多組學分析揭示三七鐮刀菌屬致病菌的生物學差異

張麗燕 聶紅艷 聞進蕊 廖洪新 凌翠瓊 徐福榮 董 鮮

（云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南 昆明 650500）

三七［Panaxnotogineseng（Burk.） F.H.Chen］是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，為五加科多年生草本植物，具化瘀止血、補血活血定痛的功效［1］。三七喜溫暖、陰暗潮濕的生長環(huán)境，而這種特殊的生長環(huán)境有利于病原菌生存，使得三七易受到各種病害的侵染［2］。引起三七發(fā)病的病原種類較多，包括真菌、細菌和線蟲等，但以真菌為主要病原［3-4］。據(jù)報道，三七常見病害中以黑斑病、疫病、灰霉病、圓斑病和根腐病的發(fā)生較為常見，尤其以根腐病的危害最為嚴重［5-6］。

鐮刀菌屬（Fusarium）病原菌是自然界中廣泛存在的致病菌之一，能夠侵染并引發(fā)多種作物病害的發(fā)生，從而導致嚴重的經(jīng)濟損失［7］。研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬類病原菌可從根部侵染植株維管束系統(tǒng)，利用菌絲附著于主根表面并定殖于植株根部，繼而延伸發(fā)育形成菌絲網(wǎng)絡，導致植株地上部發(fā)?。?-9］。大量研究表明，三七根腐病的發(fā)生由多種病原真菌共同作用導致。繆作清等［10］報道三七根腐病由尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、毀滅柱孢菌（Cylindrocarpondestructans）及雙孢柱孢菌（Cylindrocarpon didynum）等病原菌群引起。文增葉等［11］報道尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）是引起三七苗期根腐病的病原真菌。本課題組前期從三七的腐爛根部分離出了尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、層出鐮刀菌（F.proliferatum）、腐皮鐮刀菌（F.solani），結合科赫氏法則確定這3種鐮刀菌均可以引發(fā)三七根腐病的發(fā)生［12］。目前對三七根腐病致病機制的研究多集中在病原菌的分離鑒定及轉錄組分析上，而對其代謝組的研究報道較少。鑒于此，本研究通過對3 個不同種鐮刀菌的菌絲進行轉錄組和代謝組的測序鑒定，對3 個鐮刀菌不同種的差異表達基因和差異積累代謝物進行分類、功能注釋和富集分析，旨在了解鐮刀菌不同種的基因表達模式和代謝特征，初步探究氨基酸類代謝物在鐮刀菌不同種中的差異表達情況，揭示其對三種鐮刀菌之間菌絲生長的影響，以期為三七鐮刀菌屬根腐病害的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

三七塊根購買于云南省文山市順巧經(jīng)營部，三七病株采自云南省文山州三七種植基地。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，無菌水1 000 mL。產(chǎn)孢培養(yǎng)基（Bilay’s）：磷酸二氫鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硝酸鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，淀粉0.2 g，無菌水1 000 mL。酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，無菌水1 000 mL。1/3馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：馬鈴薯50 g，葡萄糖5 g，無菌水750 mL。

蛋白胨、瓊脂、淀粉，購自北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

供試菌株分離自三七根腐病發(fā)病植株根部，其測序鑒定結果分別與尖孢鐮刀菌（F.oxysporium，F(xiàn)o）、層出鐮刀菌（F.proliferatum，F(xiàn)p）、腐皮鐮刀菌（F.solani，F(xiàn)s）的序列同源，同源性為100%，三者在GeneBank 的登錄號分別為OQ080022.1（F.oxysporium）、OP430570.1（F.proliferatum）、OQ080021.1（F.solani）。在PDA 培養(yǎng)基上活化備用。

1.2 試驗儀器

THZ-98C 恒溫振蕩器、DHP-9051 微生物培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；3K15臺式高速冷凍離心機，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；Axio Imager M2正置熒光顯微鏡，德國Carl Zeiss 公司；XS-212-202 雙目生物顯微鏡，蘇州勝視電子設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 真菌形態(tài)觀察 將病原真菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后觀察菌落形態(tài)。使用熒光顯微鏡對病原菌顯微特征進行觀察，用無菌注射器針頭挑取適量菌絲置于載玻片中央，滴加2滴無菌蒸餾水，用針頭輕輕撥動菌絲，以免菌絲成團，不利于觀察，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察分生孢子等性狀。

