黃嘉玲 胡瑜文 陸 倩 宋欠欠 李 誠 胡 濱
(四川農業(yè)大學食品學院,四川 雅安 625014)
丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)是桃金娘科植物,原產自印度尼西亞,在我國廣東、廣西、云南等地廣泛種植。丁香干燥花蕾呈研棒狀,長1~2 cm,花冠圓球形,棕褐色或褐黃色,是我國允許使用的食品香料,也可以作為中藥,是天然、綠色、安全的植物[1]。丁香精油(clove essential oil,CEO)是從丁香干燥花蕾中提取的揮發(fā)性芳香物質,主要成分為丁香酚、石竹烯和乙?;∠惴?,其中丁香酚相對含量在60%以上[2-4],在抑菌、抗氧化、抗炎、驅蟲等過程中發(fā)揮主要作用。丁香精油可以被應用于食品、農業(yè)、醫(yī)藥、化工等領域[5-6]。
水蒸氣蒸餾、有機溶劑萃取、超臨界CO2萃取、微波輔助是提取植物精油的常用方法[7-9]。其中,有機溶劑萃取可能存在溶劑殘留;超臨界CO2萃取成本高,對設備要求高;微波輔助提取得到的精油純度偏低;水蒸氣蒸餾法是傳統(tǒng)的植物精油提取方法,操作簡單、但提取時間較長。有研究發(fā)現,鹽效應對水相萃取具有積極作用:一方面,鹽效應可以破壞有機物與水之間的水合作用[10];另一方面,鹽效應可以抑制油相與水相的乳化作用[11]。潘曉梅[12]研究發(fā)現,在純溶劑中加入鹽溶液可使其沸點升高,飽和蒸汽壓降低。鹽效應輔助可以彌補水蒸氣蒸餾法提取存在的不足,提高天然產物的提取率,但在丁香精油提取中還鮮見報道。本試驗采用鹽效應輔助水蒸氣蒸餾提取丁香精油,并對提取工藝進行優(yōu)化,通過比較丁香精油的理化指標、化學成分、結構特征、熱力學性質以及抗氧化活性,探究鹽效應輔助水蒸氣蒸餾法提取丁香精油的可行性。
丁香購自安徽亳州醫(yī)珍春精品中藥材公司,經粉碎過20目篩后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2-聯氮-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate,ABTS],美國Sigma-Aldrich 公司;C7-C40 正烷烴標準溶液,上海源葉生物科技有限公司;氯化鈉、無水硫酸鈉、冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、維生素E等,均為國產分析純,成都化學試劑有限公司。
XH-JSG 型揮發(fā)油測定器,上海那艾實驗儀器設備有限公司;TE412-L型電子天平,諸暨市超澤衡器設備有限公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,上海一凱儀器設備有限責任公司;Varioskan Flash 型多功能酶標儀、Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;7890A-5975C 型氣相色譜-質譜聯用儀,安捷倫科技(中國)有限公司;Q200M 型差示掃描量熱儀,美國TA 公司;Evo18 型掃描電子顯微鏡(1 000×),德國卡爾·蔡司股份公司。
1.3.1 水蒸氣蒸餾法提取丁香精油 稱取10.00 g丁香粉置于500 mL 圓底燒瓶,加入150 mL 蒸餾水,連接揮發(fā)油提取裝置,電熱套加熱沸騰蒸餾5 h,記錄精油體積,按公式(1)計算精油提取率。
式中,ρ為相對密度(g·mL-1);V為精油體積(mL);m為丁香質量(g)。
1.3.2 鹽效應輔助水蒸氣蒸餾法提取丁香精油 稱取10.00 g 丁香粉置于500 mL 圓底燒瓶,根據丁香粉質量按比例加入氯化鈉溶液,連接揮發(fā)油提取裝置,電熱套加熱沸騰后開始計時,到達設定時間后結束蒸餾,記錄精油體積,按公式(1)計算精油提取率。
