姜黃聯(lián)合山楂對C57 肥胖小鼠的減肥作用及機制研究

李 強，李亞婷，徐華健，郝宗圍，陳鵬浩，司雄元，汪雪雁,

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，安徽合肥 230036）

肥胖是一種復(fù)雜的慢性疾病。研究表明，目前我國城鄉(xiāng)居民超重或肥胖人數(shù)已超過總?cè)丝谝话?，慢性病發(fā)病率顯著上升[1]。顯然膳食結(jié)構(gòu)是引起肥胖和慢性病因素之一[2]。目前關(guān)于肥胖的定義有兩種：一種是世界衛(wèi)生組織所提倡的采用BMI 指數(shù)進行分類以定義肥胖等級[3]，另一種是通過機器檢測人體體脂率表明人體的肥胖程度[4]。研究表明，肥胖不僅通過影響人們的心理健康導(dǎo)致死亡率上升，也會引起人體疾病產(chǎn)生嚴重危害[5]，如：非酒精性脂肪肝[6]、血脂異常、2 型糖尿病[7]、高血壓[8]、生殖障礙[9]，甚至引發(fā)相關(guān)器官組織的癌癥病變[10]。當(dāng)前可通過調(diào)節(jié)以下機制來治療肥胖：調(diào)節(jié)體內(nèi)神經(jīng)肽Y 的激素水平可調(diào)節(jié)食欲，維持機體能量平衡[11]；抑制糖類、脂類相關(guān)酶的活性。通過抑制脂肪酶、糖苷酶以及淀粉酶的活性減少胃腸道對食物的吸收，進而降低機體內(nèi)的能量攝入[12]；抑制前脂肪細胞分化和增殖。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）在脂肪代謝過程中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，在調(diào)節(jié)前脂肪細胞的分化和增殖有重大作用，在此過程中還與CCAAT/增強子結(jié)合蛋白（C/EBP）共同調(diào)控[13]。

復(fù)方在中藥的應(yīng)用調(diào)節(jié)上有整體觀念，其化學(xué)組成的多成分特性，藥理作用的多靶點功效，相比單一的天然提取物或單一靶點的西藥具有更明顯的優(yōu)勢[14]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃（Curcuma longaL.）與山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）聯(lián)用可能具有協(xié)同增效的作用[15]，但還未得到更進一步的證實以及機理方面的探討。姜黃含有姜黃素、倍半萜、二萜、三萜、甾醇、生物堿等功能性成分[16]。姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素在抗氧化、抗炎和抗增殖作用有著不同的優(yōu)勢[17]。因此姜黃的抗氧化、抗炎、抗癌、抗衰老、止痛等作用也就更為明確[18-19]。姜黃素的生物利用率比較低。有研究顯示，姜黃中的姜黃油可以提高姜黃素的生物利用度[20]。山楂為薔薇科植物的干燥成熟果實，消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂。山楂含有豐富的類黃酮及其衍生物、多糖、有機酸類化合物、萜類化合物[21]。山楂由于在心血管治療、抗氧化、抗菌等方面作用突出，成為了植物治療和食品應(yīng)用中非常受歡迎的草藥[22]。

綜上所述，雖然已有姜黃、山楂在降血脂、2 型糖尿病以及抗氧化方面的研究，但針對二者聯(lián)合在治療肥胖及機制上的研究還未見報道。山楂和姜黃同屬藥食同源類產(chǎn)品，其安全性能夠保障。同時人們也傾向于天然、可持續(xù)的植物活性成分的藥物，而此類藥物多數(shù)兼具安全性、療效性、高利用度和低成本等優(yōu)勢[23]。本文以姜黃和山楂為研究對象，探究姜黃和山楂對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的減肥作用及可能機制，為后續(xù)藥食同源產(chǎn)品的聯(lián)用，以及姜黃-山楂產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57BL/6JNifdc 小鼠，SPF 級、雄性、5～6 周、32 只 由浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0001，動物合格證編號：No.20220316Abzz0600 000749；60%高脂飼料（TP23300）南通特洛菲飼料科技有限公司；維持飼料 江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；姜黃、山楂 北京同仁堂；多聚甲醛固定液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；脂肪固定液 上海源葉生物科技有限公司；二甲苯、中性樹膠 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（色譜純）、HE 染液、分化液、返藍液 Servicebio；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT/GOT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST/GOT）試劑盒 南京建成生物工程研究所；DNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 賽默飛。

