不同成熟期對花椰菜種子活力及相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響

朱世楊 劉 慶 鐘偉杰 唐 征

（溫州科技職業(yè)學(xué)院/溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙南作物育種重點實驗室，浙江 溫州 325006）

種子質(zhì)量直接關(guān)系到品種的增產(chǎn)豐收和種植效益，成熟度是影響種子質(zhì)量的重要因子，關(guān)系種子發(fā)芽、幼苗生長、植株長勢以及產(chǎn)量品質(zhì)形成的潛力［1-3］?；ㄒ耍˙rassicaoleraceavar.BotrytisL.）為十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個變種，雜種優(yōu)勢較強(qiáng)，且具有抗癌防癌作用，栽培面積逐年增加［4-7］。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）2021 年統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國花椰菜種植面積約48.4 萬公頃，約占全球種植面積的35.1%，位居世界第一。因此，目前市場亟需大量高質(zhì)量花椰菜種子，而在高質(zhì)量花椰菜種子生產(chǎn)中，確立最佳的種子收獲期尤為重要。

種子質(zhì)量好壞直接影響種子萌發(fā)及幼苗生長［8-9］，種子活力是種子出苗能力及幼苗素質(zhì)的總稱，也是衡量種子質(zhì)量的重要綜合指標(biāo)［10-12］。前人在不同作物種子成熟度對種子活力影響的研究結(jié)論不盡一致。張靚等［9］研究發(fā)現(xiàn)，苦荬菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢隨種子成熟逐漸降低。趙永泉等［13］發(fā)現(xiàn)，隨著種子成熟度增加，黃花苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)逐漸提高。劉國梁等［14］發(fā)現(xiàn)，隨著成熟度提高，玉米F1種子發(fā)芽率不斷提高，但簡化活力指數(shù)先增加后降低。李劍等［15］發(fā)現(xiàn)，大麥種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈先升高后降低的變化趨勢。可見不同作物種子活力與其成熟度關(guān)系較復(fù)雜，明確這兩者的關(guān)系對確立最佳的種子收獲期和指導(dǎo)高質(zhì)量種子生產(chǎn)極其重要。

種子活力與生物膜的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，活力高的種子，膜結(jié)構(gòu)比較完整［16］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）是種子活力的保護(hù)酶系統(tǒng)，具有清除活性氧自由基、防止細(xì)胞膜過氧化作用［17-19］。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是細(xì)胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，可用來衡量膜脂過氧化程度，間接反應(yīng)細(xì)胞膜的完整性［20-22］。種子浸泡液電導(dǎo)率大小也能反映細(xì)胞膜完整性程度，電導(dǎo)率越大表示細(xì)胞膜的完整性越差［23］。一般隨著種子成熟度增加，種子SOD、POD 活性增強(qiáng)，電導(dǎo)率和MDA 含量降低，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)越趨向穩(wěn)定，進(jìn)而保障種子活力和種子質(zhì)量。

花椰菜種子生產(chǎn)中，如種子采收過早，尚未達(dá)到生理成熟，種子活力會受影響；而采收過遲，易發(fā)生落粒損失，還延長制種周期，增加管理成本［24］。目前有關(guān)花椰菜種子成熟程度對種子活力影響的研究報道尚少。朱世楊等［24］在中晚熟花椰菜品種甌松90 天制種研究中發(fā)現(xiàn)，隨著種子成熟度增加，SOD 和POD 活性顯著增加，MDA 含量和種子浸泡液電導(dǎo)率顯著降低，授粉后55 d 種子已達(dá)可采收程度，且對種子發(fā)芽和幼苗生長無影響。