1.3.2.1 單因素試驗 ①液料比對提取率的影響。設定NaCl濃度3%、提取時間3 h,測定不同液料比(10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1 mL·g-1)對精油提取率的影響。②NaCl 對提取率的影響。設定液料比14∶1 mL·g-1、時間3 h,測定不同NaCl濃度(2%、3%、4%、5%、6%)對精油提取率的影響。③提取時間對提取率的影響。設定液料比14∶1 mL·g-1、NaCl濃度4%,測定不同時間(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h)對精油提取率的影響。
1.3.2.2 響應面優(yōu)化試驗 根據單因素試驗結果,選擇單因素中提取率最高的及左右兩側水平,以提取率為響應值,利用Design Expert 8.0 軟件設計響應面試驗。
1.3.3 丁香粉末掃描電鏡分析(scanning electon microscope,SEM) 參考Ding等[13]的方法,將不同處理的丁香粉末固定在導電膠上,進行噴金處理,在放大倍數1 000倍、10 kV加速電壓下觀察涂層樣品,拍攝得到掃描電鏡圖。
1.3.4 丁香精油品質評價
1.3.4.1 丁香精油理化指標測定 參考GB/T 14454.1-2008《香料 試樣制備》[14]、GB/T 11540-2008《香料 相對密度的測定》[15]、GB/T 14455.6-2008《香料 酯值或含酯量的測定》[16]、GB/T 33918-2017《香料 過氧化值的測定》[17]、GB/T 14455.5-2008《香料 酸值或含酸量的測定》[18],分別測定水蒸氣蒸餾、鹽效應輔助水蒸氣蒸餾提取兩種方法提取的丁香精油的相對密度、酯值、過氧化值和酸值。
1.3.4.2 氣相色譜-質譜聯用分析(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS) 參考Wang 等[19]的方法并稍作修改。色譜條件:(HP-5MS)(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷毛細管柱(30 m ×250 μm×0.25 μm),以He為載氣,流速1 mL·min-1,初始溫度50 ℃保持2 min,以3 ℃·min-1升溫至140 ℃,再以8 ℃·min-1升溫至220 ℃保持3 min。進樣口溫度230 ℃,檢測器溫度280 ℃,分流比20∶1,進樣量1 μL。質譜條件:電離方式方面,電子電離源(electron ionization,EI)電離電壓70 eV,離子源溫度260 ℃,40~800 amu 全掃描。在與樣品相同的試驗條件下,用標準的正構烷烴(C7-C40)計算化學成分的保留指數(retention indices,RI)。將化合物的RI 值與文獻值比較,質譜與美國國家標準與技術研究院(national institute of standards and technology,NIST)文庫數據[20]比較。對于色譜圖上的每個組分,計算其峰面積占所有組分總面積的百分比,并表示為該組分的相對含量。
1.3.4.3 差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry,DSC) 參考Semcheddine 等[21]的方法并稍作修改,稱取適量樣品放入鋁坩堝,蓋上坩堝蓋,放入樣品室,以空坩堝作空白對照,設置氮氣流速50 mL·min-1,初始溫度20 ℃,以20 ℃·min-1升溫至400 ℃。
1.3.4.4 傅里葉變換紅外光譜分析(fouriertransform infrared spectoscopy,FTIR) 利用衰減全反射模式測試丁香精油的紅外光譜圖,選擇硒化鋅作為窗口,設置自動增逸,掃描次數32次,分辨率4 cm-1,室內空氣作背景。
1.3.5 丁香精油抗氧化活性測定
