特色香料作物油樟葉內(nèi)生真菌多樣性及其揮發(fā)性成分分析

劉雯雯 胡連清 陳 露 楊 麗 魏 琴 周 杰周萬海 ， 馮瑞章

（1宜賓學(xué)院，四川省油樟工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644007；2宜賓學(xué)院，農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川 宜賓 644007；3四川宸煜林業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司，四川 宜賓 644007）

油樟（Cinnamomumlongepaniculatum）是我國特有的木本香料林業(yè)資源，其中提取的天然芳香油在醫(yī)藥、日化和食品等行業(yè)發(fā)揮著重要作用［1］。油樟葉部含油量最高，主要成分為1，8-桉葉油素［2］、α-松油醇、β-蒎烯和γ-松油烯等活性成分［3-4］，是醫(yī)藥、日化和食品等生產(chǎn)的重要原料［5］，且有研究表明油樟精油具有抗氧化、抑菌和抗腫瘤等作用［6-7］。關(guān)于油樟精油的提取和成分分析已有相關(guān)報(bào)道，例如尹浩等［8］研究表明采用酶輔助同蒸餾萃取法提取的油樟葉精油收率最高；寧登文等［9］發(fā)現(xiàn)4、8 和12 月采集的油樟葉出油率最高，樹齡21～40 年且嫩葉和混合葉的相對(duì)出油率最高；程賢等［10］研究結(jié)果顯示春季油樟葉精油提取率高于秋季，但兩季精油主要成分無顯著差異。四川宜賓油樟葉含油量約為江西、廣東及臺(tái)灣等省油樟油量的2.5倍，且比香樟葉含油率高2 倍［11］，推測(cè)與其共生微生物等特殊環(huán)境條件有關(guān)［12］。

植物內(nèi)生真菌指長期或生活史某一個(gè)階段定殖于健康植物內(nèi)部而不引起宿主明顯病理癥狀的微生物［13］，研究證實(shí)其種類和數(shù)量隨宿主植株的種類、季節(jié)或器官等不同而不同［14］。近年來，蛇足石杉［15］、粉色西番蓮［16］、樟葉越橘［17］等不同生境植物內(nèi)生真菌得到了廣泛研究。部分內(nèi)生菌可產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和生物防治等方面具有較大潛力［18］。關(guān)于油樟內(nèi)生菌的多樣性和功能性研究已有一些報(bào)道，如馮瑞章等［19］從油樟中篩選到3 株具有溶磷作用的內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)植物生長、抗性和生物防治具有應(yīng)用效果；黃金鳳［20］通過紫外線誘變篩選出油樟葉中高產(chǎn)α-松油醇的內(nèi)生細(xì)菌；嚴(yán)寬等［21-22］發(fā)現(xiàn)用油樟內(nèi)生真菌2J1 和3J1 的孢子懸浮液處理油樟葉21 d 能顯著提高葉片的揮發(fā)油含量，建立的青霉菌屬油樟內(nèi)生真菌和茉莉酸甲酯培養(yǎng)體系，促使了油樟細(xì)胞揮發(fā)油的合成。譚韻雅等［23］發(fā)現(xiàn)油樟內(nèi)生真菌YY26 和YG42可促進(jìn)1，8-桉葉油素等成分的積累，抑制了YG71代謝產(chǎn)物的分泌。但關(guān)于油樟葉可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的多樣性、菌株與產(chǎn)油量關(guān)聯(lián)性及菌株揮發(fā)性成分分析研究還較少?；诖?，本研究以四川宜賓油樟為材料，測(cè)定不同株系和不同季節(jié)油樟葉的芳香油量，研究其葉部?jī)?nèi)生真菌的多樣性和分布情況，探討不同株系、季節(jié)的菌株種類與含油量關(guān)系，并測(cè)定菌株發(fā)酵液的揮發(fā)性成分，以期為油樟內(nèi)生真菌資源多樣性及提供可應(yīng)用的功能菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油樟葉采集于四川省宜賓市高縣月江森林經(jīng)營所油樟母本園（北緯28°47′77″，東經(jīng)104°59′76″）的5 個(gè)株系（1、14、16、40 和53 號(hào)株系），根據(jù)區(qū)域氣候特點(diǎn)，采樣時(shí)間為3月下旬（春季）、6月下旬（夏季）、9月下旬（秋季）和12月上旬（冬季）。采樣時(shí)，每個(gè)品系隨機(jī)選取成年健康油樟3株，每株樹間隔大于20 m，使用單繩攀爬等方式，到達(dá)大樹頂端，用滅菌剪剪取東南西北4 個(gè)方向的樹葉，每個(gè)方向取3條樹枝，選取枝條上端健康完整的樹葉，每個(gè)樹枝取10片，混合放入4 ℃冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，用于后續(xù)內(nèi)生真菌分離；枝條剩余葉片全部收集后用于油樟油提取。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）營養(yǎng)瓊脂、麥芽提取物瓊脂、察氏、馬丁、卵磷脂吐溫-80 營養(yǎng)瓊脂、玉米粉瓊脂均為成品培養(yǎng)基，購自北京三藥科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油樟葉精油的提取 將采集的部分油樟葉放置于室內(nèi)避光處，待其自然干燥至恒質(zhì)量后，根據(jù)《中華人民共和國藥典 2020 年版 四部》［24］通則2204 揮發(fā)油的測(cè)定方法進(jìn)行提取和測(cè)量。

