金槍魚亞微米-納米級魚骨粉的制備及其對魚糜凝膠品質的影響

劉晗慧 李增蔚 李 奕 吳 杰 聞 慧 吳勁宇鄧尚貴 袁鵬翔，

（1浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316000；2舟山技師學院，浙江 舟山 316000）

金槍魚在我國遠洋漁業(yè)中占據(jù)重要地位，2022 年金槍魚捕撈量達34.55 噸［1］。魚骨占魚體總質量的20%～30%，其鈣化物（57.2%）含量豐富、生物利用度高，是低價生物鈣素的潛在來源［2］。但在生產過程中，魚骨多被加工成低值動物飼料或直接丟棄，造成水產資源的浪費［3］。魚骨成粉可顯著提高魚骨的食用及經濟價值，魚骨粉中的鈣離子和磷酸基團的釋放度、流動性、溶解度和持水能力等會隨其粒徑減少而增強［4］。然而，魚骨中鈣、磷酸基團與膠原纖維構成的牢固網絡結構很難使其被超細粉碎。研究者常使用球磨法［5］制備高純度的納米級魚骨粉，利用氣流粉碎法［6］和膠體磨法［7］等制備微米級或亞微米級等超微魚骨粉，但均存在耗時長、能耗大、生產效率低等問題［8］。

擠壓膨化技術是集混合、攪拌、破碎、膨化及成型為一體的技術，具有多功能、高產量、高品質等特點［9］。堅硬原料如魚骨在擠壓膨化過程中，常添加淀粉作為關鍵膨化輔助劑以調節(jié)原料膨化程度［10］。Ali 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，玉米淀粉在130 ℃下經擠壓膨化后可高效制備改性玉米淀粉產物。Philipp 等［12］將豌豆蛋白添加至大米淀粉中，在溫度130 ℃、轉速400 r·min-1條件下，可高效且低能耗制備得到高膨化度且疏松多孔的產物。由此可見，以淀粉作為輔助劑的擠壓膨化方法為超細金槍魚骨粉的高效制備提供了有效手段。

魚骨粉因其鈣離子、磷酸基團釋放度高而有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)無機鹽成為功能性魚糜凝膠增強劑［13］。魚糜的凝膠特性主要取決于鹽溶性蛋白在凝膠過程的膠凝情況，目前常用NaCl 和CaCl2等無機鹽中的Na+和Ca2+等金屬離子促進魚糜蛋白質中離子交換、增強蛋白質分子之間的凝聚，以及加強蛋白質之間水和能力的穩(wěn)定性［14］。而超細魚骨在釋放大量Ca2+的同時，還可能釋放、暴露出與魚糜肌動蛋白結合的其他基團或基團末端，以進一步促進凝膠的形成［15］。此外，魚骨粉還富含磷和膠原蛋白等營養(yǎng)成分，可增加魚糜的營養(yǎng)及保健價值。

本研究以金槍魚骨為原料，利用擠壓膨化法制備超微魚骨粉，并與未經擠壓膨化粉碎魚骨粉的物化性質進行比較，明確擠壓膨化技術制備超微魚骨粉的效果。通過與NaCl、CaCl2、大米+淀粉、未經擠壓膨化魚骨粉等對魚糜凝膠效果的對比研究，明確擠壓膨化超微魚骨粉對魚糜凝膠品質及蛋白結構的影響，旨在實現(xiàn)金槍魚魚骨副產物的高值化開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚骨、冷凍帶魚魚糜，浙江省興業(yè)集團有限公司；大米、淀粉、食鹽、腸衣（直徑25 mm）均為市售；其他化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司（上海）。