Allegra 64R 高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；Multiskan FC 酶標儀 美國BIOTEK 公司；LF50 小動物組分分析儀 德國布魯克公司；JJ-12J 脫水機 武漢俊杰電子有限公司；JB-P5包埋機 武漢俊杰電子有限公司；RM2255 切片機上海徠卡儀器有限公司組織；KD-Pll 攤片機 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；Ni-E 正置光學(xué)顯微鏡 日本尼康；ECLIPSE-Ti2 成像系統(tǒng) 日本尼康；GHC50023 電子秤 泊名臻品；580 血糖儀 魚躍；VeritiPro PCR 儀 賽默飛。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗與分組處理 32 只雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠（體質(zhì)量18～22 g）飼養(yǎng)條件：動物房濕度40%～70%，溫度（23±3）℃，壓差10～30 Pa，光照黑暗各12 h，飼養(yǎng)于安徽省合肥市安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)國家重點實驗室SPF 級動物房，自由攝取食物和飲水。適應(yīng)性飼喂1 周，隨機分為正常組、正常干預(yù)組、高脂組、高脂干預(yù)組，每組8 只。正常組飼喂基礎(chǔ)飼料，高脂組飼喂高脂飼料。姜黃和山楂粉碎過60 目篩，制成粉末，純水灌胃，各干預(yù)組按照姜黃、山楂各390 mg/kg 混合灌胃（劑量參照中國藥典，灌胃溶液參照丸劑劑量），連續(xù)灌胃12 周，處死前禁食12 h，采用4%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，頸椎脫臼處死，血液經(jīng)2000 r/min 離心10 min，取上清備用。附睪脂肪保存于脂肪固定液。肝臟分別保存于多聚甲醛固定液、RNAlater 保存液、-80 ℃環(huán)境中。本研究動物實驗獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理委員會批準，倫理編號AHAU2022019。

1.2.2 小鼠體重檢測 從小鼠適應(yīng)一周開始，每周同一時間稱量體重。

1.2.3 小鼠攝食飲水量的測定 每周同一時間更換小鼠墊料，同時統(tǒng)計小鼠飲水、攝食量。

1.2.4 小鼠體質(zhì)成分的測定 將機器進行日常開機檢驗，用酒精將檢測筒擦拭干凈，同時在檢測過程中及時清理小鼠產(chǎn)生的異物，避免沾染其它小鼠的氣味對實驗造成影響。每周同一時間測定小鼠體質(zhì)成分。

1.2.5 小鼠隨機血糖的測定 每隔兩周在同一時間測定小鼠的隨機血糖，采用尾尖取血，棄去第一滴血。

1.2.6 小鼠血清生化指標檢測 以試劑盒測定小鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT 含量，測定方法嚴格按照說明書操作。

1.2.7 肝組織病理學(xué)檢查 參照溫永平等[24]的方法并稍作修改，取小鼠同部位的肝臟組織一小塊，置于4%多聚甲醛固定液，固定48 h 以后，脫水浸蠟、包埋和切片后制成厚度為4 μm 的石蠟切片，經(jīng)蘇木素-伊紅染色后，脫水封片，放置顯微鏡鏡檢，采集圖像進行分析，過程中注意細胞核分化以及蘇木素、伊紅效價。

1.2.8 脂肪組織病理學(xué)檢查 取同一部位小鼠附睪脂肪，置于脂肪固定液中固定48 h 后，參照1.2.7 肝臟組織病理學(xué)檢查進行操作。

1.2.9 實時熒光定量PCR 法測定肝臟中脂質(zhì)代謝通路中mRNA 相對表達量 參考沈海亮[25]的方法并稍作修改，提取各組小鼠肝組織的總RNA，測定其濃度和純度，稀釋濃度過高的RNA 使其最終濃度為100～500 ng/μL，隨即使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用qPCR 法測定膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、肝X 受體α（Liver X Receptorα，LXRα）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（Sterol Regulatory Element Binding Protein，SREBP2）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C（Sterol Regulatory Element Binding Protein，SREBP1C）、硬脂酰輔酶A 去飽和酶（Steary-coenzyme A dehydro-synthase-1，SCD1）的mRNA 相對表達量。反應(yīng)體系：在0.2 mL 的PCR 管內(nèi)加入，2×qPCR Mix（7.5 μL），2.5 μmol/L 上下游基因引物（1.5 μL），cDNA（2.0 μL），添Water Nuclease-Free（4.0 μL）。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，40 個循環(huán)（95 ℃變性15 s，60 ℃延伸 30 s），溶解曲線選擇在65～95 ℃，每升溫0.5 ℃，采集一次熒光信號。選擇GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列如表1 所示。

表1 熒光qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescence qPCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 軟件統(tǒng)計處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（Mean±SEM）表示，采用單因素ANOVA分析，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃聯(lián)合山楂對小鼠體重的影響

