板栗醋發(fā)酵工藝優(yōu)化及揮發(fā)性成分分析

劉慶雙，楊曉寬，2，3*

（1.河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北秦皇島 066600；2.板栗產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，河北秦皇島 066000；3.河北省板栗產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，河北秦皇島 066000）

板栗俗稱(chēng)栗子，為殼斗科、栗屬植物[1]，板栗在我國(guó)已有3 000 多年的種植歷史，種植范圍廣，在我國(guó)有多個(gè)重要產(chǎn)區(qū)。板栗營(yíng)養(yǎng)豐富，含有淀粉、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及各種豐富的維生素，此外，板栗中還富含多酚、多糖等活性成分，這些物質(zhì)普遍具有抗氧化、抗腫瘤和抗菌的作用。板栗果仁口感甜糯，香氣獨(dú)特，但不耐貯藏，容易發(fā)霉、腐爛，造成資源浪費(fèi)。盡管目前市場(chǎng)上已經(jīng)開(kāi)發(fā)出板栗粉、板栗飲料、糖炒板栗、板栗醬等產(chǎn)品，但仍然是以糖炒板栗為主導(dǎo)的初級(jí)產(chǎn)品占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。因此，亟需開(kāi)發(fā)板栗深加工產(chǎn)品，以提高資源利用率和板栗附加值。

醋作為一種大眾發(fā)酵食品，被廣泛用作防腐劑、酸性調(diào)味品、芳香劑以及飲品[2]。在傳統(tǒng)醋類(lèi)的生產(chǎn)中常采用固態(tài)發(fā)酵或液態(tài)發(fā)酵。醋類(lèi)產(chǎn)品中富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性化合物，如氨基酸、維生素、多酚、有機(jī)酸等，這些物質(zhì)具有維持酸堿平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、改善免疫系統(tǒng)的作用，賦予醋抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)血脂水平、減肥、抗腫瘤、抗疲勞等功能特性[3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于板栗醋鮮有研究，因此，為提高板栗資源利用率和產(chǎn)品附加值，開(kāi)發(fā)一款新型板栗醋具有重要意義。

本文采用液態(tài)發(fā)酵結(jié)合單因素與正交試驗(yàn)，以板栗為原料，旨在建立板栗醋的生產(chǎn)工藝，探究影響其酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段的關(guān)鍵因素，得出適合板栗醋發(fā)酵的最優(yōu)工藝條件，并初步分析板栗醋3 個(gè)不同發(fā)酵階段樣品的揮發(fā)性成分，以期為新型板栗醋的開(kāi)發(fā)奠定初步的理論基礎(chǔ)，并提供一定的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)拓寬板栗深加工途徑，并開(kāi)拓干果原料醋類(lèi)發(fā)酵工藝研究的新方向，為深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

早豐板栗：河北省唐山市遷西縣；耐高溫淀粉酶（180 000 U/mL）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；糖化酶（100 000 U/g）：江蘇博立生物制品有限公司；酵母菌BV818：安琪酵母股份有限公司；果醋菌：煙臺(tái)帝伯仕酵母有限公司；白砂糖：市售；檸檬酸：天津歐博凱化工有限公司。所有試劑均為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

中型220V 板栗脫殼機(jī)：江蘇萬(wàn)機(jī)通機(jī)械公司；SP256 打漿機(jī)：浙江紹興蘇泊爾家居用品有限公司；HH?4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州越新儀器制造有限公司；LH?T32 手持糖度計(jì)：浙江陸恒環(huán)境科技有限公司；SPX?250B?Z 生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ?X100 恒溫振蕩培養(yǎng)箱：蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；雷磁PHS?25 指示劑：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CJM?2474 酒精計(jì)：河北省武強(qiáng)縣華歐儀表配件廠；L530 臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南湘儀設(shè)備有限公司；紗布：市售；100～1 000μL 移液槍?zhuān)捍簖埮d創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；FA?1004 電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；08?2T 恒溫磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；57330?U supelco 固相微萃取裝置、50/30um DVB/CAR/PDMS 固相微萃取針、Agilent 7890A?5975C 氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP?5MS（60 m×250μm×0.25μm）氣相色譜柱：美國(guó)Aglient 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 板栗醋制備工藝流程