1.2 儀器與設備

單螺桿擠壓膨化機，永城市圣輝機械設備有限公司；Zetasize Nano ZS90 激光粒度分布儀，英國Malvern公司；Tensor Ⅱ傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker 公司；S35-LA993 斬拌機，濟南九陽股份有限公司；CS-210精密色差儀，杭州彩譜科技有限公司；iTexture 結構測試儀，浙江浙科儀器設備有限公司；Thermo He 型高速冷凍離心機，上海賽默飛世爾科技有限公司；PQ001低場核磁分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；U-2800紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；HR-20旋轉流變儀，美國TA儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基于擠壓膨化技術制備亞微米-納米級魚骨粉 將魚骨切成約5 cm 小段后于沸水中煮20 min，自來水沖洗干凈后70 ℃烘干，并利用粉碎機初步粉碎魚骨。初步粉碎的魚骨（40.00%）與大米（52.50%）、淀粉（7.50%）混合均勻后用單螺桿膨化機在130 ℃、轉速400 r·min-1條件下處理［16］，所得產物用粉碎機再次粉碎制得擠壓膨化魚骨粉（extruded expanded fish bone meal，EE-FB）；另取與上述步驟中等比例的魚骨粉（40.00%）與大米（52.50%）、淀粉（7.50%），大米與淀粉先用單螺桿擠壓膨化機同條件下處理，再與初步粉碎的魚骨混合均勻后利用粉碎機進行粉碎，得到未經擠壓膨化魚骨粉（non-extruded expanded fish bone meal，N-FB）。對比研究EE-FB 和N-FB，確定擠壓膨化制備亞微米-納米魚骨粉的方法。

1.3.2 亞微米-納米級魚骨粉物化特性測定

1.3.2.1 魚骨粉的粒徑測定 采用激光粒度分布儀測定魚骨粉粒度，對比研究EE-FB 組和N-FB 組粒徑大小。即以純水為分散介質，以2%（NaPO3）6為分散劑，超聲15 min 使樣品分散均勻。利用Zetasizer Software Version 7.13 軟件分析結果。魚骨粉的粒徑采用平均直徑和粒徑分布表示。

1.3.2.2 魚骨粉的傅里葉紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）測定 利用FT-IR光譜儀對比分析EE-FB 和N-FB 兩組魚骨粉的化學結構。將約1 mg魚骨粉與溴化鉀（KBr） （1∶100，w/w）混合，手動壓成半透明薄片，以空白KBr 為掃描背景，F(xiàn)T-IR 掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描64次。

1.3.2.3 魚骨粉的化學組成測定 對比研究EE-FB和N-FB兩組魚骨粉的主要化學組分。參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》［17］中的直接干燥法測定樣品水分；參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》［18］中的凱氏定氮法測定樣品粗蛋白質含量；參照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》［19］中的索氏抽提法測定樣品脂肪含量；參照GB 5009.4-2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》［20］中的總灰分測定法測定樣品灰分含量；參照GB 5009.268-2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》［21］測定樣品鈣含量。

1.3.3 擠壓膨化亞微米-納米級魚骨粉對魚糜凝膠品質的影響研究

1.3.3.1 魚糜凝膠的制備 將冷凍帶魚魚糜在4 ℃下過夜解凍，切碎并斬拌2 min，添加2.5%NaCl 鹽擂2 min，分為5 組。其中，1 組不添加任何物質（NaCl組），其他4組分別加入1.125%大米+淀粉（大米+淀粉組）、0.75%的N-FB（N-FB 組）、0.2%的CaCl2（CaCl2組）及0.75%的EE-FB（EE-FB組）（經試驗測得0.75%EE-FB 對魚糜凝膠品質影響效果最好；0.75% N-FB和0.75% EE-FB均以魚骨粉質量計；0.2%的CaCl2和魚骨粉鈣含量相當）［22］。5 組都加入一定量的冰水，調節(jié)水分含量為78%，斬拌3 min，制作溫度控制在10 ℃以下。魚糜灌腸成型后，采用二段加熱法（40 ℃-30 min；90 ℃ -20 min）凝膠化，冰水冷卻后4 ℃貯藏。對比研究EE-FB對魚糜凝膠性能的影響。

1.3.3.2 魚糜凝膠色差測定 將待測樣品切成20 mm厚的圓柱體，于室溫下平衡30 min。利用色差儀分別測定NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB組魚糜凝膠的L*（亮度）、a*（紅/綠色）、b*（黃/藍色）值。按公式（1）計算白度（W）值：