1.2.2 油樟葉可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的分離純化 收集健康新鮮的油樟葉于無菌取樣袋中，自來水沖洗組織表面2 h，轉(zhuǎn)入到滅菌瓶用無菌水沖洗3 次，95%乙醇漂洗1 min，再用無菌水沖洗1 次，4%（有效氯含量）次氯酸鈉漂洗4 min，最后用95%乙醇漂洗1 min，無菌水沖洗5 次，每次30 s。設(shè)置漂洗對(duì)照、印記對(duì)照和環(huán)境對(duì)照［25］。吸干油樟葉表面水分，利用無菌剪刀將葉片剪成約4 mm2的小葉塊，分別接種到PDA 營養(yǎng)瓊脂、麥芽提取物瓊脂、察氏、馬丁、卵磷脂吐溫-80 營養(yǎng)瓊脂和玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上，每皿接種5 片，設(shè)置10 個(gè)重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)。每24 h 觀察菌落情況并計(jì)數(shù)，根據(jù)各平板菌落形態(tài)隨機(jī)挑選具有代表性的單菌落，連續(xù)傳代培養(yǎng)至菌落形態(tài)單一。

1.2.3 內(nèi)生真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析 采用真菌通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4：5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增ITS 序列。PCR 反應(yīng)體系為50 μL：ddH2O 21 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，20 μmol·L-1正向引物1 μL，20 μmol·L-1反向引物1 μL，DNA 模板2 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格后送上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定。將所得序列信息提交至NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)。

1.2.4 油樟葉內(nèi)生真菌群落多樣性分析 選用4 個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)油樟葉內(nèi)生真菌的多樣性，即物種豐富度S、Shannon-Weiner 多樣性指數(shù)H′、Simpson 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D、均勻度指數(shù)E，具體計(jì)算公式為：

式中，N為樣本全部屬數(shù)之和；Pi為屬相對(duì)頻率，指樣本中分離某屬的菌株數(shù)占分離總菌株數(shù)的百分比。對(duì)油樟葉不同株系或季節(jié)產(chǎn)油率與葉中可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析，探究產(chǎn)油率對(duì)油樟葉中可培養(yǎng)內(nèi)生菌群落組成的影響。

1.2.5 油樟葉內(nèi)生真菌揮發(fā)性成分分析 通過氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatograph/mass spectrograph，GC/MS）對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行揮發(fā)性成分分析。GC條件為：HP-5毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm，安捷倫，美國），載氣為高純N2，流量26.56 mL·min-1，程序升溫，起始溫度80 ℃保持3 min，以5 ℃·min-1升溫至90 ℃保持2 min，5 ℃·min-1升溫至170 ℃保持2 min，5 ℃·min-1升溫至220 ℃保持2 min 結(jié)束。進(jìn)樣口溫度240 ℃，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣，尾吹流量25 mL·min-1。MS條件為：電子轟擊（electron impact，EI）離子源方式，離子源溫度為200 ℃，離子化電壓70 eV，掃描范圍50～650m/z［26］。根據(jù)上述分析結(jié)果，比較篩選能產(chǎn)與宿主揮發(fā)油主要成分相同的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 油樟葉提取的精油含量

