和血柔肝方通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路調(diào)控自噬相關(guān)蛋白改善大鼠肝纖維化機(jī)制研究

牛麗娜,竇 婧,馬 燕,張 冰,王 尹,王曉忠

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830054;2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830099)

肝纖維化是由多種慢性肝病進(jìn)展至肝硬化、肝衰竭甚至肝癌的中間過程,其特征為細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的合成和降解失衡,導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性ECM過度沉積[1]。肝纖維化經(jīng)過治療后肝組織病理學(xué)可明顯改善,而肝硬化預(yù)后較差。因此早期診斷、及時治療是防止肝纖維化進(jìn)展的重要手段。自噬是一種重要的降解機(jī)制,可降解受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì),是維持體內(nèi)平衡的重要機(jī)制。研究表明,自噬功能障礙可加重肝纖維化[2-5]。因此,調(diào)節(jié)自噬活性在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中至關(guān)重要,西醫(yī)往往針對單個基因/蛋白質(zhì)進(jìn)行干預(yù)[6-8]。中醫(yī)藥治療肝纖維化則具有多靶點(diǎn)、多途徑等獨(dú)特優(yōu)勢,在治療肝纖維化中效果突出,其作用在國內(nèi)外研究中得到廣泛認(rèn)可。

和血柔肝方是結(jié)合全國名中醫(yī)樂德行及全國名老中醫(yī)曾斌芳教授臨證經(jīng)驗并依據(jù)新疆地區(qū)氣候特點(diǎn)因地制宜所擬,為新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院肝病科的協(xié)定處方。該方以“和血柔肝、疏肝健脾”為法則。前期研究表明,和血柔肝方治療乙肝肝纖維化效果突出,可以提高肝纖維化的逆轉(zhuǎn)率,但具體作用機(jī)制尚不明確。本課題組進(jìn)一步通過和血柔肝方干預(yù)肝纖維化大鼠模型,結(jié)果表明,和血柔肝方最高劑量組療效最佳,可明顯改善大鼠肝臟炎癥及肝纖維化程度[4]。同時,本課題組對肝纖維化大鼠肝組織中l(wèi)ncRNA運(yùn)用RNA測序發(fā)現(xiàn)[5],和血柔肝方可能通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/ 蛋白激酶B(Akt)信號通路參與肝纖維化的過程。而NF-κB是PI3K/Akt信號通路的下游分子,其誘導(dǎo)自噬蛋白如Beclin-1和LC3-Ⅱ活化后表達(dá)增加導(dǎo)致自噬發(fā)生[9-12]。近年來,自噬參與肝纖維化的機(jī)制逐漸被認(rèn)識,然而自噬是否促進(jìn)肝纖維化,抑制自噬是否緩解肝纖維化仍存在諸多爭議。本研究擬通過動物實驗,觀察和血柔肝方通過調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白,從而改善大鼠肝纖維化的作用機(jī)制,豐富中醫(yī)藥治療肝纖維化的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：40只7～8周齡SPF級雄性SD大鼠,體重為(160±10)g,購于湖北省實驗動物研究中心[許可證號：SCXK(鄂)2020-0018]。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為空白對照組、模型組、秋水仙堿組與和血柔肝方最佳劑量組(本課題組前期藥效學(xué)研究結(jié)果表明和血柔肝方最高劑量組療效最優(yōu),故設(shè)和血柔肝方最高劑量組為最佳劑量組),每組各10只。

