植物乳桿菌發(fā)酵對富硒發(fā)芽糙小米飲料風(fēng)味特征的影響

周大宇，門雨薇，金子燦，華正瑩，楚彩云，薛井生，盧丙軒，馬濤*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013；2.葫蘆島后峪生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，遼寧葫蘆島 125001；3.遼寧寨香生態(tài)農(nóng)業(yè)股份有限公司，遼寧本溪 117007）

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)水平不斷提高，食材的精細(xì)化加工在具有良好風(fēng)味口感的同時，造成大量營養(yǎng)素的損失，導(dǎo)致我國高血壓、高血糖和高血脂的發(fā)病率逐年上升，因此營養(yǎng)全面的全谷物類食品受到消費者的廣泛關(guān)注。粟米又稱糙小米、谷子，屬禾本科植物，卵圓形籽實，粒小多為黃色，去殼后俗稱小米[1]。與小米相比，糙小米由胚乳、胚芽和皮層組成，含有更豐富的功能性營養(yǎng)元素，但糙小米富含纖維的皮層使籽粒不易炊熟，產(chǎn)品風(fēng)味口感不佳，因此采用現(xiàn)代集成技術(shù)改善糙小米的感官品質(zhì)具有重要意義。

硒是人體必需的微量營養(yǎng)元素，富硒食品在發(fā)揮功能作用的同時，對食品的風(fēng)味也起到改善作用。Gao等[2]研究發(fā)現(xiàn)以富硒大豆為原料釀制醬油，可顯著提高醬油的口感和芳香性化合物含量。發(fā)芽是提高谷類感官品質(zhì)的重要手段，谷物發(fā)芽過程中，多糖和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為寡糖和氨基酸，并提升谷物的風(fēng)味與口感[3]。Sun 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，以發(fā)芽糙米為原料制成的饅頭，感官品質(zhì)顯著提高，其他醇類香氣成分顯著增多。仲夢涵等[5]研究發(fā)現(xiàn)，烘烤發(fā)芽大麥茶產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與未發(fā)芽大麥茶相比香氣種類更加豐富，風(fēng)味更好。益生菌被廣泛應(yīng)用于食品中，改善食品風(fēng)味與營養(yǎng)。植物乳桿菌屬于乳酸桿菌科中的乳酸桿菌屬，革蘭陽性兼性厭氧發(fā)酵，被廣泛地應(yīng)用于乳酸菌飲料、酸奶、發(fā)酵調(diào)味料等食品中，提升產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)；Wang等[6]研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過植物乳桿菌發(fā)酵的米糠和麥麩異味風(fēng)味含量減低?；谏鲜鲅芯?，本試驗分別以富硒發(fā)芽糙小米、富硒糙小米、發(fā)芽糙小米以及普通糙小米為原料通過感官評定、氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用（gas chro?matography?mass spectrometry，GC?MS）和電子舌、電子鼻技術(shù)，分析植物乳桿菌發(fā)酵對糙小米飲料風(fēng)味特征的影響，以期為進(jìn)一步開發(fā)高質(zhì)量富硒發(fā)芽糙小米食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙小米、富硒糙小米：葫蘆島后峪生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司；中溫α?淀粉酶（酶活10 000 U/g）、植物乳桿菌550：四川高福記生物科技有限公司；MRS 肉湯培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；無水氯化鈣、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：遼寧泉瑞試劑有限公司；環(huán)己酮（分析純）：上海晶純生化科技股份有限公司

1.2 儀器與設(shè)備

PL303 電子天平：梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司；PEN3 電子鼻、SA402B 電子舌：日本Insent 公司；DF?101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城基金科工貿(mào)有限公司；7890A 氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP?5MS 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫科技有限公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭、20 mL 頂空鉗口樣品瓶、固相微萃取裝置：美國Supelco 公司；SPX?150B?Z 生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽糙小米、富硒發(fā)芽糙小米的制作