由表1可知，選用的5株油樟株系葉產(chǎn)油率存在差異。春季和夏季5 個(gè)油樟株系葉產(chǎn)油率均表現(xiàn)為16＞40＞53＞14＞1，但秋季表現(xiàn)為53＞16＞1＞14＞40，冬季表現(xiàn)為14＞16＞53＞40＞1。由季節(jié)平均產(chǎn)油率結(jié)果可知，春季油樟葉產(chǎn)油率最高，夏季最低，但各指標(biāo)差異均不顯著。各株系油樟葉產(chǎn)油量以16號(hào)最高，1號(hào)最低，且差異顯著（P＜0.05），表明株系特征是決定油樟葉產(chǎn)油率的關(guān)鍵。

表1 不同株系和季節(jié)油樟葉的產(chǎn)油率Table 1 Oil production rate of C.longepaniculatum leaf in different varieties and seasons/%

2.2 油樟葉內(nèi)生真菌的分離及群落組成分析

從油樟葉分離的菌株經(jīng)過分離純化共獲得43 株內(nèi)生真菌（電子附表1），不同株系和季節(jié)的內(nèi)生真菌菌株數(shù)存在差異，根據(jù)株系分類，1、14、16、40、53 號(hào)油樟株系分別分離到8、12、8、10和5株菌株；根據(jù)季節(jié)分類，春夏秋冬季油樟葉分別分離到7、25、2和9株菌株。經(jīng)鑒定43 株內(nèi)生真菌歸屬于2 門、4 綱、9 目、11 科、13屬，其中優(yōu)勢(shì)門為子囊菌門（Ascomycota），優(yōu)勢(shì)綱為座囊菌綱（Dothideomycetes），優(yōu)勢(shì)目為葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales）、格孢腔菌目（Pleosporales），優(yōu)勢(shì)科為葉點(diǎn)霉科（Phyllostictaceae），優(yōu)勢(shì)屬為葉點(diǎn)霉屬（Phyllosticta）。不同株系油樟葉內(nèi)生真菌分布顯示，1 號(hào)株系油樟葉分離的8 株菌鑒定為1 門2 綱4 目4 科5 屬，5 個(gè)屬包括鏈格孢屬（Alternaria）、斜銼蛤?qū)伲≒seudoplagiostoma）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、球座菌屬（Guignardia）和Phyllosticta屬；14號(hào)株系油樟葉分離的12 株菌鑒定為1 門3 綱5 目7 科7 屬，7 個(gè)屬包括Phyllosticta、Colletotrichum、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、Pseudoplagiostoma、間座殼屬（Diaporthe）、黑孢霉屬（Nigrospora）和曲霉屬（Aspergillus）；16 號(hào)株系油樟葉分離的8 株菌鑒定為1 門3 綱5 目5 科6 屬，6 個(gè)屬包括枝孢菌屬（Cladosporium）、Guignardia、Phyllosticta、Colletotrichum、Nigrospora和青霉菌屬（Penicillium）；40號(hào)株系的10株菌鑒定為1門3綱4目4科5屬，5個(gè)屬包括Aspergillus、Guignardia、Phyllosticta、Colletotrichum、Pseudoplagiostoma；53號(hào)株系油樟葉分離的5株菌鑒定為2 門4 綱5 目5 科5 屬，5 個(gè)屬包括Colletotrichum、Phyllosticta、Penicillium、蟻巢傘屬（Termitomyces）和黑管菌屬（Bjerkandera）。根據(jù)不同季節(jié)油樟葉內(nèi)生真菌分離結(jié)果可知，春季7株菌鑒定為1門2綱3目5科5屬，5 個(gè)屬包括Cladosporium、Colletotrichum、Phomopsis、Pseudoplagiostoma和Diaporthe；夏季的25株菌鑒定為1門3 綱3 目3 科5 屬，5 個(gè)屬包括Guignardia、Phyllosticta、Aspergillus、Penicillium和Colletotrichum；秋季2 株菌鑒定為1 門2 綱2 目2 科2 屬，分別為Alternaria和Phyllosticta；冬季9株菌鑒定為2門2綱5目5科5屬，5個(gè)屬包括Colletotrichum、Pseudoplagiostoma、Nigrospora、Termitomyces和Bjerkandera。