1.3.5.1 ABTS自由基清除能力測定 參考Yang等[22]的方法并稍作修改:7 mmol·L-1ABTS與2.45 mmol·L-1過硫酸鉀溶液等體積混合,在室溫避光條件下靜置過夜,無水乙醇稀釋至溶液在734 nm 處吸光度值為0.7。配制系列濃度的丁香精油-無水乙醇溶液,向96孔板中分別加入丁香精油-無水乙醇溶液和ABTS自由基工作液,于734 nm處測定,以同濃度維生素E作陽性對照。
式中,A為5 μL 無水乙醇+195 μL ABTS 自由基工作液的吸光度值;B為5 μL 丁香精油-無水乙醇溶液+195 μL ABTS自由基工作液的吸光度值。
1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力測定 參考Wu等[23]的方法并稍作修改:避光條件下配制0.01 mol·L-1DPPH自由基溶液,配制系列濃度的丁香精油-無水乙醇溶液,對應溶液加入96 孔板,室溫避光反應30 min,于517 nm處測定,以同濃度維生素E作陽性對照。
式中,A為5 μL丁香精油-無水乙醇溶液+195 μL DPPH自由基工作液的吸光度值;B為5 μL無水乙醇+195 μL DPPH 自由基工作液的吸光度值;C為5 μL 丁香精油-無水乙醇溶液+195 μL無水乙醇的吸光度值。
1.3.5.3 羥自由基清除能力測定 參考康荷笛等[24]的方法并稍作修改:配制9 mmol·L-1FeSO4溶液、8.8 mmol·L-1過氧化氫溶液、9 mmol·L-1水楊酸和系列濃度的丁香精油-無水乙醇溶液備用。向96 孔板中加入相應溶液,37 ℃水浴反應30 min,于510 nm 處測定,同濃度維生素E作陽性對照。
式中,A為丁香精油-無水乙醇溶液+FeSO4+H2O2+水楊酸(各100 μL)的吸光度值;B為無水乙醇+FeSO4+H2O2+水楊酸(各100 μL)的吸光度值;C為丁香精油-無水乙醇溶液+FeSO4+蒸餾水+水楊酸(各100 μL)的吸光度值。
采用Design Expert 8.0 軟件進行響應面試驗設計和分析,采用OringinPro 2021 軟件繪圖,采用SPSS 27軟件進行顯著性分析,所有試驗均重復3次,試驗結果以平均值±標準差表示。
2.1.1 液料比對精油提取率的影響 由圖1-A可知,隨著液料比增加,提取率先上升后下降。液料比過低時,鹽溶液不能與丁香粉末充分接觸,不利于分子擴散而導致提取率偏低;液料比過高時,丁香精油提取率反而降低,可能是由于鹽溶液過多,發(fā)生乳化現象,抑制了丁香精油與鹽溶液分離。因此,選擇液料比14∶1 mL·g-1為中值進行響應面試驗。
圖1 液料比(A)、氯化鈉濃度(B)和提取時間(C)對丁香精油提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio (A),NaCl concentration (B) and extraction time (C) on the extraction rate of CEO
2.1.2 氯化鈉濃度對精油提取率的影響 由圖1-B可知,隨著NaCl 濃度增加,提取率先升高后降低??赡苁且驗樯倭縉aCl 可以調節(jié)丁香原料組織細胞內外滲透壓,促進丁香精油溶出,同時引起水溶液飽和蒸汽壓下降,沸點升高,加快精油提取效率;而過量的NaCl使溶液沸點過高導致丁香精油中揮發(fā)性成分損失。因此,選擇NaCl濃度4%為中值進行響應面試驗。
2.1.3 提取時間對精油提取率的影響 由圖1-C可知,隨著提取時間延長,提取率先逐漸提高后降低,蒸餾至4.0 h時提取率最高,然后繼續(xù)加熱提取率反而降低,可能是因為精油中有效成分被過度加熱后發(fā)生揮發(fā)損失。因此,選擇提取時間4.0 h為中值進行響應面試驗。
2.2.1 響應面模型的建立 響應面試驗設計及結果見表1。通過Design Expert 8.0 軟件對數據進行擬合分析,得到提取率(extraction ratio,Y)與液料比(liquid-solid ratio,A)、NaCl 濃度(NaCl concentration,B)、提取時間(extraction time,C)的二次回歸方程模型:
表1 響應面試驗設計及結果Table 1 Experimental design and results of response surface methodology
2.2.2 響應面模型的顯著性檢驗 回歸模型的方差分析及顯著性結果見表2。該模型中F值為224.03,P<0.000 1,表明該模型具有極顯著性;R2=0.996 5,R2
adj=0.992 1,R2pred=0.962 9,均接近1;變異系數(coefficient of variance,CV)=0.40%,失擬項不顯著,表明模型與實際擬合較好。對回歸方程系數進行顯著性檢驗可知,A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2對試驗結果影響顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01),說明試驗各因素對響應面的影響是二次拋物線關系,存在最大值。因此,該模型用于丁香精油提取率的預測具有可行性。
2.2.3 各因素間交互作用 任意兩因素交互作用對丁香精油提取率影響的響應面見圖2。由圖2-A 可知,隨著液料比與NaCl濃度增加,提取率增加;但當提取率增加到一定幅度后,隨著液料比與NaCl 濃度增加,提取率反而下降。這是由于NaCl 濃度增加有助于分子運動加快,同時料液比增加有利于NaCl 溶液與原料的接觸面積增大,這些都有利于提取的進行。但當液料比過大時,溶解在NaCl 溶液中的精油濃度下降,導致提取率降低。由圖2-B 可知,隨著液料比與提取時間增加,提取率增加;但當提取率增加到一定幅度后,隨著液料比與提取時間增加,提取率降低。這是由于隨著液料比和提取時間延長,有利于提取充分進行,但過長的提取時間會導致精油發(fā)生揮發(fā)損失。由圖2-C 可知,隨著NaCl 濃度與提取時間增加,提取率先增加后下降。這是由于在保證充足提取時間前提下,增加NaCl 濃度促進分子運動加快,提取率增加;但提取時間過長時,反復的水蒸氣蒸餾會使已經被提取出來的精油發(fā)生揮發(fā)損失,導致提取率降低;此外,過長的提取時間還會增加能耗。
圖2 兩因素交互作用對丁香精油提取率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plots of the interaction of two factors on the extraction rate of CEO
2.2.4 驗證試驗結果 采用Design-expert 8.0 軟件對回歸方程模型進行預測,預測的最佳工藝為液料比13.23∶1 mL·g-1、氯化鈉濃度3.75%、提取時間3.97 h,理論提取率為18.67%。為了方便操作,將工藝調整為液料比13.20∶1 mL·g-1、氯化鈉濃度3.70%、提取時間4.0 h,提取率為18.56%,實際值與理論值接近,說明此回歸模型真實可靠。
兩種方法提取丁香精油的提取率見表3。使用鹽效應輔助水蒸氣蒸餾法提取丁香精油,不僅可以有效縮短提取時間,還能提高提取率、有效節(jié)約能源、提高丁香利用率。
表3 兩種方法提取丁香精油的提取率Table 3 Extraction rate of CEO from two methods
圖3 展示了經過不同程度處理的丁香粉末在電鏡掃描下的微觀結構。未經處理的丁香粉末結構完整,表面光滑;水蒸氣蒸餾處理和鹽效應輔助水蒸氣蒸餾處理的丁香粉末表面結構受到嚴重破壞,二者均出現許多不規(guī)則的孔洞結構,被破壞程度相當。其中,水蒸氣蒸餾處理經過5.0 h提取,而鹽效應輔助水蒸氣蒸餾處理只經過4.0 h提取,鹽效應輔助水蒸氣蒸餾法可使丁香粉末在更短的時間內達到充分的破裂,這可能是因為鹽的加入加快了分子運動,更容易引起丁香細胞壁破裂,促使細胞中揮發(fā)性成分快速溶出,最終在更短時間內提取到更多的丁香精油。