參考華正瑩等[7]的方法并稍作改動。將洗凈除雜后的糙小米、富硒糙小米在3.5 mmol/L CaCl2溶液、35 ℃條件下恒溫浸泡13 h 后，在31 ℃下恒溫發(fā)芽48 h，得到發(fā)芽糙小米和富硒發(fā)芽糙小米。

1.3.2 糙小米飲料的制作

參考郭敏等[8]的方法并稍作改動。洗凈除雜后的糙小米制粉，過80 目篩，加水[料液比為1∶12（g/mL）]，100 ℃糊化20 min，調(diào)pH 值至6.4 后加入中溫α?淀粉酶，90 ℃酶解50 min，殺菌、冷卻后即為糙小米飲料。富硒糙小米、發(fā)芽糙小米以及富硒發(fā)芽糙小米的飲料制備方式與上述相同。

1.3.3 糙小米發(fā)酵飲料的制作

參考侯金麗[9]的方法并稍作改動。菌種活化及母發(fā)酵劑的制備：植物乳桿菌菌粉按0.1%的質(zhì)量比接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，再以3%（體積分?jǐn)?shù)）接種于試管MRS 肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h，兩次活化后活菌數(shù)達(dá)到9×109CFU/mL 以上。將上述母發(fā)酵劑按2%接種量加入糙小米飲料，再加入3%蔗糖，37 ℃恒溫發(fā)酵10 h，即得糙小米發(fā)酵飲料。富硒糙小米、發(fā)芽糙小米以及富硒發(fā)芽糙小米的植物乳桿菌發(fā)酵飲料制備方式與上述相同。

1.3.4 感官分析

將樣品按照GB/T 29605—2013《感官分析食品感官質(zhì)量控制導(dǎo)則》[10]中所述的方法設(shè)置感官評價的指標(biāo)，選取10 名評價員，男女比例1∶1。經(jīng)基本味道識別能力、觀察閾、識別閾培訓(xùn)后，對氣味、滋味、組織狀態(tài)3 個方面進(jìn)行感官品評、打分，采用百分制，感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 糙小米飲料感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation of brown millet beverage

1.3.5 電子鼻分析

電子鼻測定：參考李東紅等[11]的方法并稍作修改。取10 mL 樣品于樣品瓶中，用3 層保鮮膜密封，平衡20 min 后，進(jìn)行氣味測定。電子鼻清洗時間為100 s，樣品準(zhǔn)備時間為5 s，檢測時間為120 s，進(jìn)行3 次重復(fù)試驗。電子鼻的傳感器是由10 種金屬氧化物半導(dǎo)體型化學(xué)傳感元件組成，不同傳感器的性能描述如表2所示。

表2 PEN3 便攜式標(biāo)準(zhǔn)傳感器陣列及性能Table 2 PEN3 portable standard sensor array and its performance

1.3.6 電子舌分析

用電子舌進(jìn)行味覺分析，味覺傳感器由5 個測試傳感器和2 個參考傳感器組成，其中重要的5 個測試傳感器為CT0、CA0、C00、AAE 和AE1，分別代表咸、酸、苦、鮮和澀味。取60 mL 樣品抽濾過膜后置于樣品杯中進(jìn)行測定，每個樣品測試4 次，取3 次穩(wěn)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。為了減小測量誤差，其余的樣品槽放置正負(fù)電極液和基準(zhǔn)液。

1.3.7 GC?MS 檢測

參考宋虹等[12]的方法并稍作修改。

樣品處理：取5.0 g 樣品放入15 mL 帶聚四氟乙烯隔膜的頂空瓶中，加入1.8 g NaCl，再加入10 μg 環(huán)己酮，混合均勻。55 ℃恒溫水浴平衡10 min，再把固相微萃取手動進(jìn)樣柄的針頭插入頂空瓶中。將纖維伸出置于樣品上空的氣體中萃取45 min，然后縮回纖維將萃取頭拔出頂空瓶并立即插入氣相色譜?質(zhì)譜進(jìn)樣口。再次伸出纖維在250 ℃條件下進(jìn)行5 min 解吸?？s回纖維拔出萃取頭，開始采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