通過圖1可知，5個(gè)不同株系油樟葉內(nèi)生真菌屬類數(shù)量差異較小，其中5 株共有屬為Colletotrichum和Phyllosticta。Penicillium和Cladosporium為16 號(hào)株系特有屬。表明油樟不同株系葉中可培養(yǎng)內(nèi)生真菌具有一定相似性，但同時(shí)也具備各自多樣性。

圖1 基于屬水平的不同株系油樟葉內(nèi)生真菌群落圖Fig.1 Community of endophytic fungi in different varieties of C.longepaniculatum leaves based on genus level

由圖2可知，春夏冬3季屬類數(shù)量相同，秋季最少，僅有2屬。春夏秋冬季未見共有屬，春夏秋3季共有屬為Colletotrichum。Cladosporium、Phomopsis、Diaporthe為春季特有屬；Guignardia、Aspergillus、Penicillium 僅出現(xiàn)在夏季；Alternaria僅出現(xiàn)在秋季；Nigrospora、Termitomyces、Bjerkandera僅出現(xiàn)在冬季，可能與不同季節(jié)產(chǎn)油率有關(guān)。表明季節(jié)亦是影響油樟不同株系葉內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性的主要因素之一。

圖2 基于屬水平的不同季節(jié)油樟葉內(nèi)生真菌群落圖Fig.2 Community of endophytic fungi in different seasons of C.longepaniculatum leaves based on genus level

2.3 油樟葉內(nèi)生真菌的多樣性及相關(guān)分析

多樣性分析可顯示宿主植物在生長過程中內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，常采用物種豐富度（S）、Shannon-Wienner 指數(shù)（H′）、Simpson 指數(shù)（D）和均勻度指數(shù)（E）等反映多樣性指標(biāo)。其中H′與物種豐富度關(guān)系最密切，數(shù)值越大表明物種數(shù)量越多，分布越均勻；D數(shù)值越大，顯示優(yōu)勢(shì)種越明顯；E敏感性高于H′，用于分析內(nèi)生真菌群落分布的均勻程度。通過表2和3可知，不同株系油樟葉內(nèi)生真菌S指數(shù)差異不明顯，14 號(hào)株系最大，16號(hào)株系次之；H′指數(shù)表現(xiàn)為16號(hào)＞53號(hào)＞14號(hào)＞40 號(hào)＞1 號(hào)；D指數(shù)為16 號(hào)＞53 號(hào)＞40 號(hào)＞1 號(hào)＞14 號(hào)；均勻度指數(shù)E為53號(hào)株系最大，16號(hào)株系次之，14號(hào)株系最小。不同季節(jié)油樟葉內(nèi)生真菌S指數(shù)春季和夏季值最大，秋季最??；H′指數(shù)和D指數(shù)均表現(xiàn)為春季＞冬季＞夏季＞秋季；4 季均勻度指數(shù)E差異不明顯，冬季最大，秋季最小。由此可知，16 號(hào)株系和春季油樟葉內(nèi)生真菌群落的多樣性相對(duì)最豐富，53 號(hào)和冬季次之，1號(hào)和秋季最低。因此，株系和季節(jié)是影響油樟葉中可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性的重要因素。進(jìn)一步Pearson 相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同株系或不同季節(jié)油樟葉精油產(chǎn)率與葉中可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)無顯著相關(guān)關(guān)系，揮發(fā)油對(duì)可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的影響還應(yīng)做進(jìn)一步分析。

表2 不同株系油樟葉內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of endophyte fungi in C.longepaniculatum leaves of different varieties

表3 不同季節(jié)油樟葉內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)Table 3 Diversity index of endophyte fungi in C.longepaniculatum leaves of different reasons

