辣椒交替氧化酶全基因家族的鑒定及表達分析

宋 茜 帥 良 張賜楷 殷菲朧 楊丁招 曲德智 劉云芬，

（1廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006； 2南昌師范學院，化學與食品科學學院，江西 南昌 330023；3賀州學院食品與生物工程學院/廣西康養(yǎng)食品科學與技術重點實驗室，廣西 賀州 542899）

辣椒（CapsicumannuumL.）為茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum）一年或有限多年生的雙子葉植物，是生長于熱帶亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟作物和糧食作物，也是我國蔬菜的核心產(chǎn)業(yè)之一［1］。因其喜溫，不耐熱和冷，最適生長溫度為20～30 ℃，環(huán)境溫度過高或過低都會導致植株萎蔫，授粉率和坐果率降低，從而造成產(chǎn)量嚴重下降［2］。因此，挖掘與辣椒抗逆性相關的基因，對提高辣椒抗逆性具有重要意義。

植物線粒體電子傳遞鏈中包含兩種末端氧化酶，一種是常見的細胞色素氧化酶，另一種則是交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）［3-4］。交替氧化酶也稱抗氰氧化酶，是位于線粒體內膜的抗氰化物呼吸的末端氧化酶，廣泛存在于高等植物以及部分真菌和藻類的線粒體電子傳遞鏈中［5］。當細胞色素氧化酶被氰化物等抑制時，交替氧化酶通過繞過復合物Ⅲ和復合物Ⅳ，直接將泛醇氧化并將分子氧還原為水來提供和維持穩(wěn)態(tài)，此過程不產(chǎn)生腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），大部分能量以熱量的形式消散［6-7］。AOX由高等植物中一個小的多基因家族編碼，該基因家族可根據(jù)序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育關系分為兩個亞家族，即AOX1和AOX2［8］。AOX1和AOX2存在于雙子葉植物中，而單子葉植物中僅存在于AOX1［9］。據(jù)報道，AOX1 參與調節(jié)植物各種生物和非生物脅迫，而AOX2 則在發(fā)育上表達［10］。有證據(jù)表明，某些植物中的AOX2 也參與響應滲透脅迫等非生物脅迫［11］。如DcAOX2a在胡蘿卜（DaucuscarotaL.）根的次生生長和冷脅迫響應中具有雙重作用［12］；IbAOX1a和IbAOX1b參與甘薯（Ipomoea batatasL.）低溫脅迫［9］；AtAOX1d響應擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）砷脅迫［13］；原花青素通過下調荔枝（Litchi chinensisSonn.）果皮和果肉LcAOX1的表達來降低呼吸速率，進而延緩荔枝褐變［14］。同時AOX介導的信號傳導和代謝功能在植物生長發(fā)育、衰老、死亡中也起著重要作用。抑制AOX活性顯著影響了番木瓜愈傷組織的分化，并完全抑制了體細胞胚的分化，證明AOX對番木瓜體細胞胚分化至關重要［15］。此外，外源H2S通過激活抗氰呼吸進而促進擬南芥種子萌發(fā)［16］。Oliveira等［7］研究發(fā)現(xiàn)，AOX途徑還參與木瓜后熟。以上研究表明，AOX在植物的生長發(fā)育以及抗逆性中發(fā)揮著重要作用。

到目前為止，已從擬南芥、水稻、玉米、毛竹等植物中分離鑒定出AOX基因［17-19］，但關于辣椒AOX 基因家族的研究仍鮮有報道。鑒于此，本研究通過Blastp 結合結構域篩選的方法，以擬南芥蛋白序列為參考序列從辣椒基因組檢索鑒定出交替氧化酶基因相關家族成員，并對這些家族成員基因進行了生物信息學、組織特異性以及非生物脅迫表達分析，以期為后期研究AOX功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本研究采用中椒6 號辣椒種子為試驗材料，購自賀州市種子公司。Quick RNA Isolation Kit植物總RNA提取試劑盒和SuperScript cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒均購自北京華越洋生物科技有限公司；實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑購自加拿大abm公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 樣品處理