甌松60天［浙認(rèn)蔬2019003］是溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院花椰菜課題組（本課題組）最新育成的松花型花椰菜早熟品種，比同生育期臺灣品種美青松60 天增產(chǎn)16.1%［25］，應(yīng)用前景廣闊。因此，本試驗以甌松60 天為材料，分析不同種子采收期對種子活力、抗氧化酶活性等的影響，旨在為其雜交制種中明確合理的種子收獲期提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2019年9月—2020年5月在溫州種子種苗科技園（28°05′9.14″N，120°31′14.74″E）育種大棚進(jìn)行，試驗材料為花椰菜甌松60 天，是利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系育成的松花型早熟品種，由本課題組提供。2019年9月下旬和10月上旬，分別將花椰菜甌松60天父本和母本定植于8 m×50 m的塑料大棚中，父本∶母本=2∶3；2020年3月13日，選擇塑料大棚中間位置母本進(jìn)行試驗，用剪刀修剪母本的健壯花枝，留下生長一致的花朵，然后用父本的新鮮花粉涂抹于母本柱頭上進(jìn)行人工授粉雜交。在授粉后40、45、50、55、60、65 d，分期分批采收角果運至實驗室。一部分用于測定種子含水量、鮮種子千粒重和種子浸泡液電導(dǎo)率等指標(biāo)。同時，另取一部分角果裝入尼龍網(wǎng)袋，晾曬至種子水分8%以下，手工脫粒后裝入牛皮紙袋中，用于測定種子活力及相關(guān)生理生化指標(biāo)。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 種子物理特性 角果運至實驗室后，隨機(jī)取10 個角果，用游標(biāo)卡尺測量角果長度和寬度，用千分之一天平稱量角果質(zhì)量。然后手工脫出種子，用HR105 型鹵素水分測定儀（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）測定種子含水量，即實測水分。用千分之一天平稱量鮮種子千粒重，即實測千粒重。參考《種子檢驗技術(shù)》［26］計算規(guī)定水分含量（8%）千粒重，重復(fù)3次：

式中，規(guī)定水分千粒重和實測千粒重單位為g；規(guī)定水分含量和實測水分含量為百分?jǐn)?shù)。

1.2.2 種子發(fā)芽指標(biāo) 準(zhǔn)備培養(yǎng)皿（Φ=9 cm）若干，清洗干凈晾干，墊兩層濕潤濾紙作發(fā)芽床。隨機(jī)數(shù)取不同成熟期干種子50 粒，播種于培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，置于25 ℃培養(yǎng)室（光照∶黑暗=12∶12）培養(yǎng)7 d。3次重復(fù)。每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，第7天取5株幼苗測量苗高和根長，并計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)［27］：

式中，Gt指第t天發(fā)芽種子數(shù)，Dt指相應(yīng)發(fā)芽的天數(shù)。

1.2.3 種子生理生化指標(biāo) 電導(dǎo)率（electrical conductivity，EC）測定主要參考樊廷錄等［28］的方法，稱取鮮種子0.2 g，放入干凈小燒杯中，用ddH2O 沖洗5 次，吸水紙吸干表面水分，然后放入ddH2O 沖洗3 次的離心管中，加入ddH2O 20 mL，25 ℃黑暗浸泡24 h后，用DDS-307 型電導(dǎo)儀［上海越平科學(xué)儀器（蘇州）制造有限公司］測定種子浸泡溶液的電導(dǎo)率：

電導(dǎo)率（μs·cm-1·g-1）=（ddH2O 浸泡種子24 h 后浸出液電導(dǎo)率-種子剛加入ddH2O 的初始電導(dǎo)率）/種子重量

SOD、POD 活性和MDA 含量測定方法參考《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》［29］，稱取干種子0.2 g，用ddH2O 沖洗3 次，置于墊有蒸餾水濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃萌動24 h后，用鑷子轉(zhuǎn)移到-20 ℃預(yù)冷過的研缽中，加0.05 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 值7.0）6 mL 研磨成勻漿，15 000 r·min-1條件下4 ℃離心20 min，上清液即為酶粗提取液，用于SOD 活性、POD 活性和MDA含量的測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖、表繪制和回歸分析。參考《試驗統(tǒng)計方法》［30］進(jìn)行多重比較和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟期對花椰菜種子物理特性的影響

隨著種子采收期推遲，甌松60天角果，授粉后40、45、50 d 為綠色，55 d 轉(zhuǎn)蠟黃色，60 d 轉(zhuǎn)枯黃，65 d 基本枯黃（圖1），易落粒。授粉后40、45、50、55、60、65 d，角果長度和角果寬度在不同發(fā)育天數(shù)之間無顯著差異；角果重和角果含水量總體呈降低趨勢，其中角果重在授粉后40、45、50 d 之間無顯著差異，而在授粉后55 d則顯著降低；角果含水量在授粉后40、45 d之間無顯著差異，50 d開始顯著降低。說明授粉后55 d，甌松60天角果大小已基本成型，但角果重和角果含水量仍在下降中。

圖1 不同授粉天數(shù)后的花椰菜角果和種子Fig.1 The cauliflower pods and seeds after different days of pollination

