ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱，美國沃特世公司。

本研究選取統(tǒng)一牌綠茶飲料作為代表樣品進(jìn)行方法優(yōu)化和驗證，參考GB/T 23200.13-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 茶葉中448種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜法》［21］以及歐盟、國際法典委員會制定的茶葉中農(nóng)藥最大殘留限量值（maximum residue limits，MRLs），并通過前期研究基礎(chǔ)和調(diào)研文獻(xiàn)，將檢出率較高、不合格率高的部分農(nóng)藥匯總，最終選取茶葉中68種農(nóng)藥殘留進(jìn)行測定。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290-6495 高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；HMS-901磁力攪拌器，深圳市博大精科技實業(yè)有限公司；Milli-Q Synergy 超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司；TG18.5 臺式高速離心機(jī)，長沙綜儀生物科技有限公司；MS200多管渦旋混勻儀，杭州瑞誠儀器有限公司；Vortex-Genie2 渦旋振蕩器，美國Scientific Industries（SI）公司；XPR303SN/AC 電子天平，梅特勒托利多科技（中國上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 制配標(biāo)準(zhǔn)溶液 將每種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用甲醇稀釋成100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，避光-20 ℃保存。將每種標(biāo)準(zhǔn)儲備液精確量取至同一個10.00 mL 容量瓶中，甲醇定容，獲得1 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 樣品前處理 以綠茶飲料為基質(zhì)，取適量體積于4 ℃下保存。

1.3.3 DES的制備 如圖1所示，其中ChCl為氫鍵受體，HFIP 為氫鍵供體。根據(jù)物質(zhì)的量比1∶2（ChCl∶HFIP）來稱量，將其與磁轉(zhuǎn)子一起放入10.00 mL 圓底燒瓶中，后放于磁力攪拌器上，經(jīng)80 ℃恒溫水浴加熱后，形成透明均一的液體，將其密封保存，放置在-20 ℃下保存。經(jīng)過24 h 的觀察，如DES 無絮狀沉淀和凝膠現(xiàn)象且保持澄清透明，則表明DES 能夠使用［22］。

圖1 DES合成路線Fig.1 DES synthesis route

1.3.4 DLLME 步驟 精確吸取5.0 mL 茶飲料置于15.00 mL 離心管中，加入200 μL DES、1.6 mL 乙腈。將混合溶液進(jìn)行渦旋2 min，隨后在6 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心6 min，水相位于上層，DES相位于底層。去除上層水相后，下層DES相過0.22 μm濾膜，后進(jìn)樣分析。

1.3.5 色譜條件 柱溫35 ℃，流速為0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量5.0 μL。以0.1%的甲酸-水溶液作為流動相A，以乙腈作為流動相B，采用梯度洗脫方法，程序見表1。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution procedure

1.3.6 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（electrospray ionisation source，ESI）；掃描模式：動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式（dynamic multi-response monitoring model，DMRM）；噴嘴電壓2 000 V；離子源溫度280 ℃；干燥氣流速12 L·min-1；霧化器壓力206.85 kPa；鞘氣溫度350 ℃，流速10 L·min-1。表2為68種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)。

表2 68種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectral parameters of 68 pesticides

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過MassHunter workstation B.07.00 提取保留時間和色譜峰面積，以及重復(fù)測定的試驗結(jié)果的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。使用Excel 2019 軟件處理數(shù)據(jù)，使用Origin 8.0 制圖軟件繪制譜圖及圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

為優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，將100 μg·L-1的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照品，首先，在電噴霧離子源正離子電離（electrospray ionization+，ESI+）下進(jìn)行全掃描，獲得響應(yīng)較高的母離子信息；其次，進(jìn)行子離子掃描，選擇兩個豐度較高的特征碎片離子，并在DMRM 模式下優(yōu)化碰撞能，確定最佳質(zhì)譜參數(shù)信息，參數(shù)詳見表2。

2.2 前處理方法優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 離子強(qiáng)度 溶液中離子強(qiáng)度會因為NaCl等無機(jī)鹽的鹽析作用而改變，從而減小目標(biāo)物在水相中的溶解度，促使其轉(zhuǎn)入萃取相中，提高萃取率［23］。試驗選取的NaCl添加梯度為0、0.02、0.05、0.08、0.01 g·mL-1。結(jié)果顯示（圖2），NaCl 添加濃度對茶飲料基質(zhì)中農(nóng)藥回收率的影響不明顯；不添加NaCl 時，平均回收率處于最大值；當(dāng)添加濃度為0.02～0.08 g·mL-1時，平均回收率無明顯變化，但0.1 g·mL-1添加濃度時的平均回收率明顯降低，可能是離子強(qiáng)度增大后，降低了溶液的傳質(zhì)效率，最終導(dǎo)致萃取效果降低。因此，本試驗選擇不添加NaCl。