1.3.2 病原菌孢子萌發(fā)率的測定 取培養(yǎng)7 d的病原真菌，用無菌注射器劃成小塊置于產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，用封口膜密封，置于恒溫振蕩器（28 ℃、180 r·min-1）搖培5 d后，經(jīng)4 層475855-1R 無菌神奇濾布［西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］過濾，3 000 r·min-1慢速離心5 min，棄去上清液，加入無菌水清洗、離心，即得孢子懸浮液，最后配成1×106個·mL-1菌懸液。在無菌條件下，向每個離心管中加入1/3 PDB 2 mL 和菌懸液0.25 mL，每個處理3 個重復，置于恒溫振蕩器（28 ℃、180 r·min-1）黑暗搖培3、6、9 h。取菌懸液于載玻片上，在雙目生物顯微鏡下隨機選取5 個視野統(tǒng)計孢子總數(shù)及萌發(fā)孢子數(shù)，當芽管長度超過孢子長度的1/2 即為孢子萌發(fā)［13］，并計算孢子萌發(fā)率：

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100%。

1.3.3 病原菌的生長曲線測定 將活化好的菌株接入新的PDA 培養(yǎng)基，置于微生物培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d至菌絲長滿整個培養(yǎng)皿后，選取生長趨勢相同的3 種鐮刀菌，在無菌操作條件下，沿菌落邊緣用5 mm打孔器打取菌塊，接種于PDA 培養(yǎng)基中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個菌株設5個重復。自第2天起，用“十字交叉法”測量菌落直徑，連續(xù)測量7 d［14］。將所得數(shù)值繪制成折線圖，即得3種鐮刀菌的生長曲線圖。

1.3.4 病原菌孢子產(chǎn)量的測定 取1.3.3 中生物量一致的菌盤，用無菌注射器少量多次加入20 mL 無菌水沖洗菌盤，并將培養(yǎng)基上的菌絲輕輕刮下，再用4層無菌神奇濾布過濾2 次除去菌絲及雜質，最后用無菌水定容至30 mL，得孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計數(shù)板觀察并計算孢子數(shù)量。

1.3.5 病原菌對鮮三七致病力的測定 選取健康、大小均勻的三七塊根，清洗后切成5 mm厚的三七片，在75%乙醇中消毒1 min，用無菌水沖洗表面，再用1%次氯酸鈉消毒7 min，共2次，用無菌水沖洗表面。待表面水分稍干，用5 mm打孔器取在PDA培養(yǎng)基中生長良好的病原菌，倒置接種在三七片中間，置于水瓊脂培養(yǎng)皿中，密封放置于26 ℃培養(yǎng)箱中，觀察菌落情況，計算侵染率：

侵染率=菌圈面積/三七片面積×100%。

1.3.6 菌絲體的制備及取樣 參考1.3.2 的方法制備孢子懸浮液，取3 種鐮刀菌的純凈孢子懸浮液2 mL分別加入250 mL YEPD 培養(yǎng)基中，每個樣本3個重復，共計9 份樣品，恒溫振蕩器搖培4 d 后收集菌絲，立即用液氮冷凍，在-80 ℃條件下保存。

1.3.7 代謝組檢測與分析 將1.3.6 中取得的樣本送武漢邁維代謝生物科技有限公司進行測序分析。采用廣泛靶向的代謝組學方法對Fo、Fp 和Fs 菌絲體的3 個重復進行代謝物分析。通過R軟件（www.r-project.org）對樣本間代謝物進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和層次聚類分析；采用偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）篩選不同樣品間差異積累代謝物（differential accumulated metabolites，DAMs）。采取差異倍數(shù)值（fold change）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）模型的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）值相結合的方法來篩選差異代謝物，選取VIP值≥1、fold change≥2和fold change≤0.5的代謝物。利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行途徑富集分析。

