南極磷蝦磷脂的組成及其抗氧化活性

劉小芳，郭向融，2，李爽，辛云，2，蔣永毅，冷凱良，姜維

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)可持續(xù)利用重點實驗室，山東青島 266071；2.浙江海洋大學(xué)國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；3.青島菲優(yōu)特檢測有限公司，山東青島 266112）

受全球漁業(yè)資源衰退的影響，南極磷蝦作為可持續(xù)的漁業(yè)替代資源，近年來得到廣泛關(guān)注[1]。南極磷蝦生物量可達6.5～10億t，南極海洋生物資源養(yǎng)護委員會制定的謹慎性捕撈限額為561 萬t，而目前實際年捕撈量為20～40 萬t，因此，南極磷蝦資源的開發(fā)潛力巨大[2?3]。目前，國際南極磷蝦漁業(yè)已進入第二次快速發(fā)展期[2]，我國南極磷蝦漁業(yè)經(jīng)過10 余年發(fā)展也已初具規(guī)模，集生態(tài)高效捕撈與船載工業(yè)化加工于一體、由陸基高附加值產(chǎn)品拉動的產(chǎn)業(yè)鏈基本形成[2?3]。南極磷蝦富含優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、幾丁質(zhì)等成分[4?7]，是良好的營養(yǎng)健康食品和生物醫(yī)藥制品的生產(chǎn)原料，但目前精深加工產(chǎn)品僅有南極磷蝦油和南極磷蝦蛋白肽[1?2]，資源整體的高值化利用程度仍然不高，一定程度上限制了產(chǎn)業(yè)鏈的深度延伸和產(chǎn)業(yè)價值的有效提升。挖掘并明確南極磷蝦營養(yǎng)成分的活性作用，對于指導(dǎo)南極磷蝦高值產(chǎn)品開發(fā)和拓展產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域十分必要。

磷脂是分子結(jié)構(gòu)中結(jié)合有磷酸基團的極性脂質(zhì)成分，其不僅是構(gòu)成生物細胞膜的基礎(chǔ)物質(zhì)，同時參與多種營養(yǎng)成分的消化、吸收和運輸過程，在調(diào)節(jié)機體的生理機能和代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8]。因磷脂抗氧化能力良好，其作為添加劑和營養(yǎng)補充劑已應(yīng)用于食品、化妝品和功能制品等領(lǐng)域[9]。目前商品化生產(chǎn)的磷脂主要提取自大豆、卵黃等陸基食品原料，為滿足市場發(fā)展的需求，水產(chǎn)食品原料來源磷脂的開發(fā)在近年來備受關(guān)注[10?11]，從大黃魚魚卵[12]、鯖魚[13]、三文魚魚骨[14]、草魚頭[15]、近江牡蠣[16]中提取的磷脂陸續(xù)被證明抗氧化能力顯著。南極磷蝦的總脂含量豐富，磷脂占比達到總脂含量的40%左右[5，17?18]，是提取、生產(chǎn)磷脂的優(yōu)質(zhì)原料，但目前關(guān)于南極磷蝦磷脂的抗氧化活性鮮見報道。綜上，本研究以南極磷蝦油為原料進行南極磷蝦磷脂的分離純化，以大豆磷脂和卵黃磷脂為對照，對南極磷蝦磷脂的組成特征和抗氧化活性進行分析評價，旨在為南極磷蝦磷脂在抗氧化制品領(lǐng)域的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持，為南極磷蝦脂質(zhì)類高值產(chǎn)品的定向開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦油：青島南極維康生物科技有限公司；大豆磷脂、卵黃磷脂（純度均≥90%）：北京索萊寶科技有限公司；玻璃層析柱（80 mm×500 mm）、薄層層析硅膠板（GF254）、柱層析硅膠（200～300 目）：青島勝海精細硅膠化工有限公司；37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphati?dylethanolamine，PE）等標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）、正己烷（色譜純）、異丙醇（色譜純）：默克生命科學(xué)有限公司；1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（1，1?diphenyl?2?picrylhy?drazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2，2′?聯(lián)氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸[2，2′?azino?bis（3?ethylbenzothiazoline?6?sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海麥克林生化科技股份有限公司；抗壞血酸：西隴化工股份有限公司；氯仿、丙酮、乙醚、硫酸：青島潤嵩化學(xué)科技有限公司；甲醇、乙醇、正己烷、乙酸、三氯乙酸、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲酸銨：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。除特殊標(biāo)記外，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BAS 224S?CW 型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Neofuge 15R 高速冷凍離心機：上海力申科學(xué)儀器有限公司；RE52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；MD 200 型氮吹儀：杭州奧盛儀器有限公司；LC?16 型液相色譜儀（配置Essentia ELSD?16 型蒸發(fā)光散射檢測器）：日本島津公司；HP 6890 型氣相色譜儀[配置氫火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）]：美國安捷倫公司；ST 3100 型pH 計：奧斯豪儀器（常州）有限公司；HH?4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；UV 1102Ⅱ型紫外可見分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦磷脂分離純化