色譜條件：分離柱HP?5MS 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣He；載氣流速0.8 mL/min；不分流進(jìn)樣；升溫程序：柱箱初始溫度35 ℃保持3 min，以2 ℃/min 升至65 ℃，再以3 ℃/min 升至110 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃保持7 min。

質(zhì)譜條件：離子化模式為電子電離（electron ioniza?tion，EI）；電子能70 eV；離子源溫度200 ℃；發(fā)射電流200 μA；傳輸溫度250 ℃；檢測氣壓350 V；數(shù)據(jù)采集為全掃描。

內(nèi)標(biāo)法定量分析：保留匹配度大于800 的物質(zhì)，根據(jù)色譜峰面積計算揮發(fā)性化合物的含量，樣品中揮發(fā)性化合物含量的計算公式如下。

式中：M為揮發(fā)性化合物含量，μg/100 g；S1為待測化合物的色譜峰面積；S2為內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積；m1為樣品質(zhì)量，g；m2為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量，μg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 和SPSS 19 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，運用方差分析法（analysis of variance ，ANOVA）進(jìn)行顯著性分析；采用Origin 9.0 軟件對電子鼻與電子舌響應(yīng)值做雷達(dá)圖，并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評定結(jié)果

對糙小米飲料、糙小米發(fā)酵飲料、富硒糙小米飲料、富硒糙小米發(fā)酵飲料、發(fā)芽糙小米飲料、發(fā)芽糙小米發(fā)酵飲料、富硒發(fā)芽糙小米飲料、富硒發(fā)芽糙小米發(fā)酵飲料8 種糙小米飲料分別按S1～S8 命名。評價員對8 種糙小米飲料樣品的組織狀態(tài)、甜味、酸味、鮮味和米香味的感官評定結(jié)果見圖1。

圖1 糙小米飲料的感官雷達(dá)圖Fig.1 Sensory radar map of brown millet beverage

由圖1 可知，糙小米飲料在不同方式處理下，感官評定有較大差異，S1 糙小米飲料的組織狀態(tài)、甜味、酸味、鮮味和米香味都是最低；S4 富硒糙小米發(fā)酵飲料的組織狀態(tài)、甜味強(qiáng)度和酸味強(qiáng)度較高；S8 富硒發(fā)芽糙小米發(fā)酵飲料的組織狀態(tài)和整體風(fēng)味較好。

2.2 電子舌分析

電子舌通過模擬人體的舌器官實現(xiàn)對味覺物質(zhì)快速、準(zhǔn)確地檢測識別[13]。8 種糙小米飲料特征信號響應(yīng)值如圖2所示。

圖2 糙小米飲料電子舌傳感器響應(yīng)雷達(dá)圖Fig.2 Response radar map of electronic tongue sensor of brownmillet beverage

由圖2 可知，糙小米飲料酸味較弱，苦味與苦味的回味明顯高于S2～S8。糙小米含有更多的多酚黃酮類物質(zhì)，可能是糙小米飲料苦澀味更重的原因[14]。富硒對糙小米飲料的影響不明顯。發(fā)芽會使糙小米飲料鮮味和咸味稍有減弱。經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后的飲料酸味要高于未發(fā)酵飲料，可能是植物乳桿菌可通過進(jìn)一步生物轉(zhuǎn)化醇、醛、酸等化合物的原因，此外發(fā)酵后飲料的苦味、澀味、苦味的回味、澀味的回味降低，豐富度和咸味變化不明顯[15]。