圖3 丁香原料的電鏡掃描觀察Fig.3 Scanning electron microscope observation of clove powder
兩種不同方法提取丁香精油的理化特性見表4。水蒸氣蒸餾法和鹽效應輔助水蒸氣蒸餾法提取得到的丁香精油顏色均為透明的淡黃色,具有強烈的丁香香味,感官品質好;在20 ℃時的相對密度均為1.05 g·mL-1,略高于水的密度,與提取過程中丁香精油在水中下沉的現象一致;兩種方法提取的丁香精油酸值分別為0.83 和0.84 mg KOH·g-1,均小于1 mg KOH·g-1,說明丁香精油質量較好;丁香精油被氧化程度與過氧化值大小呈正相關,本試驗制備的丁香精油過氧化值均低于0.1 mmol·kg-1,說明品質較好,這可能與其良好的抗氧化活性有關;皂化值是精油質量的綜合評價指標,兩種方法提取的丁香精油皂化值分別為9.07 和9.12 mg KOH·g-1,二者差異不大,說明鹽效應輔助水蒸氣蒸餾法不會對丁香精油成分和結構產生影響。
表4 兩種方法提取的丁香精油的理化特性Table 4 Physicochemical properties of CEO extracted by two methods
用峰面積歸一化法計算精油組分的質量分數,通過NIST 圖譜庫檢索以及查閱相關文獻確認丁香精油成分,結果見表5。不同方法提取的丁香精油均有8種化學物質,占色譜總流出峰的99.80%和99.06%,不同方法提取的丁香精油的主要成分均為丁香酚、乙?;∠惴雍褪裣?,且相對含量差異不大。對比發(fā)現,不同方法提取的丁香精油成分無明顯差異,說明鹽效應輔助水蒸氣蒸餾不會對丁香精油主要成分產生影響。
表5 兩種方法提取丁香精油成分分析Table 5 Composition analysis of CEO extracted by two methods
DSC 曲線見圖4。兩鐘方法提取丁香精油DSC 曲線圖峰型一致,均在280 ℃出現吸熱峰,這是丁香精油中揮發(fā)性物質吸熱汽化所致。二者無明顯差異,說明鹽效應輔助水蒸氣蒸餾法不會改變丁香精油的熱穩(wěn)定性。
圖4 水蒸氣蒸餾(A)和鹽效應輔助水蒸氣蒸餾(B)提取丁香精油DSC曲線Fig.4 DSC analysis of CEO from (A) steam distillation and (B) salt effect assisted steam distillation
由圖5可知,兩種方法提取丁香精油的紅外光譜圖曲線峰形基本一致,均出現了大量吸收峰,表明丁香精油中含有多種揮發(fā)性化合物,其中3 076 和3 059 cm-1為C-H不對稱伸縮振動吸收峰,2 842和2 841 cm-1為C-H 對稱伸縮振動吸收峰,1 763 cm-1為酰胺Ⅰ帶的C=O 伸縮振動吸收峰,1 513 和1 510 cm-1為芳香族C=C 伸縮振動吸收峰。不同方法提取的丁香精油無明顯差異,說明鹽效應輔助水蒸氣蒸餾不會改變丁香精油中主要官能團結構。
圖5 水蒸氣蒸餾(A)和鹽效應輔助水蒸氣蒸餾(B)提取丁香精油FTIR分析Fig.5 FTIR analysis of CEO from (A) steam distillation and (B) salt effect assisted steam distillation
2.9.1 ABTS 自由基清除能力 ABTS 自由基的清除機理是基于氫原子轉移(hydrogen atom transfer,HAT),被氧化的ABTS在734 nm處具有特征吸收,向其中加入丁香精油可使反應體系褪色、吸光度降低[25]。由圖6-A可知,在一定范圍內,丁香精油濃度越大,對ABTS 自由基的清除效果越好,越來越接近同濃度維生素E。有研究表明,ABTS自由基清除率可能與丁香精油中酚羥基含量有關[26]。本研究發(fā)現,精油中的丁香酚含量隨丁香精油濃度的增加而增加,因此表現出更好的清除能力,且不同方法提取的丁香精油ABTS 自由基的清除效果無明顯差異。