1.3.8 轉錄組測序與分析 采用NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，美國）進行文庫構建，利用Illumina 平臺對每個樣本生成的mRNA文庫進行測序。所有轉錄本都從數(shù)據(jù)庫中進行了注釋，包括NCBI 非冗余蛋白序列（NCBI nonredundant protein sequences，NR）數(shù)據(jù)庫、基因本體（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫，同源蛋白簇（euKaryotic Orthologous Groups/Clusters of Orthologous Groups of proteins，KOG/COG）數(shù)據(jù)庫、Swiss-Prot（A manually annotated and reviewed protein sequence database）手動注釋和審查的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫、蛋白家族（Protein family，Pfam）數(shù)據(jù)庫。使用RSEM v1.3.1軟件對轉錄本的基因表達水平進行定量，基因表達水平采用每千個堿基轉錄物片段數(shù)/百萬片段（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped，F(xiàn)PKM）進行測量。利用DESeq2 v1.22.1 軟件對兩組之間的差異表達基因進行顯著性分析，差異表達基因的篩選條件為|log2Fold Change|≥1，且錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05。

1.4 統(tǒng)計分析

本研究中的每個樣本均設置3 個重復，采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Turkey檢驗，P＜0.05為差異顯著。本研究所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤”表示，結果圖選用Adobe Illustrator 2022和GraphPad Prism 9軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學特征

通過形態(tài)學觀察（圖1）結合顯微形態(tài)（圖2），可以得出尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌、腐皮鐮刀菌三者主要的區(qū)別，結果如表1所示。

表1 3種鐮刀菌的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of three Fusarium species

圖1 3種鐮刀菌的培養(yǎng)性狀Fig.1 The culture traits of three Fusarium species

圖2 3種鐮刀菌的顯微形態(tài)Fig.2 The micromorphology of three Fusarium species

2.2 不同病原菌的孢子萌發(fā)率

相同培養(yǎng)條件下，腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)最快，層出鐮刀菌次之，尖孢鐮刀菌最慢（圖3-A）。隨著培養(yǎng)時間的延長，孢子芽管逐漸增長，孢子萌發(fā)率增高。萌發(fā)3 h時，尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌、腐皮鐮刀菌三者的孢子萌發(fā)率分別是3.24%、5.62%、21.76%，腐皮鐮刀菌與尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌之間存在顯著差異（P＜0.05），而尖孢鐮刀菌與層出鐮刀菌之間孢子萌發(fā)率沒有顯著差異。萌發(fā)6 h時，三者的孢子萌發(fā)率沒有顯著差異。尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌在萌發(fā)9 h時具有顯著差異（P＜0.05）。

圖3 3種鐮刀菌的孢子萌發(fā)率、菌絲生長、孢子產(chǎn)量及致病力差異Fig.3 Differences in spore germination rate，hyphae growth，spore yield and pathogenicity of three Fusarium species

2.3 不同病原菌的菌絲生長

相同培養(yǎng)條件下，尖孢鐮刀菌菌絲生長較層出鐮刀菌、腐皮鐮刀菌快，腐皮鐮刀菌生長最慢，層出鐮刀菌次之（圖3-B）。從第1天開始，腐皮鐮刀菌與尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌相比開始呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。在第5天時，尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌、腐皮鐮刀菌三者的菌落直徑分別為63.5、60.0、53.2 mm，且尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌、腐皮鐮刀菌三者的菌落直徑具有顯著差異（P＜0.05）。

2.4 不同病原菌的孢子產(chǎn)量

將生物量一致的3 種病原菌菌盤用定量無菌水沖洗得到孢子懸浮液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下觀察。尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量4.425×106個·mL-1，層出鐮刀菌產(chǎn)孢量為3.375×106個·mL-1，腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量2.150×106個·mL-1（圖3-C），且三者的分生孢子產(chǎn)量具有顯著差異（P＜0.05）。上述結果表明，尖孢鐮刀菌的孢子產(chǎn)量最高，層出鐮刀菌次之，腐皮鐮刀菌最低。

2.5 侵染試驗結果

侵染試驗結果如圖3-D、E所示，接種4 d后，與對照組相比，尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌、腐皮鐮刀菌均能侵染三七，在菌落覆蓋范圍內三七出現(xiàn)了一定程度的腐敗。將3種病原菌對鮮三七的侵染力進行比較發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌的侵染率顯著高于層出鐮刀菌（P＜0.05），腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌對三七侵染率之間無明顯差異。