1.3.3.3 魚骨凝膠質構特性測定 將待測樣品切成20 mm×20 mm 圓柱體。采用P/0.5 S 球形探頭測定NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠的凝膠強度，測試前、中、后速度分別為1.0、1.0、10.0 mm·s-1，觸發(fā)力5.0 g，形變50%，測定并記錄斷裂力（g）和形變量（mm）。魚糜的凝膠強度表示為公式（2）：

采用直徑為35 mm（P/35）的圓柱形鋁制探頭對凝膠圓柱體進行兩次循環(huán)壓縮測試，測試前、中、后速度分別為1.0、1.0、10.0 mm·s-1，觸發(fā)力為5.0 g，形變量為50%，下壓高度為10.0 mm，測定并分析樣品的硬度、彈性、咀嚼性和膠黏性［23］。

1.3.3.4 魚凝膠持水力和蒸煮損失率測定 分別準確稱取NaCl組、大米+淀粉組、N-FB組、CaCl2組、EE-FB組魚糜凝膠樣品3.0 g（w1），3層濾紙包裹后，于50 mL離心管中4 ℃和5 000×g離心15 min，再次稱重（w2）。按公式（3）計算持水力（water holding capacity，WHC）：

將切成薄片的各組魚糜樣品稱重（m1）后放入封口蒸煮袋，90 ℃恒溫水浴20 min，迅速取出魚糜凝膠，輕柔擦去表面液體后再次稱重（m2）。按公式（4）計算蒸煮損失率：

1.3.3.5 魚糜凝膠低場核磁共振測定 分別取NaCl組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組各組魚糜凝膠樣品置于高2.5 cm 的核磁管中，采用核磁共振分析儀測定橫向弛豫時間常數(shù)T2，根據(jù)T2圖譜中各峰面積計算不同類型水分含量的比例。

1.3.4 擠壓膨化亞微米-納米級魚骨粉對魚糜凝膠蛋白質結構的影響

1.3.4.1 魚糜糊的流變特性測定 利用流變儀測定NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜糊的儲能模量（G′）和損耗模量（G″）。即將魚糜糊均勻涂抹在測試平臺，用硅油密封，采用溫度掃描模式測定，測定參數(shù)為振蕩頻率1 Hz、應變2%、平行板間距1 mm，升溫掃描范圍20～90 ℃、升溫速率4 ℃·min-1［24］。

1.3.4.2 魚糜凝膠的化學作用力測定 準確稱取NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠樣品3.0 g，分別與10 mL不同的SA （0.05 mol·L-1NaCl）、SB （0.6 mol·L-1NaCl）、SC （0.6 mol·L-1NaCl+1.5 mol·L-1尿素）、SD （0.6 mol·L-1NaCl+8 mol·L-1尿素）、SE （0.6 mol·L-1NaCl+8 mol·L-1尿素+0.05 mol·L-1β-巰基乙醇）等化學作用力破壞試劑混合均質，4 ℃攪拌1 h 后離心，測定上清液中的蛋白濃度［25］?；瘜W作用力以組間上清液蛋白濃度差表示：離子鍵為SB 與SA 差，氫鍵為SC 與SB 差，疏水作用力為SD 與SC 差，二硫鍵為SE與SD差。

1.3.4.3 魚糜凝膠的FT-IR 測定 將NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠樣品冷凍干燥后，取1 mg 干燥后的樣品與KBr 混合研磨后壓片。FT-IR 吸收光譜范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描64 次。對所得圖譜中酰胺Ⅰ帶進行去卷積、二階求導，并通過高斯曲線擬合得到蛋白質二級結構的相對含量變化。

1.3.4.4 魚糜凝膠的掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察 將制備好的NaCl 組、大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠樣品用刀片切成1 mm 厚度的小片，采用戊二醛溶液固定，用磷酸鹽緩沖液洗滌，依次進行乙醇脫水、叔丁醇置換、冷凍干燥和噴金處理，在加速電壓3 kV 下放大10 000 倍觀察魚糜凝膠的微觀結構。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均重復3 次，每次樣品檢測重復3 次以上。用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，顯著性差異檢驗使用Duncan 多重檢驗，差異顯著為P＜0.05。用Origin 8.6軟件制圖，結果以±s的形式表示。