板栗→去殼→打漿→過(guò)濾→淀粉酶酶解→糖化→離心過(guò)濾→白砂糖、檸檬酸調(diào)整→接種酵母菌→酒精發(fā)酵→殺菌→接種果醋菌→醋酸發(fā)酵→離心過(guò)濾→成品→滅菌。

1.3.2 原料處理

選擇充分成熟、無(wú)蟲(chóng)眼、無(wú)腐爛變質(zhì)、大小均勻的早豐板栗，用脫殼機(jī)將板栗進(jìn)行脫殼，脫殼后放入水中，防止板栗被氧化，并清洗板栗上殘留的皮和殼，處理好的板栗按照板栗∶水=1∶2.5（g/mL）的比例進(jìn)行打漿，紗布過(guò)濾，過(guò)濾好的板栗漿中加入0.02%耐高溫淀粉酶，在恒溫水浴鍋中90 ℃水浴50 min，水浴完成后，待水浴鍋和板栗漿溫度降至50 ℃，向其中加入0.1%糖化酶，水浴70 min，酶解完成后，離心（5 000 r/min，10 min）過(guò)濾。

1.3.3 酒精發(fā)酵

用手持糖度計(jì)測(cè)定過(guò)濾后漿液的初始糖度，加白砂糖調(diào)整糖度、檸檬酸調(diào)整酸度，使溶液pH 值最終在4.0 左右。向調(diào)整好的溶液中加入活化好的酵母菌（將活性干酵母按照1∶12 的質(zhì)量比添加到純凈水中，在30 ℃下水浴活化30 min），充分?jǐn)嚢杈鶆颍胖迷?0 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束，水浴鍋70 ℃滅酵母菌，冷卻后進(jìn)行醋酸發(fā)酵。

1.3.4 醋酸發(fā)酵

向漿液中接種果醋菌，裝于300 mL 三角瓶中，放置在33 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱進(jìn)行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束，得到成品，5 000 r/min 離心10 min 過(guò)濾后在70 ℃水浴鍋20 min，冷卻后進(jìn)行密封避光保存。

1.3.5 板栗醋發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.5.1 板栗醋酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以初始糖度（14、15、16、17、18°Brix）、酵母菌添加量（0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%）、酒精發(fā)酵溫度（16、18、20、22、24 ℃）、酒精發(fā)酵時(shí)間（3、4、5、6、7 d）為酒精發(fā)酵階段的影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以總酸（以乙酸計(jì)，g/L）和感官評(píng)價(jià)的綜合評(píng)分為指標(biāo)，探究每個(gè)因素對(duì)板栗醋酒精發(fā)酵的影響。

在預(yù)試驗(yàn)和酒精發(fā)酵的基礎(chǔ)上，以果醋菌添加量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）、醋酸發(fā)酵時(shí)間（5、6、7、8、9 d）、醋酸發(fā)酵溫度（29、31、33、35、37 ℃）、裝液量（20%、30%、40%、50%、60%）、轉(zhuǎn)速（140、155、170、185、200 r/min）為醋酸發(fā)酵階段的影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以總酸和感官評(píng)價(jià)的綜合評(píng)分為指標(biāo)，探究每個(gè)因素對(duì)板栗醋醋酸發(fā)酵的影響。

1.3.5.2 板栗醋正交優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)酒精發(fā)酵階段單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以初始糖度、酵母菌添加量、酒精發(fā)酵溫度、酒精發(fā)酵時(shí)間設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，確定酒精發(fā)酵階段適合板栗醋的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)。

以酒精發(fā)酵的正交試驗(yàn)為前提，根據(jù)醋酸發(fā)酵階段的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以果醋菌添加量、醋酸發(fā)酵時(shí)間、醋酸發(fā)酵溫度、裝液量設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，確定醋酸發(fā)酵階段適合板栗醋的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)。

1.3.6 指標(biāo)測(cè)定

1.3.6.1 感官評(píng)價(jià)

參照GB/T 30884—2014《蘋(píng)果醋飲料》[4]中感官評(píng)分要求，結(jié)合板栗醋本身特點(diǎn)，對(duì)板栗醋進(jìn)行感官評(píng)價(jià)（滿分100 分），挑選10 名食品專(zhuān)業(yè)相關(guān)的人員組成感官評(píng)定小組，按感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）對(duì)板栗醋的口感、色澤、香氣和澄清度進(jìn)行打分，取平均分作為感官評(píng)分。