1.1.2 藥物與試劑：和血柔肝方顆粒劑由柴胡、香附、當(dāng)歸、白術(shù)、丹參、桃仁、黨參、白芍、茯苓、鱉甲組成,購于四川國藥天江藥業(yè)有限公司。取約1220 g免煎顆粒,加入329 ml溫水,充分溶解。濃度約為3.71 g/ml,即為和血柔肝方最佳劑量組。秋水仙堿片,購于上海麥克林生化科技股份有限公司,貨號C815210,0.5 mg/片。取6.58 mg秋水仙堿粉劑,加入329 ml的純水,充分溶解,濃度為0.02 mg/ml。四氯化碳購于上海麥克林生化科技股份有限公司,貨號C805332。蘇木素(Sigma,貨號H9627);伊紅Y(國藥集團(tuán),貨號71014544);RNA提取液(維百奧北京生物科技有限公司,型號15596-026);RT-qPCR試劑,定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)試劑盒(南京維諾贊生物科技股份有限公司,貨號R223-01,Q111-02);DNA聚合酶(天根生化科技有限公司,貨號ET105-02);磷酸酶抑制劑,RIPA裂解液(大連美侖生物技術(shù)有限公司,貨號MB12707,MA0151);BCA蛋白濃度測定試劑盒(廣州捷倍斯生物科技有限公司);兔多抗PI3K(美國affinity公司,貨號AF6241);兔多抗Akt(美國affinity公司,貨號AF6261);兔多抗P65(美國affinity公司,貨號AF5006);兔多抗p-PI3K(美國affinity公司,貨號AF3241);兔多抗p-Akt(美國affinity公司,貨號AF0016);兔多抗p-P65(美國affinity公司,貨號AF2006);兔單抗Beclin-1(美國affinity公司,貨號ab210498);小鼠單抗LC3(美國affinity公司,貨號83506S)。

1.1.3 實驗儀器：臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司,型號H1-16KR);全自動生化分析儀(深圳雷杜,型號Rayto);PCR儀(杭州米歐儀器有限公司,型號PR-96);垂直電泳槽(北京六一儀器廠,型號DYCZ-24DN);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(杭州申花科技有限公司,型號SH-523)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立：40只SPF級SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為空白對照組、模型組、秋水仙堿組與和血柔肝方最佳劑量組,每組各10只。除空白對照組外,其余各組每周2次腹腔注射60% CCl4溶液(CCl4∶橄欖油=3∶2),注射劑量為1.5 ml/kg,以構(gòu)建肝纖維化大鼠模型,為期8周。造模結(jié)束前1周,每組隨機(jī)選取1只大鼠處死取肝組織,HE及Masson染色評估大鼠肝組織病理改變。

1.2.2 給藥方法：空白對照組與模型組以0.9%氯化鈉溶液灌胃,劑量為2 ml/(100 g·d);秋水仙堿組予秋水仙堿藥液灌胃,劑量為0.2 mg/(kg·d);和血柔肝方最佳劑量組以和血柔肝方灌胃,劑量為37.08 g/(kg·d),連續(xù)灌胃4周。

1.2.3 肝功能指標(biāo)檢測：灌胃結(jié)束,麻醉大鼠后腹主動脈采血,使用全自動生化分析儀檢測血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。

1.2.4 肝組織病理學(xué)觀察：解剖大鼠取肝組織,用福爾馬林固定后,進(jìn)行修剪、組織脫水及透明、浸蠟后包埋、切片脫蠟、染色、封片后采用光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.2.5 RT-qPCR技術(shù)檢測大鼠肝組織PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表達(dá)水平：取大鼠肝組織,采用Trizol法提取RNA,后將RT逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,反應(yīng)條件：50 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃、10 min,逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR測定,2-ΔΔCt法處理結(jié)果。引物序列見表1。