隨著種子發(fā)育程度增加，甌松60 天種皮由淡綠、綠色逐漸轉(zhuǎn)成黃褐色、褐色，種皮由光滑有亮澤逐漸轉(zhuǎn)成微皺無亮澤（圖1）。由表1 可知，授粉后40、45、50、55、60、65 d，種子含水量變化范圍為36.42%～62.83%，鮮種子千粒重變化范圍為6.072～7.146 g，種子含水量和鮮種子千粒重在不同授粉天數(shù)之間呈降低變化趨勢。鮮種子千粒重折算成規(guī)定水分（8%）千粒重分別為2.887、3.610、4.021、4.364、4.294、4.284 g，其中授粉后55、60、65 d之間無顯著差異，且均顯著高于50 d。說明授粉后55 d，甌松60 天種子內(nèi)干物質(zhì)積累已基本完成，但種子含水量仍在下降。

表1 不同成熟期對花椰菜種子重量及其含水量的影響Table 1 Seed water content and seeds weight of cauliflower under different seed maturity period

2.2 不同成熟期對花椰菜種子活力和幼苗生長的影響

由表2 可知，授粉后40、45、50、55、60、65 d，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)、苗高和根長隨種子發(fā)育天數(shù)增加呈先增加后穩(wěn)定趨勢。其中，種子發(fā)芽率變化范圍為85.33%～100.00%，發(fā)芽勢變化范圍為79.33%～100.00%，授粉后50、55、60、65 d之間這兩個種子發(fā)芽指標(biāo)均差異不顯著，且均顯著高于40、45 d?；盍χ笖?shù)變化范圍為126.26～201.58，苗高變化范圍為3.37～3.62 cm，根長變化范圍為6.06～7.91 cm，授粉后55、60、65 d 之間這三個指標(biāo)差異不明顯，且均顯著高于50 d?？梢姡诜酆?5 d，甌松60天種子活力已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定水平，發(fā)芽率為98%，且對幼苗生長沒有明顯影響，種子已達(dá)可采收程度。

表2 不同成熟期對花椰菜種子活力和幼苗生長的影響Table 2 Effects of different maturity period on seed vigor and seedling growth of cauliflower

2.3 不同成熟期對花椰菜種子抗氧化酶活性和細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響

由表3 可知，授粉后40、45、50、55、60、65 d，種子SOD 活性變化范圍為64.30～77.11 U·g-1，POD 活性變化范圍為35.56～93.89 U·g-1，SOD 活性和POD 活性在授粉后55、60、65 d之間無顯著差異，且均顯著高于50 d，可見SOD、POD活性隨種子發(fā)育程度增加呈先增加后穩(wěn)定趨勢。MDA含量變化范圍為14.62～62.37 nmol·g-1，種子浸泡液電導(dǎo)率變化范圍為36.23～67.35 μs·cm-1·g-1，這兩者在授粉后55、60、65 d 之間同樣無顯著差異，且均顯著低于50 d，可見MDA含量和種子浸泡液電導(dǎo)率隨種子發(fā)育程度增加呈先降低后穩(wěn)定趨勢。綜上可知，授粉后55 d，甌松60天種子清除活性氧自由基防止膜脂過氧化能力和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性已趨于穩(wěn)定水平。

表3 不同成熟期對花椰菜種子SOD活性、POD活性、MDA含量和電導(dǎo)率的影響Table 3 Effects of different maturity period on SOD and POD activities，MDA content and electric conductivity of cauliflower seeds

2.4 種子重量、種子活力及相關(guān)生理生化指標(biāo)與種子發(fā)育天數(shù)的相關(guān)性

由圖2 可以看出，不同發(fā)育程度甌松60 天鮮種子千粒重與種子成熟度呈極顯著線性負(fù)相關(guān)，y鮮種子千粒重=-0.037x+8.553（R2=0.936，P＜0.01），即隨種子采收天數(shù)推遲，種子重量呈降低變化。雜交種子生產(chǎn)中可根據(jù)授粉后天數(shù)來預(yù)測不同成熟期的種子發(fā)育狀況。隨著授粉后天數(shù)增加，種子活力指數(shù)呈拋物線變化，最大值在授粉后55～65 d 出現(xiàn)，二項式擬合函數(shù)為y活力指數(shù)=-0.131x2+16.957x-344.480，達(dá)極顯著水平（R2=0.970，P＜0.01），利用該函數(shù)關(guān)系可通過授粉后天數(shù)來預(yù)測不同成熟期的種子活力情況。