表1 板栗醋感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria for Chinese chestnut vinegar

1.3.6.2 理化指標(biāo)測(cè)定

總酸：參照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》酸堿指示劑滴定法[5]；可溶性固形物：采用手持糖度計(jì)測(cè)定；氨基酸態(tài)氮：參照GB/T 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》酸度計(jì)法[6]；pH 值：采用酸度計(jì)測(cè)定；還原糖：參照GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》[7]；多酚：采用Folin?Ciocalte 法進(jìn)行測(cè)定[8]；多糖：采用苯酚?硫酸法進(jìn)行測(cè)定[9]；游離礦酸：參照GB/T 5009.233—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中游離礦酸的測(cè)定》[10]中的方法進(jìn)行。

1.4 綜合評(píng)分的計(jì)算

本試驗(yàn)中評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用綜合評(píng)分的方法。設(shè)置總酸和感官評(píng)價(jià)的權(quán)重分別為0.5，總酸的評(píng)分y1=（測(cè)量值/總酸最大值）×0.5×100，感官評(píng)價(jià)的評(píng)分y2=（測(cè)量值/感官評(píng)價(jià)最大值）×0.5×100，綜合評(píng)分y=y1+y2。

1.5 香氣分析的檢測(cè)方法

頂空固相微萃取條件：稱(chēng)取5 mL 板栗醋樣品置于20 mL 萃取瓶中，加入100 ul 仲辛醇（100μg/mL）作為內(nèi)標(biāo)物，密封，置于60 ℃水浴中，磁力攪拌速度500 r/min，平衡20 min 后，插入萃取針萃取30 min。萃取針使用前，在氣質(zhì)進(jìn)樣口250 ℃下活化20 min。

GC 條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，氣質(zhì)接口溫度280 ℃，載氣流速1.5 mL/min，分流比4∶1。升溫程序：初始50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升溫到100 ℃保持2 min；4 ℃/min 升溫到180 ℃保持3 min；5 ℃/min升溫到250 ℃保持5 min。

MS 條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，EI 電離70 eV，全掃描35～550 da。

定性定量分析：通過(guò)與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）中標(biāo)準(zhǔn)譜圖作對(duì)比，并參考相關(guān)文獻(xiàn)、資料進(jìn)行定性分析，采用面積歸一的方法計(jì)算板栗醋中香氣成分的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理；Origin 進(jìn)行作圖；SPSS 25 進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 初始糖度對(duì)綜合評(píng)分的影響

初始糖度對(duì)綜合評(píng)分的影響如圖1所示。

圖1 初始糖度對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig.1 Effect of the initial sugar content on the comprehensive score

由圖1 可知，綜合評(píng)分隨著初始糖度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)初始糖度為17°Brix 時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最大值。這是由于糖度過(guò)低，供酵母菌使用的底物少，影響發(fā)酵的速度；糖度過(guò)高，導(dǎo)致菌種活躍，生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)生的大量腺嘌呤核苷三磷酸使酶的活性受到了抑制[11]，并且糖度太高，超過(guò)了酵母菌的耐受范圍，使酵母菌的生長(zhǎng)代謝受到抑制[12]，造成后期的轉(zhuǎn)化率低。因此，選擇初始糖度16、17、18°Brix 進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.1.2 酒精發(fā)酵時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響

酒精發(fā)酵時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響如圖2所示。

圖2 酒精發(fā)酵時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig.2 Effect of alcohol fermentation time on the comprehensive score

由圖2 可知，綜合評(píng)分隨著酒精發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在發(fā)酵第6 天時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最大值，這是由于發(fā)酵初期時(shí)間短，發(fā)酵不徹底；隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，多數(shù)的糖被酵母利用轉(zhuǎn)化成酒精，酒精度增加，使乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸不完全，綜合評(píng)分下降。因此，選擇酒精發(fā)酵時(shí)間5、6、7 d 進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.1.3 酒精發(fā)酵溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響

酒精發(fā)酵溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響如圖3所示。

圖3 酒精發(fā)酵溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig.3 Effect of alcohol fermentation temperature on the compre?hensive score