辣椒種子經(jīng)浸泡過夜后，于（28±1）℃條件下催芽，出芽后播種于塑料營養(yǎng)缽，置于恒溫培養(yǎng)箱中養(yǎng)護，養(yǎng)護條件為：溫度（25±1）℃，光照16 h。待植株長至5～6片真葉時，采集其根、莖、葉，于花期采集辣椒花，每個組織樣品分成3 份，用于不同組織熒光定量分析。選取長勢良好、長勢基本一致的幼苗（約40 d）進行高、低溫脅迫和植物激素處理。分別設置低溫脅迫［（4±1）℃］［20］、高溫脅迫［（42±1）℃］、脫落酸（abscisic acid，ABA）處理（30 μmol·L-1）［21］和赤霉素（gibberellins，GA）處理（150 mg·L-1）［22］，以正常室溫栽培下清水澆灌作為對照（CK）。每組處理10棵幼苗，每個處理設3 次重復。經(jīng)高溫、低溫脅迫處理0、1、2和4 h后分別取辣椒第3～第4 片葉，激素處理0、2、4 和6 h 后取辣椒第3～第4 片葉，用于后續(xù)基因定量分析。辣椒組織樣品經(jīng)液氮速凍后立即放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 植物總RNA的提取及cDNA的合成

采用植物總RNA 提取試劑盒提取辣椒不同組織的總RNA，具體操作方法參照說明書。使用超微量分光光度計（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。以提取的總RNA為模板，利用反轉錄試劑盒合成cDNA，合成方法參照說明書，合成的cDNA于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CaAOXs的表達分析

以CaActin為內參，所用熒光定量引物詳細信息見表1，CaAOXs的相對表達量采用2－△△Ct法計算。每個樣品的表達量均為3次重復的平均值。

表1 CaAOXs的qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences of CaAOXs

1.5 辣椒AOX基因家族鑒定

辣椒的基因組數(shù)據(jù)從NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得，并從NCBI 數(shù)據(jù)庫中搜索下載擬南芥的5 個AOX 蛋白序列（AT1G32350、AT3G22360、AT3G22370、AT3G27620 和AT5G64210）。以擬南芥的AOX 蛋白序列作為參考序列，利用TBtools 2.012 與辣椒基因組中進行Blastp 比對。將所獲得的候選序列基于AOX 結構域進行進一步比對篩選。根據(jù)在進化樹上的分類及其在染色體上的位置信息對篩選后的辣椒AOX基因家族成員進行命名。

1.6 生物信息學分析

生物信息學分析參考帥良等［23］的方法進行。使用在線分析工具ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）對辣椒AOX 家族蛋白質的分子量、氨基酸數(shù)、理論等電點（pI）、穩(wěn)定性以及親/疏水性等理化性質進行分析統(tǒng)計。使用TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進行跨膜結構分析；SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）進行信號肽預測；PRABI（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行蛋白質二級結構分析；SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測蛋白質三級結構。利用MEGA7 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹；通過MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）預測保守基序；利用Plant CARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析辣椒AOX啟動子區(qū)域順式作用元件并通過生物信息學分析工具TBtools 對上述結果進行分析與可視化。

1.7 統(tǒng)計分析

使用Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理和分析，使用Origin 8.5 作圖，并使用Adobe Illustrator 2022 軟件進行圖形美化和編輯。

2 結果與分析

2.1 辣椒全基因組的AOX 基因鑒定及其蛋白質理化性質分析

通過Blastp 結合結構域篩選的方法，從辣椒基因組搜索鑒定出AOX基因家族成員，最終得到12個辣椒AOX基因序列，分別命名為CaAOX1c11、CaAOX1a19和CaAOX1b11、CaAOX2d11、CaAOX2a16、CaAOX2a11、CaAOX2c13、CaAOX2a18、CaAOX2b13、CaAOX2a13、CaAOX2a22、CaAOX2b19。

使用ExPASy中的Protparam模塊預測AOX蛋白的理化性質（表2），結果表明12 個辣椒AOX 蛋白的氨基酸數(shù)為146～513；理論等電點為4.41～8.80，表明12 個CaAOXs 蛋白中既有酸性蛋白又存在堿性蛋白；除CaAOX1b11、CaAOX1c11、CaAOX2a11、CaAOX2a13 為穩(wěn)定的親水性蛋白，以及CaAOX2c13 為穩(wěn)定的疏水性蛋白外，其余AOX蛋白均為不穩(wěn)定的親水性蛋白。CaAOXs蛋白跨膜結構和信號肽預測結果表明，僅有3 個CaAOXs 蛋白（CaAOX2b13、CaAOX2a11 和CaAOX2c13）存在跨膜結構，且CaAOXs 蛋白均無信號肽，表明CaAOXs 蛋白不是分泌性蛋白。染色體定位結果表明，12 個CaAOXs分布在辣椒的6 條染色體上，其中CaAOX1b11、CaAOX1c11、CaAOX2a11和CaAOX2d11位于11 號染色體，CaAOX2a13、CaAOX2b13和CaAOX2c13位于13 號染色體，19 號染色體上包含CaAOX1a19和CaAOX2b19；CaAOX2a16、CaAOX2a18和CaAOX2a22則分別位于16、19和22號染色體，暗示CaAOXs可能具有不同的功能性質。亞細胞定位預測結果顯示，CaAOX2a22 定位于葉綠體；CaAOX2d11 定位于核；CaAOX2b19 定位于細胞質或者線粒體；CaAOX2a16 則定位于線粒體或者核，其余的AOX 蛋白均定位于線粒體。這表明AOX蛋白可能在線粒體中起著重要作用。