2.3 電子鼻分析

電子鼻系統(tǒng)對于樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)很靈敏，不同物質(zhì)輕微的變化即可通過傳感器響應(yīng)值反映。8 種糙小米飲料的電子鼻雷達(dá)圖如圖3所示。

圖3 糙小米飲料香氣成分響應(yīng)值電子鼻雷達(dá)圖Fig.3 Electronic nose radar map of response values of aroma components of brown millet beverage

圖3 中每一條直線代表著一個傳感器的相對電阻率（G/G0 或G0/G）的變化情況。由圖3 可知，不同飲料的風(fēng)味輪廓之間存在差異，說明8 種飲料的揮發(fā)性物質(zhì)有一定程度的不同。在電子鼻的10 個傳感器中，R1、R2、R6、R7、R8、R10 號傳感器的響應(yīng)值變化較為明顯，表明傳感器對糙小米飲料的芳香化合物、氮氧化物、碳?xì)浠?、硫化氫、醇類、烷烴等揮發(fā)性成分較靈敏。通過R1、R2、R6 號傳感器的變化規(guī)律可以看出，發(fā)芽使糙小米飲料芳香化合物、氮氧化物、碳?xì)浠衔锷?，而富硒使糙小米飲料芳香化合物、氮氧化物、碳?xì)浠衔锝档汀?/p>

2.4 頂空固相微萃取?GC?MS 分析

8 種糙小米飲料揮發(fā)性組分的分析結(jié)果如表3所示，風(fēng)味物質(zhì)含量變化如表4所示。

表3 糙小米飲料揮發(fā)性組分的分析結(jié)果Table 3 Analysis results of volatile components of brown millet beverage

表4 風(fēng)味物質(zhì)含量變化Table 4 Change in flavor substance contentμg/100 g

由表3、表4 可知，8 種糙小米飲料在發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量差異較大，共檢測出揮發(fā)性物質(zhì)42 種，主要包括醛類（7 種）、醇類（12 種）、烷類（4 種）、酸類（9 種）、酚類（4 種）、酮類（4 種）、酯類（2 種）。其中醛類物質(zhì)通常是由酸和酯轉(zhuǎn)化而來，閾值較低，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[16]。不同處理方式的糙小米在發(fā)酵過程中其風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量有所不同[17]，S1 糙小米飲料共檢測出13 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，S2 糙小米發(fā)酵飲料共檢測出13 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酸類作為發(fā)酵的產(chǎn)物，種類增加，含量由0 增長為28.17 μg/100 g，但并未檢測出醛類物質(zhì)。正己醇為豆腥味成分，在S2 糙小米發(fā)酵飲料中含量明顯降低，飲料風(fēng)味改善。S3 富硒糙小米飲料風(fēng)味物質(zhì)的種類與S1 糙小米飲料明顯不同，其醛類、醇類、烷類、酸類等種類較少，但發(fā)酵后，風(fēng)味物質(zhì)的種類明顯增加，同時酸類和酚類含量明顯增加，酸類由5.92 μg/100 g 增加至93.71μg/100，酚類由100.69μg/100 g 增加至530.75μg/100 g，對飲料的風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)，如具有香甜和香莢蘭豆萃取物的香氣的4?乙烯基苯酚[18]。S5 發(fā)芽糙小米飲料各類化合物含量均減少。但具有特殊揮發(fā)性氣味且具有較大風(fēng)味貢獻(xiàn)的化合物種類增加，使得發(fā)芽后的糙小米飲料味道更加豐富；與S5 發(fā)芽糙小米飲料相比，S6 發(fā)芽糙小米發(fā)酵飲料檢測出了奶酪香的壬酸和果香的辛酸。S8 富硒發(fā)芽發(fā)酵糙小米飲料中檢測出23 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，與S7 未發(fā)酵的富硒發(fā)芽糙小米飲料相比，呈香物質(zhì)2?乙基?1?己醇、壬酸和4?乙烯基苯酚等含量明顯增加，其中2?乙基?1?己醇賦予樣品花香味，對樣品風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)[19]；壬酸在未發(fā)酵的富硒發(fā)芽糙小米飲料中未被檢出，但賦予富硒發(fā)芽糙小米發(fā)酵飲料奶酪香氣[20]；肖彤等[21]研究中發(fā)現(xiàn)，己醛是引起豆腥味的揮發(fā)性成分，但在富硒發(fā)芽糙小米發(fā)酵飲料中并未檢出。乙偶姻作為發(fā)酵香氣的主要成分，存在于發(fā)酵過的樣品中，其令人愉悅、柔和的奶香確保了發(fā)酵飲料的基本風(fēng)味[22]。