圖2 離子強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of ionic strength

2.2.2 萃取劑體積 針對ChCl-HFIP 體積進(jìn)行優(yōu)化，選取DES 體積為100、150、200、250、300、350、400 μL。結(jié)果如圖3 所示，隨著萃取劑體積增加，各類農(nóng)藥回收率均保持先上升后下降的趨勢。當(dāng)萃取劑DES 用量為100 μL 時，其在待測液中體積過小，在乳化劑作用下也無法形成DES 相；當(dāng)DES 用量為150～200 μL 時，萃取效果較佳，各類農(nóng)藥的平均回收率均大于70%，DES 用量為200 μL 時，回收率達(dá)最大值；當(dāng)萃取劑用量高于200 μL 時，回收率均明顯下降。因此，萃取劑DES最佳選用量為200 μL。

圖3 萃取劑用量的影響Fig.3 Effects of extractant volume

2.2.3 乳化劑體積 在待測液中加入適量乳化劑可誘導(dǎo)DES 的快速生成并富集于樣品溶液底部，有利于DES相的回收。本試驗選擇乙腈作為乳化劑，考察用量1.0、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0 mL 對回收率的影響。結(jié)果表明（圖4），萃取效果隨著乙腈用量增加而先增大后降低，當(dāng)添加量為1.6 mL 時，平均回收率達(dá)到最大值。因此，后續(xù)試驗選擇添加乳化劑體積為1.6 mL。

圖4 乳化劑用量的影響Fig.4 Effects of emulsifier volume

2.2.4 渦旋時間與超聲時間 本研究針對渦旋時間10、30、60、120、180、240 s進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖5所示，在渦旋時間10～120 s 范圍內(nèi)，各類農(nóng)藥回收率隨渦旋時間的延長呈上升趨勢，在120 s 時回收率達(dá)到極值；渦旋時間超過120 s 后，回收率無明顯變化，因此選擇120 s為最佳渦旋時間。進(jìn)一步優(yōu)化超聲時間（0、3、5、10、15、20 min），結(jié)果如圖5 所示，不超聲時，各農(nóng)藥殘留的萃取效果最佳；超聲時間在1～10 min 范圍時，各類農(nóng)藥回收率變化不明顯；萃取時間超過10 min后，各類農(nóng)藥回收率明顯下降，可能是超聲時間過長導(dǎo)致部分農(nóng)殘降解［24］。因此，在前處理中不選擇超聲步驟。

圖5 渦旋時間、超聲時間的影響Fig.5 Effect of vortex time and ultrasonic time

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）是指非待測物對目標(biāo)物濃度的影響，普遍存在于茶葉及茶飲料農(nóng)殘檢測，會對檢測結(jié)果造成影響，普遍是制作基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對農(nóng)藥殘留檢測的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正［25］。本研究采用基質(zhì)加標(biāo)法評估基質(zhì)效應(yīng)。制得100 μg·mL-1的茶飲料基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積進(jìn)行對比得到每種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)。根據(jù)公式［26］計算基質(zhì)效應(yīng)：

68 種農(nóng)藥在茶飲料基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果如圖6所示，ME值范圍為-47.5%～33.2%，負(fù)值居多，說明基質(zhì)抑制效應(yīng)更明顯。本試驗利用茶飲料基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來減少基質(zhì)效應(yīng)對農(nóng)藥殘留定量結(jié)果的影響。

圖6 68種農(nóng)藥在液體基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)Fig.6 Matrix effects of 68 pesticides in tea beverage matrices

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性范圍和定量限 由表3 可知，多數(shù)農(nóng)藥在1～500 或10～500 μg·L-1濃度范圍線性關(guān)系良好，個別農(nóng)藥化合物線性范圍較小，如樂果、異丙隆等，相關(guān)系數(shù)（r2）皆大于0.995，定量下限（lower limit of quantification，LOQ）選擇信噪比為10 的定量離子對色譜峰，本方法的定量限為0.2～10.0 μg·kg-1。