2.4 產(chǎn)香能力測(cè)定

對(duì)43 株內(nèi)生真菌發(fā)酵液的GC/MS 分析結(jié)果中（表4），共鑒定出69種主要揮發(fā)性成分，含醇類化合物13種、酸類化合物11種、酯類化合物11種、烯類化合物6 種、酮類化合物10種、醛類化合物7種、酚類化合物8種和其他類3 種。揮發(fā)性成分中有多種產(chǎn)香氣物質(zhì)，可作為食品添加劑和香料配方，同時(shí)也檢測(cè)到部分菌株產(chǎn)與油樟精油主要成分相同的物質(zhì)，如X29 內(nèi)生真菌發(fā)酵液產(chǎn)生的桉葉油醇，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.39%；D72 發(fā)酵液產(chǎn)生的芳樟醇，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.42%；A39 發(fā)酵液產(chǎn)生的紅沒藥醇，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.97%（表5）。X29和A39均屬于Phyllosticta。

表4 油樟葉內(nèi)生真菌揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果Table 4 Results of identified volatile components of endophyte fungi from C.longepaniculatum leaves

表5 3株產(chǎn)精油成分菌株的主要揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 5 Contents of main volatile components in three strains producing essential oil/%

3 討論

內(nèi)生真菌是參與宿主植物生長、發(fā)育及代謝等過程的重要因子，為開發(fā)潛在菌株并分析與宿主功能的相關(guān)性，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法對(duì)不同株系和不同季節(jié)油樟葉內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化和鑒定，可知菌株數(shù)量和種屬隨株系和季節(jié)的不同而不同，其中16 號(hào)株系和春季菌群多樣性相對(duì)最豐富，53號(hào)和冬季次之，1 號(hào)和秋季最低。周寧等［27］發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)蔗葉內(nèi)生真菌多樣性和分布存在較大差異。呂立新等［28］分析春、夏和秋茅蒼術(shù)葉的內(nèi)生真菌群落分布，表明菌群隨季節(jié)的變化具有一定的演替規(guī)律，夏季真菌多樣性最高。周萬海等［5］研究了不同季節(jié)油樟葉內(nèi)生細(xì)菌的群落組成，發(fā)現(xiàn)秋季多樣性種群較豐富且分布均勻，冬季菌株豐富度和均勻度均較低。因此，菌株多樣性可能因宿主生長環(huán)境、品種、株齡等不同而不同，且內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌具有非一致的變化趨勢(shì)。由蔡媛等［29］報(bào)道可知多花黃精中分離的內(nèi)生細(xì)菌鑒定為19 門419 屬，而其內(nèi)生真菌僅鑒定為7 門187 屬。任婷月等［30］采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)3 個(gè)不同品種大麥內(nèi)生真菌和細(xì)菌進(jìn)行測(cè)定，顯示不同品種的內(nèi)生菌群落組成差異均較大，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)與植株?duì)顟B(tài)、生長和代謝關(guān)聯(lián)。楊琴等［31］研究顯示不同樹齡銀杏葉的優(yōu)勢(shì)菌門均為子囊菌門，曲霉屬、假絲酵母屬、球腔菌屬等為優(yōu)勢(shì)菌屬。Wu 等［32］研究發(fā)現(xiàn)艾蒿葉片內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)屬為擔(dān)孢酵母屬（Erythrobasidium）和擲孢酵母屬（Sporobolomyces）。本試驗(yàn)分離的43 株內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)門為Ascomycota，優(yōu)勢(shì)屬為Phyllosticta，與前人研究具有較大差異。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室前期利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)秋季油樟葉片內(nèi)生真菌類群進(jìn)行分析，顯示優(yōu)勢(shì)屬為子囊菌門未分類屬（unclassified Ascomycota）、釘孢屬（Passalora）和馬氏霉屬（Uwebraunia）［33］；而本研究中來自秋季油樟葉的菌株僅有2 株，隸屬于Alternaria和Phyllosticta，推測(cè)是由于受到培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基類型和條件局限性所致。