由圖3 可知，綜合評(píng)分隨著酒精發(fā)酵溫度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，酒精發(fā)酵溫度為22 ℃時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最大值。這是由于在發(fā)酵初期溫度較低，酵母生長(zhǎng)繁殖緩慢，酶的活性降低，對(duì)酒精發(fā)酵造成不利影響，導(dǎo)致乙酸生成量減少，感官風(fēng)味受損；當(dāng)溫度升高，酵母生長(zhǎng)增殖加快，促進(jìn)酒精發(fā)酵，乙酸含量增加；但溫度過(guò)高，酵母菌的生理活動(dòng)受到抑制，提前出現(xiàn)疲勞狀態(tài)，進(jìn)入衰亡期，使酒精發(fā)酵提前結(jié)束，乙醇含量下降，最終生成乙酸減少，導(dǎo)致綜合評(píng)分降低。因此，選擇酒精發(fā)酵溫度20、22、24 ℃進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.1.4 酵母菌添加量對(duì)綜合評(píng)分的影響

酵母菌添加量對(duì)綜合評(píng)分的影響如圖4所示。

圖4 酵母菌添加量對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig.4 Effect of yeast addition on the comprehensive score

由圖4 可知，綜合評(píng)分隨著酵母菌添加量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)添加量在0.03%時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最大值。添加量過(guò)少，酒精發(fā)酵速度慢，產(chǎn)物積累的少，發(fā)酵效果差、不完全；添加量過(guò)大，發(fā)酵體系中反應(yīng)加快，發(fā)酵周期縮短，影響風(fēng)味物質(zhì)的形成，品質(zhì)下降[13]，并且添加量過(guò)大使酵母菌的生長(zhǎng)繁殖過(guò)多的消耗底物，使酒精含量下降，導(dǎo)致最終生成的乙酸含量減少。因此，選擇酵母菌添加量0.02%、0.03%、0.04%進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 醋酸發(fā)酵時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響

醋酸發(fā)酵時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響如圖5所示。

由圖5 可知，綜合評(píng)分隨著醋酸發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，發(fā)酵第8 天時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最大值。發(fā)酵前期，營(yíng)養(yǎng)成分充足，底物濃度高，果醋菌大量繁殖，使得發(fā)酵體系中的乙醇大量合成醋酸，發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行，發(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，果醋菌代謝緩慢，酸度上升緩慢，達(dá)到最大值[14]，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間時(shí)，底物基本消耗完全，果醋菌發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，將醋酸氧化成二氧化碳和水，其次醋酸的揮發(fā)性增強(qiáng)，總酸含量降低，整體感官下降，綜合評(píng)分降低。因此，選擇醋酸發(fā)酵時(shí)間7、8、9 d 進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2.2 轉(zhuǎn)速對(duì)綜合評(píng)分的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)綜合評(píng)分的影響如圖6所示。

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響Fig.6 Influence of rotation speed on the comprehensive score

由圖6 可知，綜合評(píng)分隨著轉(zhuǎn)速的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)速為170 r/min 時(shí)達(dá)到最大值。果醋菌作為好氧型微生物，氧氣含量直接影響果醋菌的生長(zhǎng)、代謝以及整體的發(fā)酵效果。轉(zhuǎn)速升高，氧氣含量升高，利于發(fā)酵，但隨著轉(zhuǎn)速過(guò)快反而會(huì)使醋酸發(fā)酵的反應(yīng)過(guò)大、不穩(wěn)定，其次，由于轉(zhuǎn)速過(guò)快，使得用于醋酸發(fā)酵的乙醇揮發(fā)過(guò)多，果醋菌的生長(zhǎng)代謝得不到滿足，綜合評(píng)分開(kāi)始下降[15]。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析，轉(zhuǎn)速對(duì)綜合評(píng)分的作用效果不顯著，因此，不將轉(zhuǎn)速作為正交試驗(yàn)的因素。

2.1.2.3 裝液量對(duì)綜合評(píng)分的影響

裝液量對(duì)綜合評(píng)分的影響如圖7所示。

圖7 裝液量對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig.7 Effect of loaded liquid volume on the comprehensive score

由圖7 可知，綜合評(píng)分隨著裝液量的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。裝液量關(guān)系到發(fā)酵體系中的溶氧量，影響到菌體的生長(zhǎng)和氧化酒精的進(jìn)行[16]。裝液量小，與氧氣接觸充分且均勻，發(fā)酵效果較好，但裝液量過(guò)低，不利于生產(chǎn)加工的成本；裝液量過(guò)大，發(fā)酵液中溶氧量降低，乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸受到了限制，導(dǎo)致總酸含量下降[17]。醋酸發(fā)酵過(guò)程是在振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行，裝液量過(guò)高，發(fā)酵液可能會(huì)被瓶口的紗布污染，導(dǎo)致發(fā)酵液可能被雜菌污染。因此，選擇裝液量30%、40%、50% 進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2.4 果醋菌添加量對(duì)綜合評(píng)分的影響