參考文獻[19]的方法進行分離純化，800 g 柱層析硅膠于110 ℃活化12 h，冷卻至室溫后，采用濕法裝柱，待硅膠沉降完全后，用氯仿進行壓柱，使層析柱中的硅膠裝填密實。用少量氯仿溶解30 g 南極磷蝦油，緩慢倒入層析柱中，使樣品與硅膠充分吸附，然后依次用20 倍柱體積的氯仿和丙酮進行洗脫，經(jīng)薄層層析色譜[展開劑為正己烷∶乙醚∶乙酸=85∶15∶1（體積比），碘蒸氣顯色]確認中性脂和糖脂去除完全后，更換洗脫液為20 倍柱體積的甲醇，繼續(xù)洗脫，合并甲醇洗脫液，減壓濃縮得到南極磷蝦磷脂樣品12.65 g。

1.3.2 大豆磷脂及卵黃磷脂純化

參考文獻[19]的方法進行純化，大豆磷脂及卵黃磷脂采用20倍體積（體積質(zhì)量比）經(jīng)4 ℃預(yù)冷的丙酮反復(fù)洗滌3 次，收集丙酮不溶物，減壓濃縮去除殘留的有機溶劑，即得大豆磷脂和卵黃磷脂樣品。

1.3.3 磷脂含量測定

按照GB/T 5537—2008《糧油檢驗磷脂含量的測定》中的鉬藍比色法進行測定。

1.3.4 磷脂組成測定

參照文獻[17]的方法進行磷脂組成測定，適量分離純化得到的磷脂樣品，采用氯仿?甲醇溶液（2∶1，體積比）溶解，通過液相色譜法分析磷脂組成，不同磷脂組分經(jīng)外標(biāo)法定量后，分別計算各自在總磷脂中的比例。色譜條件：ZORBAX Rx?SIL 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL；漂移管溫度60 ℃；霧化器壓力0.17 MPa；流動相A為正己烷∶異丙醇∶5 mmol/L 甲酸銨（82∶17∶1，體積比）；流動相B為異丙醇∶水∶5 mmol/L 甲酸銨（85∶14∶1，體積比）；梯度洗脫程序：0 min A 與B 體積比為100∶0，5 min A 與B體積比為80∶20，7 min A與B體積比為60∶40，17 min A與B 體積比為30∶70，23 min A 與B 體積比為0∶100，25 min A 與B 體積比為0∶100，26 min A 與B 體積比為100∶0，30 min 洗脫程序結(jié)束。在20～500 mg/L 濃度范圍內(nèi)，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的對數(shù)值（X）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)峰面積的對數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，PC 定量方程為Y=1.118 8X+3.430 9，R2=0.998 7；PE 定量方程為Y=1.339 3X+2.786 2，R2=0.997 6。

1.3.5 脂肪酸組成測定

參照文獻[17]的方法進行脂肪酸組成測定，適量分離純化得到的磷脂樣品經(jīng)甲酯化處理后，采用氣相色譜法測定脂肪酸組成，采用峰面積歸一化法進行定量分析。色譜條件：INNOWAX毛細管柱（0.32 mm×30 m，0.25μm），檢測器采用FID，載氣為氮氣；進樣口參數(shù)：進樣口溫度240 ℃，分流比15∶1，進樣量1μL；升溫程序：起始溫度170 ℃，以3 ℃/min升溫至210 ℃，保持30 min；FID 參數(shù)：檢測器溫度250 ℃，氫氣流速40 mL/min，空氣流速450 mL/min，尾吹氮氣流速40 mL/min。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力測定

參照文獻[20]的方法進行測定，將5 mL 7 mmol/L ABTS 溶液與88 mL 25 mmol/L 過硫酸鉀溶液混合，室溫避光儲存12～16 h，采用乙醇稀釋至734 nm 處吸光值為0.70±0.02，配制成ABTS 試劑。0.15 mL 不同濃度的磷脂乙醇溶液與3.0 mL ABTS 試劑混合，室溫避光反應(yīng)20 min，在734 nm波長下測定吸光值（A樣品），用等量乙醇代替ABTS試劑測定相應(yīng)吸光值（A空白），等量乙醇代替磷脂溶液測定相應(yīng)吸光值（A對照），ABTS+自由基清除率（S，%）計算公式如下。