2.6 三個鐮刀菌種間的代謝差異

采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）分析方法對Fo、Fp、Fs 的菌絲進行代謝物鑒定。通過聚類和PCA 分析，將9 個樣本分成3 組，共檢測和鑒定出1 165 種代謝物（圖4）。PCA 分析結果顯示，在PC1×PC2 評分圖上，F(xiàn)o、Fp、Fs 三組之間表現(xiàn)出明顯的分離，這表明3 種鐮刀菌的代謝物存在較大差異，同時每個樣本的3 個生物學重復緊密聚集在一起，表明所測代謝組數(shù)據(jù)具有較高的可重復性。在檢測到的1 165 個代謝物中，可分為13 大類（圖5-A），其中1 001種代謝物被分為12個已知類；其余164種未知的代謝物被分配到“其他”組。共鑒定出屬于4 類的600 種初級代謝產(chǎn)物，主要的初級代謝產(chǎn)物是氨基酸及其衍生物、脂質，這些占總初級代謝產(chǎn)物的68%。共鑒定出401 種次生代謝產(chǎn)物，分為8 類，占總代謝物的34.4%。酚酸為主要次生代謝產(chǎn)物，其次為生物堿和黃酮。通過比較分析，發(fā)現(xiàn)3 種鐮刀菌中代謝物的差異主要體現(xiàn)在占比較大的氨基酸及其衍生物和脂質上。

圖4 基于主成分（PCA）和聚類熱圖的代謝產(chǎn)物差異分析Fig.4 Differential metabolite analysis on the basis of principal component （PCA） and clustering heat map

圖5 3種鐮刀菌中所有已鑒定的代謝產(chǎn)物和差異積累代謝產(chǎn)物Fig.5 All identified metabolites and DAMs in the three Fusarium species

為了比較3 種鐮刀菌之間的代謝物組成的差異，用VIP≥1.0、fold change≥2 和fold change≤0.5 的參數(shù)分析代謝物，結果顯示，在3 個可比較組中，共確定了963種差異代謝物（DAMs），通過Venn圖和柱形圖對篩選結果進行了說明（圖5-B、C）。在Fs 和Fo 之間有519 種差異代謝物，其中分別有243 和276 個代謝物在Fo中上調和下調；共有728中差異代謝物在Fs和Fp中被鑒定，包括Fp 中上調331 個、下調397 個；在Fo 和Fp中共有716種差異代謝物，其中分別有354、362個代謝物在Fp中上調和下調。

為了研究每個樣品的代謝特征，差異代謝物被分為相應的類別。結果如圖6 所示，在Fs vs.Fo 比較組中，與Fs相比，F(xiàn)o中大多數(shù)氨基酸及其衍生物、黃酮上調，而大多數(shù)脂質、核苷酸及其衍生物、酚酸類下調。在Fs vs.Fp 的比較中，初級代謝物和次級代謝物分別占差異代謝物的50.82%、36.40%，與Fs 相比，F(xiàn)p 中的大多數(shù)初級代謝產(chǎn)物下調；而在Fo vs.Fp 比較組中，共有380 種初級代謝物和243 種次級代謝物被鑒定為差異代謝物。其中，與Fo相比，F(xiàn)p中大多數(shù)脂質上調，而有機酸、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物一類的初級代謝產(chǎn)物下調，黃酮類、酚酸類的大多數(shù)次生代謝產(chǎn)物同樣下調。綜上，F(xiàn)o、Fp 與Fs 三者表現(xiàn)出不同的代謝組成；與另外兩個菌相比，F(xiàn)s 的初級代謝產(chǎn)物含量較高，特別是脂質和核苷酸及其衍生物；與Fs 相比，F(xiàn)p 的初級代謝產(chǎn)物含量較低；與Fp、Fs 相比，F(xiàn)o 含有較高的氨基酸及其衍生物，而脂質含量較低。

圖6 差異代謝物的分類和數(shù)量Fig.6 Classification and number of differential metabolites

2.7 三種鐮刀菌的轉錄組學分析

轉錄組分析結果表明，3 種鐮刀菌的基因表達水平不同（圖7-A）。為了檢驗轉錄組的差異，對3種鐮刀菌轉錄組進行配對比較，在配對比較中確定的DEGs數(shù)量如圖7-B、C 所示，在Fs 和Fo 比較組中，共檢測到16 325個DEGs，其中在Fo中，8 394個DEGs的表達量高于Fs，7 931 個DEGs 的表達量低于Fs。同樣，在Fs 和Fp的比較中共發(fā)現(xiàn)16 048個DEGs，其中8 482個DEGs的表達量高于Fs，7 566 低于Fs。在Fo 和Fp 的比較中共發(fā)現(xiàn)13 366 個DEGs，其中7 183 個在Fp 中的表達量高于Fo，6 183個DEGs在Fp中的表達量低于Fo。上述結果表明，不同鐮刀菌種的基因表達譜存在較大差異。