2 結果與分析

2.1 擠壓膨化魚骨粉的物化特性

EE-FB 和N-FB 見圖1-A，EE-FB 較N-FB 的顏色更深，粒徑結果如圖1-B 和圖1-C 所示。結果表明，N-FB 的平均粒徑為465.03 nm，其中僅有10.80%小于100 nm（納米級），且17.24%的魚骨粉粒徑高于1 000 nm（微米級，有沙礫感）。而EE-FB 組平均粒徑達308.07 nm，顯著小于N-FB 組（P＜0.05），且約有59.41%的魚骨粉粒徑屬于亞微米級（100～1 000 nm），約有40.59%的魚骨粉粒屬于納米級（1～100 nm）。由此可見，擠壓膨化可顯著減少魚骨粉的粒徑，可高效地制備亞微米-納米級魚骨粉。圖1-D 是N-FB 組和EE-FB組的FT-IR結果，兩者圖譜基本相同，都暴露出較多的羥基、磷酸基團，由此可知，高溫高壓的擠壓膨化過程并沒有破壞魚骨原有的基團和結構。N-FB 組和EE-FB 組的水分、粗蛋白、脂肪、灰分和鈣元素含量測定結果見表1。EE-FB 組的各組分含量均顯著低于N-FB 組（P＜0.05），但兩組的灰分含量均為最高，粗蛋白含量次之?；曳值闹饕煞譃榱u基磷灰石，其含有豐富的鈣、磷等礦物元素［26］，且EE-FB 組鈣含量達灰分總量的40.00%，高于N-FB 組的37.06%。由此可見，擠壓膨化可高效制得亞微米-納米級魚骨粉，其粒徑更細小且為鈣源豐富的蛋白原料，更適于高值化產品的開發(fā)。

表1 魚骨粉基本成分及含量Table 1 Basic composition and content of fish bone meal/%

圖1 擠壓膨化魚骨粉（EE-FB）與未擠壓膨化魚骨粉（N-FB）的物化性質Fig.1 Physical and chemical properties of extruded expanded fish bone meal（EE-FB） and non-extruded expanded fish bone meal （N-FB）

2.2 擠壓膨化亞微米-納米級魚骨粉對魚糜凝膠品質的影響

2.2.1 魚糜凝膠色差 色差能反映魚糜凝膠內部結構的變化，同時也是評價魚糜凝膠色澤和品質的重要指標之一，其變化與蛋白質成分、變性、聚合、交聯(lián)程度及表面的光學特性密切相關［27］。NaCl 是魚糜加工過程中常用的凝膠增強劑。由表2 可知，與NaCl 組魚糜凝膠相比，CaCl2組魚糜凝膠的L*無顯著差異，b*值顯著減小，W顯著增加；大米+淀粉組魚糜凝膠的L*、a*、b*、W均無顯著差異；而N-FB 組和EE-FB 組魚糜凝膠的L*和W均顯著減小，b*顯著增加，相比之下，0.75%EEFB魚糜凝膠組的色差變化更大（圖2）。

表2 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜凝膠色度和白度的影響Table 2 Effects of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on color and whiteness of surimi gel

圖2 添加不同凝膠物的魚糜凝膠圖Fig.2 Diagrams of surimi with the addition of different gels

2.2.2 魚糜質構特性 破斷力和破斷距離是影響魚糜凝膠質構特性的關鍵參數(shù)，兩者均與凝膠強度呈正相關［23］。由表3可知，EE-FB組魚糜凝膠的破斷力和破斷距離最大，其凝膠強度也最強（1 249.65 g·mm），且顯著高于其他組。相比NaCl魚糜凝膠組，EE-FB 組魚糜凝膠的硬度、彈性、咀嚼性和膠黏性都顯著升高；大米+淀粉組魚糜凝膠的彈性和咀嚼性無顯著變化，而硬度和膠黏性顯著降低；添加N-FB 雖能顯著增強魚糜凝膠的強度、硬度和膠黏性，但無法增強其彈性；添加CaCl2雖可顯著增加魚糜凝膠的強度、彈性和咀嚼性，但無法改善其硬度和膠黏性。綜合分析，EE-FB 提高魚糜的質構特性的作用最佳。

表3 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜凝膠質構的影響Table 3 Effects of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on texture of surimi gel