1.3.7 DPPH自由基清除能力測定

參照文獻[12]的方法進行測定，不同濃度的磷脂乙醇溶液與等體積0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液混合，室溫避光反應(yīng)20 min，在517 nm波長下測定吸光值（B樣品），用等量乙醇代替DPPH乙醇溶液測定相應(yīng)吸光值（B空白），等量乙醇代替磷脂溶液測定相應(yīng)吸光值（B對照），DPPH自由基清除率（R，%）計算公式如下。

1.3.8 還原能力測定

參照文獻[15]的方法進行測定，1 mL 不同濃度的磷脂乙醇溶液，加入1 mL 超純水和1 mL 0.1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴避光反應(yīng)20 min，快速冷卻至室溫后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，5 000 r/min 離心10 min，取1 mL 上清液加入1 mL 超純水和500 μL 0.1%氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，于700 nm 波長下測定吸光值（C樣品），用0.05 mg/mL 抗壞血酸溶液代替磷脂樣品測定相應(yīng)吸光值（C對照），以磷脂樣品可達到抗壞血酸還原效果的程度表征其還原能力，還原能力（Q，%）計算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，采用Excel 2016、IBM SPSS 27.0、Origin 2018 軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制。采用單因素方差分析進行組間多重比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦磷脂的組成特征

硅膠柱層析法是分離純化制備高純度磷脂的經(jīng)典方法，氯仿?丙酮?甲醇依次洗脫是最常用的一種洗脫體系[10，21]。南極磷蝦磷脂的組成、薄層層析色譜、脂肪酸組成分別如表1、圖1、表2所示。

圖1 南極磷蝦磷脂的薄層層析色譜Fig.1 Thin layer chromatography of phospholipids from Antarctic krill

表1 南極磷蝦磷脂的組成Table 1 Composition of phospholipids from Antarctic krill

表2 南極磷蝦磷脂的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of phospholipids from Antarctic krill

由表1和圖1可知，經(jīng)硅膠柱層析純化后得到的南極磷蝦磷脂純度較高，其磷脂含量達到（93.78±3.18）g/100 g。南極磷蝦磷脂主要為PC，含有少量的PE，分別占總磷脂的（90.60±1.03）%和（5.08±1.10）%，這與卵黃磷脂的磷脂組成較為相似，而與大豆磷脂的磷脂組成差異顯著（P＜0.05）。由表2 可知，南極磷蝦磷脂中二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA，C20∶5）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，C22∶6）的含量豐富，分別占總脂肪酸含量的（31.75±0.24）%和（19.35±0.10）%，這與大豆磷脂富含亞油酸（C18∶2）和棕櫚酸（C16∶0）、卵黃磷脂富含棕櫚酸（C16∶0）和油酸（C18∶1）的脂肪酸組成特征明顯不同，以上研究結(jié)果與已有文獻報道一致[5，17，19，22]。綜合磷脂組成和磷脂脂肪酸組成結(jié)果可知，南極磷蝦磷脂是典型的海洋EPA/DHA 磷脂。已有研究指出，與大豆磷脂和卵黃磷脂等陸基食品原料來源磷脂相比，海洋EPA/DHA 磷脂的功能活性更優(yōu)[23]。目前，大豆磷脂和卵黃磷脂已作為抗氧化劑被廣泛使用[9]，南極磷蝦磷脂在抗氧化方面的作用效果值得研究。

2.2 南極磷蝦磷脂的ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除能力是評估抗氧化劑活性強弱的常用方法之一。ABTS在氧化劑作用下被氧化生成綠色的ABTS+自由基，抗氧化劑可抑制ABTS+自由基的產(chǎn)生[24]。南極磷蝦磷脂的ABTS+自由基清除能力見圖2。

圖2 南極磷蝦磷脂的ABTS+自由基清除能力Fig.2 ABTS+free radical scavenging ability of phospholipids from Antarctic krill

由圖2可知，南極磷蝦磷脂在10～50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，ABTS+自由基清除率為（32.30±2.27）%～（98.70±0.58）%；隨著磷脂濃度的升高，ABTS+自由基清除活性明顯增強，并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。與已有報道的鯖魚肌肉磷脂（濃度100 mg/mL時ABTS+自由基清除率約為90%）[13]、三文魚魚骨磷脂（濃度100 mg/mL 時ABTS+自由基清除率為55.60%）[14]相比，南極磷蝦磷脂具有更強的ABTS+自由基清除能力。經(jīng)計算，南極磷蝦磷脂清除ABTS+自由基的IC50值為15.78 mg/mL，低于南極磷蝦油（IC50值17.84 mg/mL）、大豆磷脂（IC50值30.42 mg/mL）和卵黃磷脂（IC50值31.36 mg/mL）。南極磷蝦磷脂清除ABTS+自由基的效果顯著優(yōu)于大豆磷脂和卵黃磷脂（P＜0.05）。綜上可知，南極磷蝦磷脂具有良好的ABTS+自由基清除能力。