1.2.6 Western blot法檢測大鼠肝組織PI3K、Akt、NF-κB P65、p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平：取大鼠肝組織,將少量的剪碎的組織塊置于2 ml EP管中,加干凈的鋼珠。加200 μl裂解液提取總蛋白,BCA測定蛋白濃度,與緩沖液混合后放入沸水中變性,將預(yù)制膠固定到電泳槽上,儲液池中倒入電泳液,至溴酚藍(lán)到凝膠底部進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的封閉液浸泡PVDF膜,室溫?fù)u床封閉2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗(PI3K 1∶1000、Akt 1∶1000、NF-κB P65 1∶1000、p-PI3K 1∶1000、p-Akt 1∶1000、p-NF-κB P65 1∶1000、LC3-Ⅱ 1∶1000、Beclin-1 1∶1000)4 ℃孵育過夜,TBST充分洗滌PVDF膜5次,加入二抗。將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液混勻充分反應(yīng)開始曝光,進(jìn)行顯影、定影。用IPP分析膠片灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST水平比較 見表2。與模型組比較,和血柔肝方最佳劑量組、秋水仙堿組大鼠血清ALT與AST水平均明顯降低(P<0.05);與秋水仙堿組比較,和血柔肝方最佳劑量組大鼠血清的ALT和AST水平稍有升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較(U/L)

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) HE染色結(jié)果表明,與空白對照組比較,模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的病變,肝血竇毛細(xì)血管化,匯管區(qū)纖維組織增生,可見大量炎性細(xì)胞浸潤,產(chǎn)生假小葉;與模型組比較,和血柔肝方最佳劑量組及秋水仙堿組大鼠肝細(xì)胞受損可見明顯緩解,肝臟結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn),炎性細(xì)胞浸潤及纖維增生顯著改善(圖1)。

A：空白對照組;B：模型組;C：秋水仙堿組;D：和血柔肝方最佳劑量組

Masson染色結(jié)果表明,模型組大鼠肝組織可見大量寬大的膠原纖維沉積,假小葉形成;和血柔肝方最佳劑量組及秋水仙堿組大鼠肝組織膠原纖維沉積明顯減少。結(jié)果表明和血柔肝方可改善肝纖維化,效果顯著(圖2)。

A：空白對照組;B：模型組;C：秋水仙堿組;D：和血柔肝方最佳劑量組

2.3 各組大鼠肝臟PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表達(dá)水平比較 見表3。與空白對照組比較,模型組大鼠肝組織PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,和血柔肝方最佳劑量組大鼠肝組織中PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);秋水仙堿組大鼠肝組織中PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)水平明顯降低,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠肝臟PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表達(dá)水平比較

2.4 Western blot法檢測大鼠肝組織PI3K、NF-κB P65、Akt、p-PI3K、p-NF-κB P65、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平 與空白對照組比較,模型組、秋水仙堿組、和血柔肝方最佳劑量組的PI3K、Akt、p-PI3K、NF-κB P65、p-NF-κB P65、p-PI3K、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beclin-1均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,和血柔肝方最佳劑量組、秋水仙堿組的PI3K、Akt、NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1均明顯降低(P<0.05),見表4(圖3)。

圖3 各組大鼠肝組織PI3K、Akt、NF-κB P65、p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)電泳圖

表4 各組大鼠肝組織PI3K、NF-κB P65、Akt、p-PI3K、p-NF-κB P65、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

肝纖維化是慢性肝損傷發(fā)生時的瘢痕修復(fù)反應(yīng)。在炎癥的初始階段,各種駐留的肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等被激活,增加細(xì)胞因子及活化產(chǎn)物的產(chǎn)生,如TNF-α、TGF-β[13-16]。這些因子及活化產(chǎn)物可調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活性,其中PI3K/Akt/NF-κB信號通路是最重要的途徑之一：肝損傷后,大量的細(xì)胞因子可使肝臟中的PI3K活化。PIP3下游的PDK1可使Akt蛋白的Thr308磷酸化,在磷脂酰肌醇依賴蛋白的激發(fā)下Akt被轉(zhuǎn)化為p-Akt,進(jìn)而使Akt活化。隨后活化的Akt激活核因子κB等下游相關(guān)靶蛋白,NF-κB調(diào)控免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)具有重要作用。NF-κB不斷活化,再一步調(diào)控下游的靶基因表達(dá)如自噬標(biāo)記性蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1從而引發(fā)自噬誘導(dǎo)脂滴消化,促進(jìn)肝纖維化。有研究已經(jīng)證實,抑制HSC中NF-κB途徑調(diào)節(jié)的自噬是減輕肝纖維化的潛在治療手段[17-20]。同時也有研究證明,槲皮素通過激活PI3K/Akt信號通路來調(diào)控細(xì)胞自噬,從而減輕CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化程度[21-23]。