2.2 植物AOX蛋白進化分析

對擬南芥（5 個，AtAOXs）、水稻（3 個，OsAOXs）、甘薯（2 個，PeAOXs）、番茄（2 個，SlAOXs）以及辣椒12 個AOX 蛋白的氨基酸序列使用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，結果如圖1 所示，24 個AOX 蛋白可分為AOX1 和AOX2 兩個亞家族，其中辣椒的CaAOX1c11、CaAOX1a19 和CaAOX1b11 隸屬于AOX1 亞族，而其余9個蛋白均屬于AOX2亞族。此外，辣椒與番茄同為茄科親緣關系比較接近，與擬南芥、甘薯以及水稻親緣關系較遠。

圖1 CaAOXs系統(tǒng)進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of CaAOXs

2.3 CaAOXs蛋白二級結構及三級結構預測分析

使用PRABI 對CaAOXs 蛋白二級結構進行預測，結果如表3 所示，α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲在CaAOX1 亞族蛋白中分別占49.58%～60.99%、4.40%～6.27%、9.72%～13.73% 和22.53%～31.37%；在CaAOX2 亞族蛋白的二級結構中分別占45.85%～63.70%、3.92%～9.34%、8.96%～17.51%和19.18%～36.26%。

表3 辣椒AOX蛋白二級結構預測分析Table 3 Secondary structure prediction of peper AOX protein

通過SWISS-MODEL預測辣椒12個AOX蛋白三級結構，結果如圖2 所示，除CaAOX2b19 編碼的蛋白質三級結構差異較大外，其余的CaAOXs 蛋白三級結構相似。

圖2 辣椒AOX蛋白三級結構預測結果Fig.2 The tertiary structure prediction results of pepper AOX protein

2.4 CaAOXs蛋白結構域分析

通過對辣椒12 個交替氧化酶蛋白序列進行結構分析發(fā)現(xiàn)（圖3），辣椒AOX 蛋白序列在C 端十分保守，僅在N 端有較小差異，且CaAOXs 蛋白均含有典型的PLN02478 結構域。CaAOX2a11 和CaAOX2a16 除含有典型結構域外，還含有PHD_SF superfamily 結構域。CaAOX2b19 不僅含有典型結構域，還包含DUF4219 和Glycosyltransferase_GTB-type superfamily 結構域，這一點與CaAOXs蛋白三級結構分析一致。由圖3可看出，除Motif8 外，其余保守基序與AOX 特征結構域-PLN02478密切相關。進一步分析發(fā)現(xiàn)，大部分保守基序位于AOX 結構域的C 端，這可能與CaAOXs 功能有關。從出現(xiàn)頻率來看，Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif6 和Motif10 的出現(xiàn)頻率較高，幾乎涵蓋了所有亞族，表明Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif6 和Motif10是CaAOXs的重要保守基序。此外，CaAOX1亞族中的保守基序組成和排列方式基本相同，推測其基因功能可能相似。從整體來看，CaAOXs 所含保守基序數(shù)量、類型、排列上的差異，可能揭示了各個基因具有不同的功能。結合蛋白質保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，三級結構相似的CaAOXs 蛋白在C 端具有相似的蛋白結構域，而CaAOX2b19 編碼的蛋白質在C 端具有不同的結構域，導致CaAOX2b19編碼的蛋白質三級結構差異較大。