2.3 南極磷蝦磷脂的DPPH自由基清除能力

DPPH 自由基是一種以氮為中心較穩(wěn)定的自由基，其溶于乙醇后呈藍紫色，與抗氧化劑相互作用后顏色變淡，通過顏色變化程度可判斷抗氧化劑活性的強弱[24]。南極磷蝦磷脂的DPPH自由基清除能力見圖3。

圖3 南極磷蝦磷脂的DPPH 自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging ability of phospholipids from Antarctic krill

由圖3可知，南極磷蝦磷脂在10～50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，DPPH 自由基清除率為（36.14±1.32）%～（91.33±0.67）%；隨著磷脂濃度的升高，DPPH自由基清除活性明顯增強，并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。南極磷蝦磷脂清除DPPH自由基的能力強于鯖魚肌肉磷脂（濃度100 mg/mL時DPPH自由基清除率約為50%）[13]和三文魚魚骨磷脂（濃度100 mg/mL時DPPH自由基清除率為75.48%）[14]，但弱于大黃魚魚卵磷脂（濃度20 μg/mL 時DPPH 自由基清除率為47.80%）[12]。經(jīng)計算，南極磷蝦磷脂清除DPPH 自由基的IC50值為14.87 mg/mL，低于卵黃磷脂（IC50值15.07 mg/mL）、南極磷蝦油（IC50值20.27 mg/mL）和大豆磷脂（IC50值24.21 mg/mL）。南極磷蝦磷脂清除DPPH 自由基的作用效果與卵黃磷脂相近，明顯優(yōu)于大豆磷脂。綜上可知，南極磷蝦磷脂具有良好的DPPH自由基清除能力。

2.4 南極磷蝦磷脂的還原能力

鐵氰化鉀與抗氧化劑混合后被還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀進一步與鐵離子發(fā)生反應(yīng)生成普魯士藍，其在700 nm 波長處有較大的吸收，吸光值越大則抗氧化劑的還原能力越強[15，25]。南極磷蝦磷脂的還原能力見圖4。

圖4 南極磷蝦磷脂的還原能力Fig.4 Reducing capacity of phospholipids from Antarctic krill

由圖4可知，南極磷蝦磷脂在10～50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，其還原能力相當(dāng)于抗壞血酸對照溶液還原能力的（25.88±0.59）%～（56.54±0.61）%；隨著磷脂濃度的升高，還原能力明顯增強，并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。南極磷蝦磷脂的還原能力弱于南極磷蝦油，推測這可能與南極磷蝦油中含有蝦青素[5]，而柱層析洗脫時極性較低的蝦青素已與極性較高的磷脂實現(xiàn)分離有關(guān)。南極磷蝦磷脂的還原能力明顯優(yōu)于大豆磷脂和卵黃磷脂，這與岳大鵬等[15]發(fā)現(xiàn)從草魚頭提取的海洋磷脂還原能力顯著優(yōu)于大豆磷脂的結(jié)果一致。綜上可知，南極磷蝦磷脂具有良好的還原能力。

3 結(jié)論

本研究采用柱層析法分離制備南極磷蝦磷脂，并對其組成特征和抗氧化活性進行分析評價。組成分析結(jié)果表明：南極磷蝦磷脂以PC 為主，含有少量PE；富含多不飽和脂肪酸，且主要為EPA 和DHA；南極磷蝦磷脂是典型的海洋EPA/DHA 磷脂?？寡趸钚栽u價結(jié)果表明：南極磷蝦磷脂具有良好的ABTS+自由基和DPPH 自由基清除能力以及還原能力，且其作用效果明顯優(yōu)于大豆磷脂和卵黃磷脂。不同來源磷脂的抗氧化活性差異明顯，推測這與各磷脂中不同磷脂組分的比例、結(jié)合的多不飽和脂肪酸總量等存在差異有關(guān)。南極磷蝦磷脂在抗氧化制品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，未來研究可關(guān)注其在生物體內(nèi)發(fā)揮抗氧化的作用效果及內(nèi)在機制。本研究對于指導(dǎo)南極磷蝦高值產(chǎn)品開發(fā)以及支撐加工產(chǎn)業(yè)鏈深度延伸具有積極意義。