果醋菌添加量對(duì)綜合評(píng)分的影響如圖8所示。

圖8 果醋菌添加量對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig.8 Effect of fruit vinegar bacteria addition on the comprehen?sive score

由圖8 可知，綜合評(píng)分隨著果醋菌添加量的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)添加量為0.02%時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最大值。添加量過(guò)少時(shí)，不能徹底發(fā)酵，發(fā)酵緩慢，不能夠?qū)⒁掖纪耆趸纱姿醄18]；添加量適中時(shí)，果醋菌利用發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)成分充分發(fā)酵，滿足自身的生長(zhǎng)和代謝；添加量過(guò)大時(shí)，果醋菌自身生長(zhǎng)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致生成的醋酸少[19]，發(fā)酵過(guò)程中積累的許多代謝廢物也會(huì)導(dǎo)致果醋菌出現(xiàn)衰老、自溶的現(xiàn)象，產(chǎn)酸能力下降，過(guò)多的菌體自溶也會(huì)對(duì)發(fā)酵液的滋味和澄清度造成不利影響[20]，影響品質(zhì)。因此，選擇果醋菌添加量0.03%、0.04%、0.05%進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2.5 醋酸發(fā)酵溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響

醋酸發(fā)酵溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響如圖9所示。

圖9 醋酸發(fā)酵溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig.9 Effect of acetic acid fermentation temperature on the com?prehensive score

由圖9 可知，綜合評(píng)分隨著醋酸發(fā)酵溫度的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在29 ℃綜合評(píng)分達(dá)到最大值，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，發(fā)酵效果開(kāi)始變差，這是因?yàn)檫^(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致果醋菌體內(nèi)的酶失活，前期代謝過(guò)于旺盛，大量繁殖，過(guò)早的進(jìn)入衰亡期，出現(xiàn)老化、自溶的現(xiàn)象[21]。高溫發(fā)酵使得一些風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)，并且高溫條件下生成的醋酸被進(jìn)一步氧化成二氧化碳和水，導(dǎo)致最終的發(fā)酵效果差，總酸含量下降，板栗醋的風(fēng)味變差。因此，選擇醋酸發(fā)酵溫度31、33、35 ℃進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 板栗醋酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)板栗醋酒精發(fā)酵階段的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以板栗醋的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Orthogonal test factor levels for alcohol fermentation

表3 酒精發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of alcohol fermentation

由表3 可知，板栗醋酒精發(fā)酵的最佳工藝條件為A2B2C3D1，即酒精發(fā)酵溫度為22 ℃，初始糖度為17°Brix，酵母菌添加量為0.04%，酒精發(fā)酵時(shí)間為5 d，與正交試驗(yàn)中最優(yōu)結(jié)果一致。通過(guò)極差分析發(fā)現(xiàn)，板栗醋酒精發(fā)酵的各因素影響大小為初始糖度（B）＞酵母菌接種量（C）＞酒精發(fā)酵時(shí)間（D）＞酒精發(fā)酵溫度（A）。初始糖度對(duì)板栗醋發(fā)酵的影響最為顯著，過(guò)高或過(guò)低的糖濃度都會(huì)對(duì)酵母菌的活性產(chǎn)生不良影響。

2.2.2 板栗醋醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)

根據(jù)板栗醋醋酸發(fā)酵階段的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以板栗醋的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表4，醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平Table 4 Orthogonal test factor levels for acetic acid fermentation

表5 醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of acetic acid fermentation

由表5 可知，板栗醋醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件為A1B2C2D2，即發(fā)酵溫度為31 ℃，果醋菌添加量為0.04%，裝液量為40%，發(fā)酵時(shí)間為8 d，與正交試驗(yàn)中最優(yōu)結(jié)果一致。通過(guò)極差分析發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)板栗醋的影響大小為裝液量（C）＞醋酸發(fā)酵溫度（A）＞果醋菌添加量（B）＞醋酸發(fā)酵時(shí)間（D）。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