2.2.3 魚糜凝膠持水力、蒸煮損失率和水分狀態(tài) 不同處理組魚糜凝膠持水力和蒸煮損失率結果如圖3-A所示，EE-FB 組魚糜凝膠的持水力顯著高于其他組，而蒸煮損失顯著低于其他組；CaCl2組的魚糜凝膠持水力顯著低于其他組，而蒸煮損失顯著高于其他組；NFB 組、NaCl 組和大米+淀粉組的魚糜凝膠持水力和蒸煮損失率均維持在中間水平。因此，EE-FB 可提高魚糜凝膠及其在熱加工過程中的持水能力和凝膠網絡結構的強度。圖3-B為不同處理魚糜凝膠組的低場核磁共振結果，圖中每個峰的面積與魚糜凝膠不同狀態(tài)的水分體系密切相關，可精確計算出結合水、不易流動水和自由水的含量。魚糜凝膠中的結合水能使魚糜凝膠維持穩(wěn)定的結構，計算結果表明，大米+淀粉組、N-EB組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠中的結合水含量相比NaCl 組分別增加了1.06、3.08、0.39、1.72 個百分點，即EE-FB 可最大程度增強凝膠網絡與水分子之間的作用力，促進魚糜凝膠中自由水向更穩(wěn)定的結合水轉化。這與持水性及蒸煮損失率的結果一致，輔證了EE-FB可有效改善魚糜凝膠的持水性。

圖3 不同處理組魚糜凝膠持水力和蒸煮損失率結果Fig.3 The results of water holding capacity and steaming loss of surimi gel in different groups

2.3 擠壓膨化亞微米-納米級魚骨粉對魚糜凝膠蛋白質結構的影響

2.3.1 魚糜糊蛋白流變特性 流變特性可反映魚糜蛋白的非破斷凝膠特性，其中，常用儲能模量（G′）反映樣品的彈性趨勢，損耗模量（G″）表示樣品的粘性趨勢［24］。NaCl組、大米+淀粉組、N-FB組、CaCl2組、EE-FB組魚糜糊蛋白的G′和G″變化趨勢分別見圖4-A 和圖4-B。各組魚糜糊的G′始終大于G″，表明其具有較高的彈性。溫度從20 ℃升至90 ℃的過程中，NaCl 組、大米+淀粉組、CaCl2組魚糜表現(xiàn)出相似的流變特性，即G′值均在55～60 ℃達到最低點，之后緩慢上升，并在80 ℃后基本保持不變。相比之下，N-FB 組和EE-FB組魚糜糊均在43 ℃左右到達最低點，隨后急劇上升，分別在55 和80 ℃達到最大G′值，其中EE-FB 組魚糜糊的最大G′值可達11 136.5 Pa，遠高于其他組。同時，不同處理組的G″變化趨勢和G′相似，在79 ℃后，EE-FB 組魚糜糊蛋白的G″值最大且遠高于其他組。魚糜糊蛋白流變特性結果表明，EE-FB 組具有最高的蛋白質交聯(lián)密度，因此能表現(xiàn)出最好的蛋白凝膠彈性（表3），即EE-FB 能最大程度改善魚糜糊蛋白的流變特性。

圖4 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜糊流變特性的影響Fig.4 Effect of NaCl，rice + starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on the rheological properties of surimi paste

2.3.2 魚糜凝膠蛋白的化學作用力 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB 對魚糜凝膠化學作用力的影響見圖5。相比NaCl 組，EE-FB 組魚糜凝膠的離子鍵有所下降（下降1.08 g·L-1），但仍維持在較高的水平，而大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組魚糜凝膠的離子鍵含量則分別下降了7.24、4.04、2.11 g·L-1。EE-FB 和CaCl2可顯著增強魚糜凝膠的疏水相互作用和二硫鍵，且EE-FB 的增強效果最顯著。相比NaCl 組，N-FB 組魚糜凝膠的二硫鍵含量無顯著變化且疏水相互作用顯著減小，大米+淀粉組魚糜凝膠的疏水相互作用顯著升高而二硫鍵含量顯著減少。離子鍵主要用來穩(wěn)定蛋白質之間的聚集，疏水相互作用和二硫鍵是支撐凝膠結構的主要作用力，因此，EE-FB 可最大程度優(yōu)化魚糜凝膠蛋白的結構并促進其凝膠網絡的形成。