對Fo vs.Fp、Fs vs.Fo、Fs vs.Fp 3 組DEGs 的GO富集情況進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，在生物過程中，3 個比較組的DEGs 均顯著富集在細胞和代謝過程中；在細胞成分中，細胞解剖學實體注釋的基因相對較多；同時，結合、催化活性、轉運活性是影響分子功能的最大因素。在KEGG 注釋結果中，F(xiàn)o vs.Fp、Fs vs.Fo 和Fs vs.Fp 共3 個比較組中所有的差異基因均注釋到了代謝、細胞過程、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和生物系統(tǒng)5 個相關通路。在KEGG 富集分析結果中顯示，3 個比較組在代謝中的碳代謝、氧化磷酸化注釋基因最多；遺傳信息處理中核糖體、內質網(wǎng)中的蛋白質加工注釋基因最多；細胞過程中減數(shù)分裂-酵母注釋基因最多；環(huán)境信息處理中MAPK信號通路-酵母注釋基因最多；生物系統(tǒng)只有在長壽調節(jié)途徑-多物種被注釋。

為了進一步了解這些差異基因的生物學功能，基于KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異基因進行通路富集分析，選取富集最顯著的前20 條通路進行展示（圖8）。Fs 與Fo之間的DEGs 主要富集在氧化磷酸化（上調165 個、下調111 個）、核糖體（上調175 個、下調131 個）、剪接體（上調134 個、下調108 個）、TCA 循環(huán)（上調63 個、下調62個）等途徑（圖8-A）；Fs與Fp之間的DEGs主要富集在氧化磷酸化（上調145個、下調108個）、核糖體（上調179 個、下調124個）、剪接體（上調136個、下調107個）（圖8-B）；Fo與Fp之間的DEGs 主要富集在真核生物中的核糖體生物發(fā)生（上調73 個、下調89 個）、內質網(wǎng)中的蛋白質加工（上調121 個、下調104 個）（圖8-C）。結果表明，與核糖體、氧化磷酸化相關的基因表達量在3種鐮刀菌中的差異較大。

圖8 差異表達基因KEGG富集前20條通路Fig.8 Top 20 pathways for KEGG enrichment analysis of DEGs

2.8 轉錄組和代謝組聯(lián)合分析

為了解在轉錄水平上調控的代謝途徑，對DAMs和DEGs 的富集途徑進行了成對比較（圖9）。在Fs 和Fo比較組中，α-亞麻酸代謝、碳代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、花生四烯酸代謝都有重疊（圖9-A）；在Fs和Fp的比較中，亞油酸代謝、賴氨酸生物合成、精氨酸生物合成、α-亞麻酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝有重疊（圖9-B）；在Fo 和Fp 的比較中，不飽和脂肪酸的生物合成、精氨酸生物合成重疊（圖9-C）。

圖9 轉錄組和代謝組聯(lián)合分析Fig.9 Transcriptome and metabolome combined analysis

結合轉錄組學和代謝組學分析的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)氨基酸是3 個鐮刀菌不同種占比最高的差異代謝物，而與生命體生長發(fā)育相關的氨基酸，是真菌菌絲營養(yǎng)生長的唯一氮源，因此重點關注氨基酸代謝相關通路，分析氨基酸在不同種鐮刀菌間的差異表達情況。3 個鐮刀菌氨基酸代謝物積累差異的圖譜顯示（圖10），多數(shù)氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、精氨酸、鳥氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸（蛋氨酸）、天冬酰胺在Fo 中的含量較為豐富；與其他兩種鐮刀菌相比，半胱氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸在Fs中積累較多。

圖10 3個不同種鐮刀菌中氨基酸代謝的相關途徑Fig.10 Pathways related to amino acid metabolism in three different Fusarium species

3 討論

鐮刀菌是最具破壞性的植物病原菌之一［15］，能夠利用菌絲定殖植株根部進行侵染，最終導致作物產(chǎn)量下降，帶來嚴重的經(jīng)濟損失［16］。靶向和非靶向代謝組技術已用于鑒定不同生物體中的代謝物［17］。本研究采用廣泛靶向代謝組學方法檢測尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌和腐皮鐮刀菌中的代謝物，共檢測到1 165種代謝物，其中以氨基酸及其衍生物這一類別占比最高（圖5）。