圖2 種子重量、種子活力、酶活性、丙二醛含量和電導(dǎo)率與種子成熟期的函數(shù)關(guān)系Fig.2 The mathematic relationship between seed maturity and seed weight，seed vigor，enzyme activities，MDA content and electric conductivity

隨著種子成熟期增加，種子SOD 活性、POD 活性也呈拋物線變化特點，最大值也在授粉后55～65 d 出現(xiàn)，這兩個抗氧化酶活性二項式擬合函數(shù)為ySOD活性=-0.020x2+2.668x-10.420，yPOD活性=-0.112x2+14.417x-368.610，均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。與SOD、POD 活性變化相反，MDA 含量和種子浸泡液電導(dǎo)率呈“倒鐘形”二項式變化特點，最小值在授粉后55～65 d出現(xiàn)，擬合函數(shù)為yMDA含量=0.113x2-13.771x+433.780，y電導(dǎo)率=0.088x2-10.319x+338.680，均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。因此，可用這四組函數(shù)來預(yù)測種子保護(hù)酶清除活性氧自由基防止細(xì)胞膜過氧化的能力，進(jìn)而預(yù)測不同成熟期種子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。

2.5 種子物理特性、酶活性、丙二醛含量、電導(dǎo)率與種子活力的相關(guān)性

由圖3 可以看出，種子活力與鮮種子千粒重呈顯著線性負(fù)相關(guān)，擬合函數(shù)為y=-78.259x鮮種子千粒重+691.860（R2=0.790，P＜0.05），與種子含水量呈極顯著線性負(fù)相關(guān)，擬合函數(shù)為y=-3.054x種子含水量+312.860（R2=0.954，P＜0.01），即隨著種子發(fā)育程度增加，種子重量及其水分含量降低，種子活力呈增加趨勢。

圖3 種子物理特性、酶活性、丙二醛含量和電導(dǎo)率與種子活力的函數(shù)關(guān)系Fig.3 The mathematic relationship between seed vigor and seed physical propertiest，enzyme activities，MDA content and electric conductivity

種子活力與SOD 和POD 活性呈極顯著的線性正相關(guān)，擬合函數(shù)分別為y=5.775xSOD-242.620（R2=0.987，P＜0.01），y=1.129xPOD+93.298（R2=0.947，P＜0.01）。種子活力與MDA含量和種子浸泡液電導(dǎo)率均呈極顯著線性負(fù)相關(guān)，擬合函數(shù)分別為y=-1.553xMDA含量+220.500（R2=0.950，P＜0.01）；y=-2.409x電導(dǎo)率+281.150（R2=0.888，P＜0.01）。說明隨著種子抗氧化酶活性增強(qiáng)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性增加，種子活力呈增加趨勢。利用這些函數(shù)關(guān)系可通過抗氧化酶活性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性等生理指標(biāo)來計算不同成熟期種子的活力。

3 討論

種子的大小和形態(tài)物理指標(biāo)與種子成熟度有關(guān)［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，花椰菜甌松60天種子成熟過程中鮮種子千粒重呈降低趨勢，但規(guī)定水分千粒重在授粉后55、60、65 d之間差異不顯著，且明顯大于50 d，表明授粉后55 d花椰菜種子內(nèi)干物質(zhì)積累已基本完成。這與朱世楊等［24］研究發(fā)現(xiàn)花椰菜甌松90 天授粉后55 d角果性狀和種子性狀達(dá)到穩(wěn)定的結(jié)論一致，與賀振等［10］研究發(fā)現(xiàn)玉米授粉后一定天數(shù)種子主要物理特性趨于穩(wěn)定的結(jié)論類似。

種子成熟度與種子活力關(guān)系較為復(fù)雜，明確種子成熟與種子活力之間關(guān)系，對指導(dǎo)種子合理采收具有現(xiàn)實意義。趙永泉等［13］發(fā)現(xiàn)黃花苜蓿種子活力隨種子成熟度增加而增加；樊廷錄等［28］則認(rèn)為玉米雜交種子發(fā)芽率先增加后降低再增加變化；王曉敏等［32］認(rèn)為雜交水稻種子活力先增加后趨于穩(wěn)定；李諾等［33］則認(rèn)為成熟度對野生水茄種子活力沒有顯著影響。本試驗在花椰菜研究中發(fā)現(xiàn)，隨著種子發(fā)育天數(shù)增加，甌松60 天種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)、苗高和根長先增加后趨于穩(wěn)定，授粉后55 d這些指標(biāo)趨于穩(wěn)定，種子發(fā)芽率98%，規(guī)定水分千粒重4.364 g，且對幼苗生長沒有影響，種子已達(dá)可采收程度。