圖5 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜凝膠化學作用力的影響Fig.5 Effect of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on the chemical force of surimi gels

圖6 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB對魚糜凝膠二級結構的影響Fig.6 Effect of NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB on the protein secondary structure of surimi gel

2.3.3 魚糜凝膠蛋白的二級結構 蛋白質的二級結構主要包括β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-轉角等結構，高含量的β-折疊和低含量α-螺旋能維持魚糜較好的凝膠特性［28］。相比NaCl 組魚糜凝膠，大米+淀粉組、N-FB 組、CaCl2組、EE-FB 組魚糜凝膠的β-折疊含量分別顯著增加了0.49、0.30、2.06、2.34個百分點；且EE-FB 組的α-螺旋含量顯著減少。由此可見，EEFB 可最大程度增加β-折疊和降低α-螺旋的作用，進而增強魚糜凝膠強度。

2.3.4 魚糜凝膠蛋白的SEM NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2、EE-FB 對魚糜凝膠微觀結構的影響見圖7，其中NaCl 組魚糜的微觀結構呈現(xiàn)多孔且不均勻（圖7-A），N-FB（圖7-C）、CaCl2（圖7-D）、EE-FB（圖7-E）促使魚糜形成了致密的凝膠網絡結構。且EE-FB組（圖7-E）魚糜凝膠的網絡結構較N-FB 組（圖7-C）、CaCl2組（圖7-D）更為致密，這與上述魚糜凝膠強度（表3）和持水力（圖3-A）結果一致。

圖7 NaCl、大米+淀粉、N-FB、CaCl2及EE-FB的魚糜凝膠SEM圖Fig.7 SEM image of surimi gels NaCl，rice+starch，N-FB，CaCl2 and EE-FB

3 討論

本研究結果表明，擠壓膨化可使高度有序的金槍魚骨短時間內制備出細小、均勻的亞微米-納米級魚骨粉。小粒徑的魚骨粉可暴露出更多的鈣離子、磷酸、多肽等末端或基團以表現(xiàn)出更好的理化特性［4］。通過對比發(fā)現(xiàn)，擠壓膨化技術可改變魚骨在加工過程中的物理形態(tài)，不會改變其基本成分和化學結構，但EE-FB組的各組分含量相比N-FB 組均顯著降低。Gao 等［29］研究表明，擠壓膨化過程中的高溫會加速原料中水分蒸發(fā)、誘使部分蛋白質和脂肪變性，同時在擠壓膨化設備中會粘黏或殘留少量的魚骨粉，這些因素共同導致EE-FB 組各組分含量降低。Yin 等［5］利用濕法球磨法耗時6 h 得到納米魚骨粉。本研究通過擠壓膨化技術在1 min 內可制得平均粒徑為308.07 nm 的亞微米-納米級魚骨粉，雖然粒徑達不到濕法球磨法的大小，但可更節(jié)能、高效地生產亞微米-納米級魚骨粉，更適合工業(yè)化生產。