研究表明高脂飲食可以增加機體體質(zhì)量[26]，相比正常小鼠，體重超過20%可定義為肥胖[27]。由圖1可知，在12 周的實驗期間，各組小鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長趨勢，增長差異較大。隨著時間的增加，高脂組與正常組相比，體重顯著升高（P＜0.05），當(dāng)實驗到達第六周時，相比高脂組，高脂干預(yù)組顯著降低直至實驗結(jié)束（P＜0.05）。而在整個實驗期間，相比正常組，正常干預(yù)組的體重沒有顯著差異，說明姜黃-山楂聯(lián)合干預(yù)對正常組小鼠體重沒有影響。在第12 周結(jié)束時，正常組小鼠平均體質(zhì)量達到28.56 g，相比正常組，高脂組平均體質(zhì)量增加46.88%，差異高度顯著（P＜0.001）。相比高脂組，高脂干預(yù)組平均體質(zhì)量下降13.4%，差異極顯著（P＜0.01），說明姜黃-山楂聯(lián)用可以有效減緩小鼠體質(zhì)量的增加。圖中可以看到，在最初的兩周干預(yù)組平均體重上升比非干預(yù)組快，這可能是由于山楂的健胃消食作用。

圖1 姜黃-山楂聯(lián)用對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of turmeric-hawthorn combination on body mass of mice

2.2 姜黃聯(lián)合山楂對小鼠攝食、飲水的影響

如圖2a、2b 所示，總體而言，相比正常組，正常干預(yù)組的攝食、飲水量差異不大。相比高脂組，高脂干預(yù)組的攝食、飲水量差異不大。說明姜黃-山楂聯(lián)用，對小鼠的飲水、攝食量無影響。高脂組和高脂干預(yù)組攝食量和飲水量低于正常組和正常干預(yù)組。這可能是由于飲食結(jié)構(gòu)的不同，維持飼料提供的能量遠低于高脂飼料，這可能是導(dǎo)致高脂組攝食量減少的原因，此結(jié)果與夏海梅等[28]的研究一致。

圖2 姜黃-山楂聯(lián)用對小鼠攝食、飲水的影響Fig.2 Effect of turmeric-hawthorn combination on feeding and drinking in mice

2.3 姜黃聯(lián)合山楂對小鼠體質(zhì)成分的影響

本實驗將監(jiān)測小鼠體質(zhì)成分所得數(shù)據(jù)分為脂肪率（總脂肪含量/體重）和瘦肉率（總瘦肉含量/體重），目前，越來越多的人認為，脂肪含量和肥胖息息相關(guān)[29]。圖3a 為監(jiān)測所得各階段小鼠脂肪率，正常干預(yù)組長期穩(wěn)定在7%左右的脂肪率，正常組長期穩(wěn)定在10%左右，實驗結(jié)束最后一周差異不顯著（P＞0.05）。與正常組相比，實驗第一周，高脂組脂肪率差異高度顯著（P＜0.001），隨時間增加，高脂組脂肪率由10%上升至28%。相比于高脂組，高脂干預(yù)組脂肪率上升緩慢，由實驗開始時10%上升至22%，差異顯著（P＜0.05），說明姜黃聯(lián)合山楂能夠抑制小鼠脂肪率的增加。研究表明，瘦肉率能夠間接反映機體肥胖程度[30]。圖3b 為監(jiān)測所得小鼠瘦肉率。正常干預(yù)組長期穩(wěn)定在70%左右的瘦肉率，正常組長期穩(wěn)定在68%左右，實驗結(jié)束時差異不顯著（P＞0.05）。實驗第一周，正常干預(yù)組與正常組具有顯著差異（P＜0.05），說明姜黃-山楂聯(lián)用能夠調(diào)高小鼠體內(nèi)瘦肉率的含量。與正常組相比，高脂組瘦肉率由開始時的70%下降至54%，實驗結(jié)束時差異極顯著（P＜0.01）。相比高脂組，高脂干預(yù)組瘦肉率由70%下降至60%，實驗結(jié)束時差異顯著（P＜0.05），說明姜黃-山楂聯(lián)用，能夠有效地減緩小鼠體內(nèi)瘦肉含量的下降，因此，攝入姜黃和山楂能夠減少小鼠體內(nèi)脂肪含量，增加小鼠體內(nèi)瘦肉的含量，從而起到預(yù)防肥胖的作用。

圖3 姜黃-山楂聯(lián)用對小鼠體質(zhì)成分的影響Fig.3 Effect of turmeric-hawthorn combination on the body composition of mice

2.4 姜黃聯(lián)合山楂對小鼠隨機血糖的影響

研究表明，肥胖人群通常隨機血糖也普遍較高[31]。實驗為盡可能地保證小鼠生長周期減少外在環(huán)境的影響，進行了對小鼠12 周的隨機血糖監(jiān)測。如圖4所示，除干預(yù)組外，各組小鼠血糖值相對穩(wěn)定。高脂組血糖值最高，但都未達到11.1 mmol/L（高血糖標準）。相比正常組，高脂組小鼠血糖含量差異極顯著（P＜0.01）。除試驗期間第四周外，相比高脂組，高脂干預(yù)組血糖極顯著下降（P＜0.01），有時甚至低于正常組，說明姜黃-山楂聯(lián)用在控制小鼠隨機血糖的水平上，具有較好的效果。這與LIU 等[32]、ADAB 等[33]的研究一致。