種子SOD、POD 能清除活性氧自由基而保護(hù)細(xì)胞膜的完整性［17-19］，MDA 含量和種子浸泡液電導(dǎo)率間接反映了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性［20-23］。一般隨著種子成熟度增加，種子抗氧化酶活性增強(qiáng)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，隨種子發(fā)育程度增加，種子SOD、POD 活性先增加后趨于穩(wěn)定，種子浸泡液電導(dǎo)率和MDA 含量則先降低后趨于穩(wěn)定，抗氧化酶活性和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性在授粉后55、60、65 d 之間差異不顯著，且在55、60、65 d 抗氧化酶活性顯著高于50 d，而電導(dǎo)率和MDA 含量顯著低于50 d。表明授粉后55 d，花椰菜種子在清除活性氧自由基能力和保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性生理方面已達(dá)穩(wěn)定水平。這與前人在花椰菜［24］、玉米［31］等作物中的研究發(fā)現(xiàn)類似。

種子活力能夠很好地反映田間出苗質(zhì)量，是衡量種子質(zhì)量的重要綜合指標(biāo)［10-12］。理解花椰菜種子物理特性及生理指標(biāo)與種子活力、種子活力與成熟期之間的關(guān)系，對確立品種的適宜收獲期以及指導(dǎo)生產(chǎn)高質(zhì)量種子具有實際意義。本研究發(fā)現(xiàn)，種子活力與種子含水量、MDA 含量和電導(dǎo)率呈極顯著線性負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與SOD 和POD 活性呈極顯著線性正相關(guān)（P＜0.01）。表明花椰菜種子活力與抗氧化酶活性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等生理指標(biāo)密切相關(guān)，意味著可用SOD 活性、POD 活性、MDA 含量和電導(dǎo)率來推測不同發(fā)育程度種子的活力，并進(jìn)一步預(yù)測大田發(fā)芽及出苗情況。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)，種子活力指數(shù)、SOD 活性、POD 活性、MDA 含量、電導(dǎo)率與種子成熟期符合二項式函數(shù)變化特點，且達(dá)到顯著或極顯著水平。表明花椰菜種子活力、抗氧化酶活性、細(xì)胞膜穩(wěn)定性與種子發(fā)育天數(shù)回歸關(guān)系顯著，可用來預(yù)測不同發(fā)育程度種子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而指導(dǎo)高質(zhì)量種子的生產(chǎn)。

4 結(jié)論

隨著種子發(fā)育天數(shù)增加，花椰菜種子活力、SOD和POD 活性先增加后趨于穩(wěn)定，種子浸泡液電導(dǎo)率和MDA 含量先降低后趨于穩(wěn)定，表明花椰菜種子清除活性氧自由基能力和保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性隨種子成熟期增加而趨于穩(wěn)定?；盍χ笖?shù)與MDA 含量和電導(dǎo)率極顯著線性負(fù)相關(guān)，與SOD 和POD 活性極顯著線性正相關(guān)；活力指數(shù)、SOD 活性、POD 活性、MDA 含量、電導(dǎo)率與種子發(fā)育天數(shù)表現(xiàn)出顯著或極顯著的二項式函數(shù)變化規(guī)律，因此可用抗氧化酶活性、MDA 含量和電導(dǎo)率來預(yù)測不同成熟期種子活力和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。綜上，授粉后55 d，甌松60 天種子已達(dá)可采收程度，發(fā)芽率98%，規(guī)定水分千粒重4.364 g，種子活力和種子生理趨于穩(wěn)定，且對幼苗生長沒有明顯影響，還可降低種子易落粒損失風(fēng)險，縮短制種周期，降低管理成本。本研究結(jié)論是在單個品種進(jìn)行一個環(huán)境下分析得到的，今后還需要利用多個品種在多個環(huán)境下全面地分析種子活力及其生理特性與成熟期之間的關(guān)系，以更加準(zhǔn)確地預(yù)測花椰菜雜交種子最佳的收獲期。