對比探究EE-FB 對魚糜凝膠品質的影響表明，添加大米和淀粉不會影響魚糜凝膠色澤，但添加N-FB和EE-FB（兩者都含有大米和淀粉）組的L*和W較NaCl組均顯著降低，b*均顯著增加，這表明魚骨粉是影響魚糜凝膠色澤的主要原因。而研究顯示，N-FB 和EE-FB 均為淡黃色，且EE-FB 的黃色更深，其魚糜凝膠b*值也更大，原因可能是未徹底脫去的脂類及蛋白質在高溫擠壓膨化過程中氧化褐變［30］。因此，EE-FB作為魚糜凝膠增強劑時，需調控魚骨粉的添加量以優(yōu)化魚糜凝膠色澤。EE-FB 組魚糜凝膠強度最大且硬度、彈性及膠黏性均較NaCl 組有顯著提升，翟璐等［22］關于金槍魚納米魚骨鈣對魚糜凝膠特性影響研究中也有類似結果。EE-FB 較N-FB 粒徑更小，可釋放更多Ca2+以激活魚糜內源性轉谷氨酰胺酶，使谷氨酸和賴氨酸殘基共價交聯(lián)形成致密蛋白網絡結構，從而增大彈性、膠黏性和咀嚼性［31］。同時，EE-FB 高達11.96%的蛋白也能賦予魚糜凝膠較高的彈性、膠黏性和咀嚼性。魚骨粉尤其EE-FB 可釋放大量的磷酸基團或末端，其可與相鄰多肽鏈的NH3+反應，使蛋白質發(fā)生交聯(lián)，從而增強其凝膠強度和硬度［32］。CaCl2釋放的大量Ca2+也可顯著增強魚糜凝膠的彈性和咀嚼性，但其無法釋放與NH3+高效作用的基團，因此CaCl2組的凝膠強度和硬度顯著低于N-FB 組和EE-FB 組。此外，CaCl2為無機化合物，其可接受程度不及富含蛋白質、脂肪和其他營養(yǎng)成分的天然EE-FB。因此，EE-FB 更適合作為魚糜凝膠增強劑。

本研究表明，EE-FB 組魚糜凝膠相比其他組具有最高的持水力和最低的蒸煮損失率，這主要是由于亞微米-納米級的EE-FB中游離的Ca2+、磷酸基團及暴露的基團或末端誘使魚糜形成的致密網絡結構能捕獲更多的水分子并將其保留在凝膠網絡中。此外，這些基團或末端還可結合水分子，增強凝膠網絡與其之間的作用力［33］，促進EE-FB 組魚糜凝膠中自由水向更穩(wěn)定的結合水轉化，增加其結合水含量，從而提高持水能力，并有效降低在熱加工過程中的蒸煮損失率。相比之下，N-FB 顆粒較大，不利于魚糜凝膠致密網絡的形成及水分的鎖定；而NaCl 和CaCl2釋放的大量游離Cl-可與魚糜蛋白表面帶相反電荷的基團結合，降低了極性氨基酸與水的結合能力［34］。

本研究中EE-FB 組魚糜糊在79 ℃后的G′和G″值均顯著高于其他組，這表明EE-FB 能使魚糜肌球蛋白重鏈和肌動球蛋白變性形成熱不可逆的凝膠網絡，實現(xiàn)蛋白質的高度交聯(lián)，表現(xiàn)出較好的蛋白凝膠粘彈性［35］。本研究表明，EE-FB 可顯著增強魚糜凝膠的疏水相互作用和二硫鍵，這主要歸因于EE-FB 可與魚糜凝膠作用使其肌球蛋白展開，暴露出疏水氨基酸并通過疏水相互作用發(fā)生聚集，形成凝膠網絡，同時暴露更多的巰基并氧化為二硫鍵，促進魚糜蛋白交聯(lián)［36］。由此可見，EE-FB能促進蛋白質的高度交聯(lián)并使其表現(xiàn)出優(yōu)良的粘彈性。此外，蛋白質二級結構中β-折疊的穩(wěn)定性高于α-螺旋，含有高含量β-折疊和低含量α-螺旋的魚糜凝膠特性更好。本研究顯示，EE-FB 可最大程度增加β-折疊和降低α-螺旋的作用，這主要是由于顆粒細小且暴露更多活性基團的EE-FB 可均勻進入魚糜，增強蛋白質間相互作用并最終改變蛋白構象，進而最大程度增強魚糜凝膠強度［37］。

4 結論

本研究采用擠壓膨化技術可在1 min 內高效細化魚骨粉的粒徑至308.07 nm，有利于實現(xiàn)亞微米-納米級魚骨粉的大規(guī)模生產。研究表明，EE-FB 可有效改善魚糜的凝膠特性、流變學特性、持水力，顯著增強魚糜蛋白凝膠形成過程中疏水相互作用和二硫鍵的交聯(lián)，同時可顯著提高魚糜凝膠的β-折疊含量并顯著降低α-螺旋含量，進而改善魚糜品質。因此，EE-FB 能最大程度優(yōu)化魚糜的蛋白質結構、改善魚糜糊蛋白的品質特性。