部分內(nèi)生菌能夠增強(qiáng)宿主植物的健康狀態(tài)并促進(jìn)分泌有效的代謝產(chǎn)物［34］，通過與宿主共生誘導(dǎo)能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物，如紫錐菊［35］莖葉組織分離的內(nèi)生細(xì)菌可以影響植物揮發(fā)性產(chǎn)物和生物堿的合成。暗隔內(nèi)生菌能促進(jìn)水稻生長、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收并增強(qiáng)抗逆性［36］。本研究中，雖然春季16號(hào)株系油樟葉產(chǎn)油量最高，且內(nèi)生真菌豐富度、均勻度最佳，但Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，不同株系或不同季節(jié)油樟葉精油產(chǎn)率與其中可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)無相關(guān)性，這與嚴(yán)寬等［21-22］的研究結(jié)果不一致；上述結(jié)果的差異可能與研究材料形態(tài)特征不同有關(guān)，亦可能與宿主不同株系或環(huán)境下含有的特定內(nèi)生菌誘導(dǎo)產(chǎn)生特定代謝物有關(guān)，后續(xù)應(yīng)對(duì)不同株系或不同季節(jié)油樟葉精油主要成分與內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行分析，以確定揮發(fā)油含量和成分如何影響其中內(nèi)生真菌。本研究進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，Penicillium和Cladosporium為16號(hào)株系特有屬，Cladosporium、Phomopsis、Diaporthe為春季特有屬，屬于此分類的菌株可能能促進(jìn)油樟葉精油中特定成分的合成進(jìn)而提高精油的積累，但相關(guān)機(jī)制后續(xù)還應(yīng)深入探究。

目前關(guān)于菌株的揮發(fā)性成分研究主要集中于抗菌性、香氣和病蟲害防治等方面，如楊黎華等［37］從香茅草分離的內(nèi)生真菌中篩選得到1 株長喙殼屬菌株，其發(fā)酵液具有清甜香和花香，利用氣相色譜/質(zhì)譜儀鑒定出乙縮醛二乙醇、檸檬烯、月桂烯、月桂醛等74種香料物質(zhì)；馮福山等［38］發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Y13 發(fā)酵液產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)油茶炭疽病菌具有較好生防效果；陶玲蕓等［39］發(fā)現(xiàn)棘孢木霉揮發(fā)性次級(jí)代謝產(chǎn)物中6-正戊基-2H-吡喃-2-酮（6-PAP）成分能抑制尖孢鐮孢菌。本試驗(yàn)從油樟葉中提取的精油具有特殊芳香氣味，通過GC/MS對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行分析鑒定，可知菌株能產(chǎn)生具有醇類、酸類、酯類、烯類、酮類、醛類及酚類等69 種主要揮發(fā)性成分。其中苯乙酸乙酯具有濃烈而甜的蜂蜜香氣；甲酸乙酯具有辛辣的刺激味和菠蘿樣的果香香氣；6-戊基-2H-吡喃-2-酮可用于食品用香料，呈蘑菇、藍(lán)干酪或乳品香氣；對(duì)甲基苯酚呈煙熏、草藥氣味，尤其是桉葉油醇、芳樟醇和紅沒藥醇，它們屬于油樟精油成分，說明油樟內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主相同的產(chǎn)物，如X29、D72、A39 菌株，且X29 和A39 均為Phyllosticta，但含量較少，后續(xù)將展開進(jìn)一步條件優(yōu)化提高產(chǎn)量，并探索其功能。

4 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)法研究了四川宜賓地區(qū)特色香料作物油樟葉部?jī)?nèi)生真菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，并測(cè)定其產(chǎn)油量和菌株發(fā)酵液揮發(fā)性成分。結(jié)果表明，不同株系和不同季節(jié)油樟葉的內(nèi)生真菌在數(shù)量、種群及組成上存在差異，油樟葉中可培養(yǎng)內(nèi)生真菌是一個(gè)重要的資源庫，其中16 號(hào)株系和春季油樟葉內(nèi)生真菌群落的多樣性相對(duì)最豐富。通過產(chǎn)油率和可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)關(guān)聯(lián)分析，證實(shí)兩者無顯著相關(guān)關(guān)系。此外通過菌株發(fā)酵液成分分析，鑒定到醇類、酯類、烯類及酮類等化合物，并顯示菌株能分泌產(chǎn)生精油類代謝產(chǎn)物，具有進(jìn)一步開發(fā)香料成分的潛力。后續(xù)應(yīng)加大對(duì)微生物功能的探索，對(duì)功能性菌株開展應(yīng)用研究。