氨基酸是組成蛋白質的基本元素，與蛋白質合成和真菌分生孢子萌發(fā)緊密相關［18-19］。天冬酰胺作為真菌蛋白質合成的優(yōu)質氮源，直接影響真菌分生孢子萌發(fā)和菌絲體的形成［20］。本研究中Fs 天冬酰胺的含量遠低于Fo、Fp（圖10），由此推測低含量的天冬酰胺可能是Fs 菌絲生長較Fo 與Fp 慢的因素之一。氨基酸種類同樣是影響真菌菌絲生長快慢的因素之一，研究表明纈氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和亮氨酸可顯著促進尖孢鐮刀菌的菌絲生長，其中蘇氨酸不利于尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)［21-24］。在本研究中，纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸等氨基酸在Fo 中的含量遠高于Fs和Fp（圖10）。相對豐富的纈氨酸、精氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸可能是促進Fo 菌絲生長的物質，而蘇氨酸可能抑制了Fo的孢子萌發(fā)。張俊英等［21］和王田濤等［25］研究發(fā)現(xiàn)天冬氨酸對腐皮鐮刀菌的菌絲生長具有抑制作用。Qiu 等［26］研究發(fā)現(xiàn)天冬氨酸和半胱氨酸對尖孢鐮刀菌的菌絲生長具有較強的抑制作用。張璐等［27］研究顯示，L-半胱氨酸能顯著抑制稻曲病菌的菌絲生長。本研究中，F(xiàn)s 天冬氨酸和半胱氨酸的含量遠高于Fo、Fp，結合前面的表型結果（圖3）推測天冬氨酸和半胱氨酸抑制了Fs 的菌絲生長。上述研究結果之間存在差異，可能是由于致病菌種類的不同，但這也說明了不同種類氨基酸對病原菌的生長發(fā)育產(chǎn)生不同的影響。根據(jù)以上結果推測，蘇氨酸和天冬氨酸有可能是Fo、Fp 和Fs 菌絲生長產(chǎn)生差異的相關代謝產(chǎn)物。

轉錄組常被用于分析代謝物積累的分子機制。在本研究中，分別在Fs vs.Fo、Fs vs.Fp、Fo vs.Fp 比較組中鑒定出16 325、16 048、13 366 個DEGs（圖7），每次比較中均存在大量DEGs，表明不同種的鐮刀菌基因表達譜存在較大差異。DEGs 的KEGG 富集分析結果表明（圖8），大量的DEGs 與核糖體、氧化磷酸化有關，推測翻譯的啟動和能量代謝相關途徑與3 種鐮刀菌菌絲生長差異有關；剪接體途徑在Fs與Fo和Fs與Fp的比較中顯著富集。PRP4 是編碼剪接體成分中唯一的激酶，Gao等［28］和董慧霞等［29］研究發(fā)現(xiàn)PRP4激酶基因的缺失或減少會使菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生受到抑制。說明病原真菌的菌絲生長和分生孢子生成受到PRP4激酶基因的調控。本研究發(fā)現(xiàn)編碼PRP4 激酶的基因表達在Fs 與Fo 和Fs 與Fp 的比較中顯著上調，在Fo 與Fp 的比較中顯著下調，因此推測，F(xiàn)o 菌絲生長速率及孢子產(chǎn)量與另外兩個菌相比顯著增加是因為Fo 中積累了更多的PRP4 激酶。綜合上述結果表明，鐮刀菌的菌絲營養(yǎng)生長和分生孢子的產(chǎn)生可能在轉錄水平上受到調控。

4 結論

本研究在尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌及腐皮鐮刀菌中檢測到大量的代謝物，并對不同種鐮刀菌的差異代謝物進行分類和功能分析，初步探究了氨基酸及其衍生物在不同種鐮刀菌中的差異表達。結果表明，尖孢鐮刀菌含有較高的氨基酸及其衍生物，腐皮鐮刀菌次之，層出鐮刀菌最少；發(fā)現(xiàn)氨基酸參與調控鐮刀菌的生長發(fā)育，包括菌絲生長、孢子萌發(fā)及分生孢子的產(chǎn)生。后續(xù)將對本研究中涉及的相關氨基酸進行進一步分析，以期更全面深入探究不同種鐮刀菌之間分子生物學差異的分子機制。