酒精發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 酒精發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of alcohol fermentation validation test

醋酸發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

表7 醋酸發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of acetic acid fermentation validation test

在酒精發(fā)酵階段酒精發(fā)酵溫度22 ℃，初始糖度17°Brix，酵母菌添加量0.04%，酒精發(fā)酵時(shí)間5 d，醋酸發(fā)酵階段醋酸發(fā)酵溫度31 ℃，果醋菌添加量0.04%，裝液量40%，醋酸發(fā)酵時(shí)間8 d 的工藝條件下，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，總酸達(dá)到20.18 g/L，綜合評(píng)分達(dá)到90.65，明顯優(yōu)于初始工藝，與預(yù)測(cè)值偏差不足5%，結(jié)果具有可靠性，所得的板栗醋酯香濃郁，顏色明亮，口感飽和，具有板栗的獨(dú)特風(fēng)味。

2.4 板栗醋品質(zhì)分析

2.4.1 感官評(píng)定

經(jīng)發(fā)酵制得的板栗醋呈黃色，醋體透明清澈，口感清爽，味道協(xié)調(diào)，具有板栗自身的果香和醋香，無(wú)懸浮物和渾濁現(xiàn)象。

2.4.2 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

板栗醋理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如表8所示。

表8 板栗醋、蘋(píng)果醋、米醋理化指標(biāo)Table 8 Physicochemical indexes of Chinese chestnut vinegar，apple cider vinegar and rice vinegar

由表8 可知，最優(yōu)工藝條件板栗醋的各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)對(duì)比，板栗醋其各項(xiàng)指標(biāo)與蘋(píng)果醋、米醋對(duì)應(yīng)的指標(biāo)均存在顯著性差異，板栗醋中的可溶性固形物、還原糖、多酚、多糖含量均明顯高于蘋(píng)果醋和米醋。其中，板栗醋的多酚含量約是蘋(píng)果醋的13 倍，米醋的28 倍；多糖含量是米醋含量的近10 倍；氨基酸態(tài)氮的含量高于蘋(píng)果醋，低于米醋?，F(xiàn)代研究表明，多酚[22]和多糖[23]均具有生理活性，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，對(duì)一些慢性疾病起到很好的預(yù)防效果，因此板栗醋具有良好的保健功效。

2.5 板栗醋不同發(fā)酵階段香氣分析

本試驗(yàn)采用了頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（head space?solid phase microextraction?gas chromatogr?aphy?mass spectrometry，HS?SPME?GC?MS）法對(duì)板栗醋的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定，研究板栗漿、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵3 個(gè)不同階段的揮發(fā)性成分，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 不同發(fā)酵階段板栗醋揮發(fā)性成分GC?MS 分析結(jié)果Table 9 Results of GC?MS analysis of volatile components of chestnut vinegar at different fermentation stages

板栗醋的香氣主要以酸味、水果香以及花香為主，由表9 可知，在板栗醋整體的發(fā)酵階段中，共鑒定出79 種揮發(fā)性香氣成分，其中包括酸類(lèi)6 種，烷烴類(lèi)16種，醇類(lèi)9 種，酮類(lèi)10 種，酯類(lèi)21 種，醛類(lèi)4 種，其他化合物13 種；在3 個(gè)不同的發(fā)酵過(guò)程中，醋酸發(fā)酵階段尤為重要，3 個(gè)階段共有的化合物為十六烷、棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯和二氧化碳。在板栗醋釀造的3 個(gè)階段中，產(chǎn)物香氣成分的種類(lèi)總數(shù)差別較小，但種類(lèi)的構(gòu)成和相對(duì)含量差異較大。

在板栗漿中檢測(cè)出34 種揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)主要包括酸類(lèi)4 種（15.48%），烷烴類(lèi)8 種（1.29%），醇類(lèi)3 種（2.46%），酮類(lèi)3 種（8.62%），酯類(lèi)8 種（1.08%），醛類(lèi)2 種（0.14%）以及其他化合物6 種（13.72%），除其他化合物外，酸類(lèi)是含量最多的化合物，其次是醇類(lèi)，這類(lèi)化合物在板栗漿中檢測(cè)到，顯示出類(lèi)似新鮮草味的香氣[24?25]。含量大于1%的有5 種，以乙酸、3?羥基?2?丁酮含量較高，與酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段相比，3?羥基?2?丁酮在板栗漿中檢測(cè)的含量明顯較多，可作為板栗漿的特征化合物[26]。