圖3 辣椒AOX蛋白質結構分析Fig.3 Protein structure analysis of pepper AOX

2.5 辣椒AOX順式作用元件分析

利用在線網(wǎng)站PlantCARE 對12 個CaAOXs啟動子區(qū)域進行順式作用元件預測，結果如表4所示，CaAOXs啟動子區(qū)域含有多種功能調控元件，如脫落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、生長素、水楊酸等激素響應元件；缺氧、低溫、干旱、防御和應激等逆境脅迫響應元件以及光、厭氧、晝夜節(jié)律等環(huán)境適應元件。除此之外還含有分生組織誘導表達元件。由表4 分析結果可知，脫落酸響應元件幾乎涵蓋所有CaAOXs啟動子區(qū)域，表明CaAOXs可能積極響應脫落酸。以上結果表明，CaAOXs啟動子區(qū)域含有脫落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、生長素和水楊酸等激素響應元件，說明CaAOXs的表達受激素的影響；此外，CaAOXs啟動子區(qū)域還含有缺氧、低溫、干旱以及防御和應激等逆境脅迫響應元件，由此推測CaAOXs可能響應逆境脅迫與激素應答，同時也暗示了CaAOXs可能具有多種功能。

表4 CaAOXs 啟動子元件分析Table 4 Analysis of CaAOXs promoter elements

2.6 CaAOXs在不同組織的表達分析

對CaAOXs在辣椒不同組織中的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，CaAOXs在辣椒的根、莖、葉和花中均有表達，且具有較為明顯的組織表達特異性（圖4）。CaAOXs在花中的表達量顯著上調（P＜0.05），其中CaAOX2a13、CaAOX2a11和CaAOX2c13在花中高表達；CaAOX2a22、CaAOX2a13和CaAOX1c11在葉片中高表達；CaAOX2a22在莖中表達量最高；根中除CaAOX2d11表達下調外，其余表達均上調。不同CaAOXs在組織中表達的差異性表明了CaAOXs在功能上存在分化。

圖4 CaAOXs在不同組織中的表達熱圖Fig.4 Expression heatmap of CaAOXs in different tissues

2.7 CaAOXs在非生物脅迫下的表達分析

為研究CaAOXs在非生物脅迫下的表達模式，分別對辣椒進行了高溫［（42±1）℃］、低溫［（4±1）℃］、常溫［（25±1）℃］以及噴施GA、ABA處理。不同溫度處理結果如圖5-A所示，CaAOX2a22在不同溫度處理下表達均上調，但低溫和高溫處理其表達量上調更明顯（P＜0.05），表明CaAOX2a22對不同溫度的敏感性不同。CaAOX1c11在低溫和高溫脅迫下表達均顯著上調（P＜0.05），其中對高溫脅迫的響應更為明顯，其表達量分別是常溫處理的25.21、114.25、58.40 倍，暗示CaAOX1c11可能在辣椒遭受高溫脅迫時發(fā)揮重要作用。同樣CaAOX2b19均響應了高、低溫脅迫，表明CaAOX2b19參與響應辣椒高、低溫脅迫。此外，CaAOX1b11響應了高溫脅迫；CaAOX2d11、CaAOX2b13和CaAOX2c13在常溫下表達上調。以上分析結果表明CaAOXs對不同溫度的敏感性不同，并且可能在辣椒高、低溫脅迫下發(fā)揮著不同的功能。

圖5 CaAOXs 在非生物脅迫處理下的表達熱圖Fig.5 Hotmap of CaAOXs expression under abiotic stress treatment

辣椒葉片經(jīng)激素處理后，CaAOXs的表達熱圖如圖5-B 所示。多數(shù)CaAOXs在GA 和ABA 處理后表達上調，這與順式作用元件分析中CaAOXs響應GA 和ABA 相一致。GA 處理除CaAOX2a22、CaAOX2c13、CaAOX1b11和CaAOX2b13表達下調外，其余CaAOXs表達均上調。其中CaAOX2d11、CaAOX2a13、CaAOX2a16、CaAOX2a18、CaAOX2a11和CaAOX1a19在GA 處理2 h后表達顯著上調（P＜0.05）；噴施ABA 后除CaAOX2c13和CaAOX2b19表達下調外，其余表達均上調。ABA 處理4 h 時為CaAOXs的表達高峰，均明顯響應了ABA 處理（P＜0.05）。從整體上看，ABA 誘導的表達量顯著高于GA，表明CaAOXs均能響應辣椒GA、ABA，且對ABA的響應更強烈。