圖6 兩種方法提取丁香精油清除ABTS自由基(A)、DPPH自由基(B)和羥基自由基(C)能力Fig.6 Capabilities of two methods of extracting CEO for scavenging ABTS radical(A),DPPH radical (B) and hydroxyl radical (C)
2.9.2 DPPH 自由基清除能力 DPPH 自由基的清除主要依賴HAT和單電子轉移(single electron transfer,SET),物質的含氫能力強弱直接影響其DPPH 自由基清除能力[27]。由圖6-B 可知,DPPH 自由基清除率隨精油濃度的增大而增加,增幅先大后小,逐漸接近同濃度維生素E。可能是由于丁香精油中含有大量丁香酚,丁香酚的酚羥基與DPPH 自由基反應生成苯氧基自由基,精油濃度較小時酚羥基數量較少,所以DPPH 自由基清除效果有限,隨著濃度增加,酚羥基數量增加,更多DPPH 自由基被清除,表現出更好的清除效果,且不同提取方法對丁香精油的DPPH 自由基清除能力無明顯影響。
2.9.3 羥基自由基清除能力 羥基自由基與水楊酸反應生成的有色化合物在510 nm 處有特征吸收,向體系中加入抗氧化劑可以抑制羥基自由基與水楊酸反應,使體系在510 nm處的吸光度降低。由圖6-C可知,丁香精油的羥基自由基清除能力隨濃度升高而加強,這是由于丁香酚羥基上的氫比較活潑,濃度越高,可使更多氫與羥基結合,即有更多的羥基自由基被清除[28]。兩種丁香精油的曲線基本重合,說明不同方法提取的丁香精油對羥基自由基的清除能力無明顯差異。
尹團章等[29]用水蒸氣蒸餾法的改良工藝提取不同產地的丁香精油,提取率分別為14.12%、13.43%和12.56%,說明丁香精油的提取率與原料產地相關。本試驗分別用水蒸氣蒸餾法和鹽效應輔助水蒸氣蒸餾法處理同一批丁香原料,提取率從14.77%提高到18.56%,說明鹽效應輔助對于丁香精油提取具有促進作用;馬鈐等[30]利用鹽析輔助提取甘松精油也展現出積極影響,可能是由于NaCl 增加了原料組織細胞內外滲透壓,更有利于油類成分滲出。無機鹽與水蒸氣蒸餾法聯用不僅保留了水蒸氣蒸餾法設備簡單、操作方便、成本低廉的特點,同時也克服了提取率低的問題。后續(xù)試驗可研究不同種類無機鹽對精油提取的影響。
付振喜[31]用超聲波法和索式提取法提取丁香精油,分別得到22 和12 種化學組分,主要成分與本試驗結果一致,均為丁香酚、石竹烯、乙?;∠惴樱鄬柯杂胁町?,可能與原料的品種、產地、氣候等多種因素有關[32]。不同方法提取的丁香精油均呈透明的淡黃色,通過理化指標、DSC、FTIR 測定得知精油質量良好,且熱穩(wěn)定性和官能團結構未發(fā)生變化。
丁香精油抗氧化能力略低于維生素E,隨著濃度升高,丁香精油對ABTS 自由基、DPPH 自由基、羥基自由基的清除能力逐漸提高,逐漸接近同濃度維生素E,說明丁香精油在抗氧化方面具有較大利用價值。Ma 等[33]研究表明,酚類化合物具有抗氧化性是由于酚羥基具有供氫和供電子的能力,酚羥基含量直接影響其抗氧化活性。丁香精油的主要成分為丁香酚,也是丁香精油具有抗氧化活性的最主要因素,濃度越高,酚羥基含量越高,抗氧化能力越強,Tsantili 等[34]的試驗也得到同樣的結果。不同方法提取的丁香精油中丁香酚含量差異不大,因此抗氧化能力也無明顯差異。關于丁香酚的抗氧化機理還有待進一步研究。
本研究通過鹽效應輔助水蒸氣蒸餾法提取丁香精油獲得的最佳工藝條件為液料比13.20∶1 mL·g-1、NaCl 濃度3.70%、提取時間4.0 h,提取率達18.56%,比水蒸氣蒸餾法提高3.79 個百分點。通過成分分析、理化指標、熱穩(wěn)定性及抗氧化活性研究發(fā)現,兩種方法提取的丁香精油無明顯差異,說明鹽效應輔助提取可有效提高丁香精油提取率,且不會對精油品質造成不良影響,可以用于丁香精油的提取研究。