在酒精發(fā)酵階段檢測(cè)出39 種揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)包括烷烴類(lèi)8 種（0.5%），醇類(lèi)6 種（36.69%），酮類(lèi)5種（2.65%），酯類(lèi)15 種（30.77%），醛類(lèi)1 種（0.05%）以及其他化合物4 種（3.21%），這個(gè)階段一些香氣成分減少或消失，并產(chǎn)生了一些具有代表性的酒類(lèi)成分，賦予了板栗醋酒精發(fā)酵階段甜味和獨(dú)特的風(fēng)味[27]。與板栗漿相比，酒類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)及含量明顯增加，其中乙醇（30.26%）和異戊醇（6.13%）是主要成分。影響酒精發(fā)酵香氣的酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和相對(duì)含量明顯增加，大多數(shù)的酯類(lèi)具有花香或果香。酒精發(fā)酵階段中，烷類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)物質(zhì)含量明顯下降，酸類(lèi)物質(zhì)包括酸味難聞的酸消失。檢測(cè)到的物質(zhì)中含量大于1% 的有7 種，以乙醇、異戊醇、乙酸乙酯含量較高。乙酸乙酯只在酒精發(fā)酵階段檢測(cè)到，并且由于乙醇在酒精發(fā)酵階段的含量遠(yuǎn)高于在板栗漿、醋酸發(fā)酵階段中的含量，因此乙醇和乙酸乙酯可作為酒精發(fā)酵的特征化合物。

在醋酸發(fā)酵階段中檢測(cè)出29 種揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)含酸類(lèi)3 種（41.43%），烷烴類(lèi)5 種（0.21%），醇類(lèi)2 種（0.18%），酮類(lèi)5 種（0.69%），酯類(lèi)8 種（0.40%），醛類(lèi)1 種（0.03%）以及其他化合物5 種（0.85%），醇類(lèi)種類(lèi)和含量均減少，醇基本轉(zhuǎn)化為酸，尤其是乙醇，酸類(lèi)含量明顯增加。含量大于1% 的有1 種，為乙酸。醋酸發(fā)酵階段檢測(cè)到的乙酸含量遠(yuǎn)高于板栗漿和酒精發(fā)酵階段的含量，因此乙酸可作為板栗醋醋酸發(fā)酵的特征化合物。醋酸發(fā)酵被認(rèn)為在風(fēng)味代謝物的形成和乙酸的積累中最為復(fù)雜和關(guān)鍵[28?29]，醋酸發(fā)酵期間微生物多樣性和代謝發(fā)生了變化，這些代謝物參與了許多化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致了這一時(shí)期風(fēng)味化合物的多樣性[30]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)兩步發(fā)酵制得板栗醋，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)板栗醋的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明板栗醋的酒精發(fā)酵優(yōu)化工藝參數(shù)為酒精發(fā)酵溫度22 ℃，初始糖度17°Brix，酵母菌添加量0.04%，酒精發(fā)酵時(shí)間5 d，醋酸發(fā)酵優(yōu)化工藝參數(shù)為醋酸發(fā)酵溫度31 ℃，果醋菌添加量0.04%，裝液量40%，醋酸發(fā)酵時(shí)間8 d，此條件下，總酸含量達(dá)到20.18 g/L，綜合評(píng)分達(dá)到90.65，發(fā)酵得到的板栗醋具有獨(dú)特的板栗香氣，風(fēng)味良好。

通過(guò)對(duì)板栗醋發(fā)酵過(guò)程中3 個(gè)階段的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析，共檢測(cè)出79 種化合物，其中酸類(lèi)6 種，烴類(lèi)16 種，醇類(lèi)9 種，酮類(lèi)10 種，酯類(lèi)21 種，醛類(lèi)4 種以及其他類(lèi)化合物13 種。在板栗漿階段，乙酸和3?羥基?2?丁酮含量較高，分別為15.36% 和6.97%；在酒精發(fā)酵階段，乙醇、乙酸乙酯和異戊醇含量較高，分別為30.26%、24.88%和6.13%；在醋酸發(fā)酵階段，乙酸含量較高，為41.13%。這些揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)、含量及相互之間的共同協(xié)調(diào)作用，形成了板栗醋特有的風(fēng)味和口感。