3 討論

在高等植物中，AOX基因由細胞核編碼，AOX蛋白家族由兩個亞族（AOX1和AOX2）組成，在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。目前已對高等植物（水稻［24］、香蕉［25］等）、真菌（糙皮側耳［26］、埃默森小芽枝霉［27］等）、細菌（嗜芳烴新鞘氨醇菌［28］、大腸桿菌［29］等）以及部分藻類（萊茵衣藻［30］等）進行了分析鑒定。本研究通過生物信息學方法，從辣椒全基因組篩選得到12個AOX基因，分別為CaAOX1c11、CaAOX1a19、CaAOX1b11、CaAOX2d11、CaAOX2a16、CaAOX2a11、CaAOX2c13、CaAOX2a18、CaAOX2b13、CaAOX2a13、CaAOX2a22、CaAOX2b19。

系統(tǒng)發(fā)育結果表明，辣椒AOX基因同樣分屬為AOX1和AOX2兩個亞家族，該結果與前人研究一致［19］。AOX 基因家族的構成因植物物種而異。例如，擬南芥有5 個AOX基因，分別為AtAOX1a、AtAOX1b、AtAOX1c、AtAOX1d和AtAOX2［17］；甘薯包含3個AOX基因：IbAOX1a、IbAOX1b和IbAOX2［31］；水稻AOX基因僅由AOX1 亞族組成（OsAOX1a、OsAOX1b和OsAOX1c）［18］。進一步分析結果表明，不同植物中AOX基因具有多樣性，其所含亞族與基因數(shù)量存在差異。將不同物種的AOX基因編碼蛋白構建進化樹分析發(fā)現(xiàn)，AOX 在不同物種中具有較高的保守性，且同一亞族的同源性較高，同科植物的同源性也較高。說明同科植物的AOX 蛋白可能具有相似的功能。

CaAOX 家族成員在不同組織器官的表達譜表明，CaAOXs可能具有特異和冗余功能，分析發(fā)現(xiàn)CaAOXs在4 個組織中均有表達，但表達水平差異顯著（P＜0.05）。CaAOXs在花和葉中整體表達上調，且花中的表達量高于葉；不同CaAOXs在莖中的表達趨勢不同，表明CaAOXs具有組織特異性。前人研究表明，AOX1亞族受大多數(shù)非生物脅迫誘導且響應強烈，如干旱、高溫、高鹽、低溫、重金屬等［25，32-33］。在本研究中，辣椒AOX1亞家族成員CaAOX1c11、CaAOX1a19和CaAOX1b11均響應了低溫、高溫、GA 以及ABA 脅迫的誘導。同樣AOX2 亞家族中的成員也響應了低溫、高溫、GA 以及ABA 處理，這證實了AOX2 不僅在植物發(fā)育中有所表達還參與響應非生物脅迫。順式作用元件的分析結果暗示了辣椒在脅迫處理（低溫和高溫）和激素應答（GA和ABA 的處理）下有較強的表達。Chen 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，黃體酮有效提高了甘薯塊莖中IbAOX1的轉錄水平和AOX 活性，維持了細胞膜完整性并調節(jié)抗氧化系統(tǒng)和脯氨酸代謝來降低貯藏過程中甘薯冷害的發(fā)生。同樣Kang 等［3］研究表明，當番茄（Solanum lycopersicumL.）受到干旱脅迫時，ABA 迅速積累誘導上調SlAOX1a的表達，有助于清除過多的ROS 以提高番茄耐旱性。LeAOX表達水平降低的番茄植株表現(xiàn)出成熟延遲，類胡蘿卜素、呼吸作用和乙烯生成減少以及成熟相關基因表達下調。相反，過表達LeAOX1a的番茄果實表現(xiàn)出累積更多的番茄紅素，表明LeAOX1a可能在番茄成熟過程中起重要作用［35］。此外，AtAOX1a的過表達提高了擬南芥對較高劑量UV-B 的適應［36］。由此可推測，CaAOXs在辣椒生長發(fā)育、逆境脅迫與激素應答反應中發(fā)揮重要作用。

4 結論

本試驗共從辣椒全基因組鑒定出12 個CaAOXs，并對其基因家族、基因結構等生物信息及其在辣椒組織、逆境脅迫以及激素應答中的表達模式進行了分析。初步預測CaAOXs在辣椒中的基因功能——參與辣椒的生長發(fā)育，在辣椒逆境脅迫和激素應答中發(fā)揮重要作用。因此，CaAOXs可作為辣椒非生物脅迫抗性轉基因育種的候選基因。