表3 68種農(nóng)藥線性關(guān)系、定量限、基質(zhì)效應(yīng)與方法的精密度Table 3 The linearity，limit of quantification，matrix effects and method precision of 68 pesticides

2.4.2 準(zhǔn)確度與精密度 各農(nóng)藥回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差由加標(biāo)回收試驗得到。在3 個加標(biāo)水平（10、50、100 μg·kg-1）下68 種農(nóng)藥的平均回收率分別為59.1%～103.6%、67.3%～105.4%和70.5%～113.7%，RSD 均小于10.0%，結(jié)果重現(xiàn)性好，符合檢測要求。

2.5 實際樣品測定

為驗證上述前處理方法的適用性，對15 種常見市售的茶飲料（統(tǒng)一、康師傅、東方茶葉、茶π 等）進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測。共檢出5 種農(nóng)藥，結(jié)果如表4 所示，通過與歐盟委員會（EC）和中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［27］發(fā)布的MRLs標(biāo)準(zhǔn)對比，均未發(fā)現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象。

表4 15種市售茶飲料實際樣品檢測結(jié)果Table 4 The actual sample detection results of 15 kinds of marketing tea beverage

3 討論

本研究基于DES 的分散液液微萃取前處理方法，結(jié)合HPLC-MS/MS 測定了茶飲料中的68種農(nóng)藥殘留，與傳統(tǒng)方法相比具有一定優(yōu)勢。

傅強(qiáng)等［28］采用固相萃取技術(shù)測定茶飲料中5種農(nóng)殘含量，使用乙腈提取并經(jīng)過Florisil柱凈化，氮吹復(fù)溶后進(jìn)行氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，該方法預(yù)處理時間較長，而本研究極大縮短了預(yù)處理時長，30 min 以內(nèi)即可完成預(yù)處理操作。聶宏騫等［29］使用分散液液微萃取結(jié)合氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法（gas chromatography-triple quadruple mass spectrometry，GC-MS/MS）測定茶飲料中的5 種農(nóng)藥殘留時，采用了具有揮發(fā)性和較強(qiáng)毒性的四氯甲烷，會威脅試驗員和環(huán)境安全，而本研究采用DES 作為萃取劑，無毒性，是一種綠色環(huán)保的前處理方法。

宋寧慧等［30］采用固相萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS 測定12種擬除蟲菊酯類農(nóng)殘，用20 mL乙酸乙酯萃取3次并通過固相萃取凈化，得到12 種農(nóng)藥回收率為71.8%～104.2%，但該方法有機(jī)試劑使用量較大，步驟也較為繁瑣。

本研究采用DES 作為萃取劑，結(jié)合HPLC-MS/MS對茶飲料中的68 種農(nóng)殘含量進(jìn)行檢測，通過前處理優(yōu)化試驗，包括離子強(qiáng)度、萃取劑體積、乳化劑體積、渦旋時間和超聲時間等，獲得最佳前處理條件，通過方法學(xué)考察，得到68種農(nóng)藥平均加標(biāo)回收率為59.1%～113.7%，符合農(nóng)殘檢測要求，在預(yù)處理時長、有機(jī)試劑的使用量、環(huán)保等方面上較上述方法均有較大優(yōu)勢。

但本研究也存在基質(zhì)效應(yīng)問題，因此后續(xù)可比較研究不同種類低共熔溶劑對茶飲料中農(nóng)藥多殘留的萃取效果，以降低基質(zhì)效應(yīng)，進(jìn)一步降低農(nóng)藥殘留的檢出限，為茶飲料的相關(guān)檢測技術(shù)提供更加新穎的預(yù)處理方法。

4 結(jié)論

本研究建立了一種DLLME-HPLC-MS/MS 測定茶飲料中68 種農(nóng)藥殘留的方法，以綠色環(huán)保的DES（ChCl-HFIP）為萃取劑，并以乙腈為乳化劑。全面優(yōu)化前處理條件后，回收率最優(yōu)組合為：ChCl 與HFIP 的物質(zhì)的量配比為1∶2，添加200 μL DES、1.6 mL 乙腈，再進(jìn)行2 min 渦旋震蕩。此方法快捷且靈敏，LOQ 為0.2～10.0 μg·kg-1，回收率高、綠色環(huán)保且成本低，可作為一種全新并快速有效的技術(shù)手段應(yīng)用于茶飲料中農(nóng)藥多殘留的檢測。