2.5 聚類分析

采用系統(tǒng)聚類分析方法并結(jié)合熱圖進(jìn)一步探索不同處理的糙小米飲料揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異，不同處理的糙小米飲料的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類分析結(jié)果如圖4所示。

圖4 糙小米飲料熱圖分析Fig.4 Analysis of heat map of brown millet beverage

由圖4 可知，熱圖可直觀展示鑒定出的42 種化合物在不同品種中的分布規(guī)律，圖中顏色由深到淺表示化合物含量由高到低，顏色越深表示化合物含量越高，顏色越淺表示化合物含量越低。聚類分析結(jié)果表明：把8 種不同處理的糙小米飲料分為3 類，S1 糙小米飲料為單獨一類，醛類物質(zhì)含量較高，不良風(fēng)味較多，與其他樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異較大；S2 糙小米發(fā)酵飲料、S6 發(fā)芽糙小米發(fā)酵飲料、S3 富硒糙小米飲料、S7富硒發(fā)芽糙小米飲料和S5 發(fā)芽糙小米飲料為一類，此類樣品中揮發(fā)性物質(zhì)較接近，如產(chǎn)生了壬酸、乙偶姻等風(fēng)味好的物質(zhì)，但仍能檢測出具有豆腥味的正己醇，這與前面結(jié)果相一致；S4 和S8 為一類，證明S4 和S8 中揮發(fā)性物質(zhì)較接近，如壬酸、乙偶姻等含量較高，但在S8 中并未檢測出豆腥味的正己醇，證明發(fā)芽后飲料風(fēng)味要優(yōu)于未發(fā)芽飲料，這與陸晨浩等[23]研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

采用感官評定以及電子鼻、電子舌和GC?MS 技術(shù)，對不同處理的糙小米飲料進(jìn)行分析。感官評定結(jié)果表明，不同處理的糙小米飲料感官評價差異明顯。電子舌和電子鼻測定結(jié)果表明，經(jīng)發(fā)酵后的飲料苦味、澀味、苦味的回味、澀味的回味要低于未發(fā)酵飲料，從試驗結(jié)果可以看出，發(fā)酵在改良富硒發(fā)芽糙小米飲料滋味上具有可行性。應(yīng)用GC?MS 技術(shù)結(jié)合聚類分析，結(jié)果表明，發(fā)芽使飲料風(fēng)味豐富而減少糙小米的不良?xì)馕?，從而改善樣品氣味，富硒使揮發(fā)性物質(zhì)含量均有所增加，但檢測出的化合物種類減少；飲料發(fā)酵過程中產(chǎn)生了新的芳香性物質(zhì)如1?辛烯?3?醇、乙偶姻、壬酸等，賦予糙小米飲料蘑菇香、奶香，是富硒發(fā)芽糙小米發(fā)酵飲料的主要風(fēng)味物質(zhì)。相比之下，富硒發(fā)芽糙小米發(fā)酵飲料的風(fēng)味與口感都更有優(yōu)勢，營養(yǎng)更加豐富，因此具有較大的發(fā)展前景。本研究解決糙小米口感差的問題，有助于開發(fā)更多營養(yǎng)豐富、口感好的全谷物產(chǎn)品。