近年來,自噬參與肝纖維化的機(jī)制逐漸被認(rèn)識[3,24]。自噬是一種細(xì)胞自我降解過程,對于在發(fā)育的關(guān)鍵時期平衡能量來源和應(yīng)對營養(yǎng)壓力非常重要。自噬在肝纖維化中的作用取決于細(xì)胞的類型和疾病的階段：肝細(xì)胞自噬可減少炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗肝纖維化作用;但HSC自噬通過促進(jìn)脂滴降解為HSC激活、分化及分泌ECM提供能量被認(rèn)為是促進(jìn)肝纖維化的關(guān)鍵事件。自噬是否促進(jìn)肝纖維化,抑制自噬是否緩解肝纖維化仍存在諸多爭議：一方面,自噬通過抑制炎癥反應(yīng)減輕肝纖維化;另一方面自噬可促使HSC活化,從而加速肝纖維化進(jìn)程。故仍需要更多證據(jù)來明確自噬在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

當(dāng)前,尚缺乏療效顯著的抗肝纖維化藥物,臨床主要是針對病因來減少炎癥與肝損傷。中醫(yī)尚無“肝纖維化”病名,但依照其癥狀當(dāng)歸屬“積聚”“脅痛”等范疇?！疤摀p生積”為其基本病機(jī),肝臟功能受損,日久致氣血運(yùn)行遲緩,氣滯血瘀最終導(dǎo)致肝纖維化。近年來,經(jīng)典的中藥復(fù)方如扶正化瘀膠囊、復(fù)方鱉甲軟肝片、安絡(luò)化纖丸等對治療肝纖維化取得顯著效果[13]。中醫(yī)藥在抗肝纖維化的治療中,效果明確,且不良反應(yīng)小[25]。和血柔肝方以逍遙散為基礎(chǔ)方,加用黨參、白術(shù)、鱉甲、桃仁。因新疆地區(qū)氣候干燥,故方中重用滋陰補(bǔ)血藥物。方中當(dāng)歸、白芍同為君藥,有血和則肝和之意;柴胡為臣藥,行氣疏肝;白術(shù)、茯苓益氣健脾,且能預(yù)防肝病傳脾;桃仁、丹參活血散瘀;鱉甲軟堅化瘀,香附疏肝理氣解郁。諸藥合用共奏抗肝纖維化之功。本課題前期臨床研究已證實該方具有良好的抗乙肝相關(guān)肝纖維化的作用。

本實驗對肝纖維化大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)后,大鼠肝功能指標(biāo)ALT、AST水平較模型組有明顯的下降趨勢,表明和血柔肝方可改善肝臟炎癥。HE及Masson染色結(jié)果顯示,和血柔肝方最佳劑量組較模型組肝組織結(jié)構(gòu)、炎性細(xì)胞浸潤及纖維增生程度顯著改善。進(jìn)一步檢測各組大鼠肝臟PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表達(dá)的水平顯示,與模型組比較,和血柔肝方最佳劑量組大鼠肝組織中PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表達(dá)水平顯著降低。從各組大鼠肝組織中 PI3K、Akt、NF-κB P65、p-PI3K、p-Akt、p-P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平來看,與模型組比較,和血柔肝方最佳劑量組、秋水仙堿組的PI3K、Akt、NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1均明顯降低。故該實驗結(jié)果可表明,和血柔肝方可以通過調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB信號通路來抑制自噬反應(yīng),減少肝臟炎癥反應(yīng),改善肝臟病理損害,起到緩解肝纖維化的作用。此研究為臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供了和血柔肝方抗肝纖維化新的療效作用機(jī)制和實驗依據(jù)。