圖4 姜黃-山楂聯(lián)用對小鼠隨機血糖的影響Fig.4 Effect of turmeric-hawthorn combination on random blood glucose in mice

2.5 姜黃聯(lián)合山楂對小鼠血清生化指標的影響

如圖5 a～d 所示，與正常組相比，高脂組血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平差異高度顯著（P＜0.001）。相比高脂組，高脂干預(yù)組能夠高度顯著降低高脂小鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平（P＜0.001），高度顯著升高HDL-C 水平（P＜0.001），這可能是姜黃-山楂參與了小鼠的脂代謝，降低了血清中TC、TG、LDL-C 含量，升高了HDL-C 含量。說明姜黃-山楂聯(lián)用具有較好的降脂效果。圖5e、5f 所示，與正常組相比，高脂組能夠高度顯著升高小鼠血清中AST、ALT 的含量（P＜0.001）。相比高脂組，高脂干預(yù)組能夠顯著降低小鼠血清中AST、ALT 含量（P＜0.001）。這與TAN 等[34]的研究結(jié)果一致。說明姜黃-山楂聯(lián)用能夠降低小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白膽固醇水平，升高血清中的高密度脂蛋白膽固醇水平，并且能夠保護高脂飲食對肝臟帶來的損傷?？赡苁墙S中含有的姜黃素、姜黃油，以及山楂中的黃酮類等成分對機體產(chǎn)生的抗炎、降脂等作用[35-37]，從而達到了預(yù)防肥胖的目的。

圖5 姜黃-山楂聯(lián)用對小鼠血清生化指標的影響Fig.5 Effect of turmeric-hawthorn combination on serum biochemical indexes of mice

2.6 肝臟病理學(xué)分析

如圖6 所示，各組小鼠肝臟組織經(jīng)HE 染色，可以看出正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)緊密、分界清晰，組織結(jié)構(gòu)無異常，細胞內(nèi)未見明顯脂滴，肝竇未見擠壓或擴張。正常干預(yù)組肝細胞排列有序，未發(fā)現(xiàn)明顯異常，表明姜黃-山楂無肝毒性。與正常組相比，高脂組細胞排列混亂，邊界不清晰，肝質(zhì)疏松。大量干細胞呈球狀樣變，間隙內(nèi)含有較多脂肪空泡，核仁偏移。肝細胞壞死，炎性細胞浸潤、血管周圍肝細胞腫脹明顯。與高脂組相比，高脂干預(yù)組邊界模糊、脂肪空泡、核仁偏移改善明顯，血管周圍的脂質(zhì)松散現(xiàn)象以及細胞腫脹有較大改善。說明姜黃-山楂能夠改善肝臟脂肪病變。這同時與圖5e、5f 中肝臟內(nèi)AST、ALT 的降低互相佐證，姜黃-山楂能夠起到對肝臟的保護作用。

圖6 肝臟病理學(xué)切片（×400）Fig.6 Pathological section of the liver（×400）

2.7 附睪脂肪病理學(xué)分析

如圖7 所示，脂肪病理學(xué)切片顯示，正常組小鼠附睪脂肪細胞排列整齊、大小均勻，細胞質(zhì)充盈，未見明顯異常。正常干預(yù)組，細胞無明顯異常，細胞體積明顯小于正常組細胞。與正常組相比，高脂組細胞體積明顯增大，細胞質(zhì)減少，排列散亂，細胞大小不一。與高脂組相比，高脂干預(yù)組在細胞形態(tài)有明顯改善。雖然存在細胞大小不均的情況，但細胞質(zhì)充盈，排列緊密，細胞有減小情況。

圖7 附睪脂肪病理學(xué)切片（×200）Fig.7 Fat pathology section of epididymis（×200）

2.8 姜黃聯(lián)合山楂對肝臟脂代謝相關(guān)信號通路的影響

膽固醇的相關(guān)基因是調(diào)節(jié)脂代謝至關(guān)重要的作用機制[38]，研究表明，膽固醇被轉(zhuǎn)移到高密度脂蛋白顆粒中，并返回肝臟主要通過限速酶膽固醇CYP7A1轉(zhuǎn)化為膽汁酸[39]。膽固醇同時受膽汁酸分泌的影響，LXRα 調(diào)節(jié)膽汁酸的合成且能夠調(diào)控SREBP1C基因的表達[40]。SREBP2、SREBP1C在膽固醇的代謝中發(fā)揮重要作用且表達量較高[41]。SCD1可介導(dǎo)脂肪的積累，SCD1的表達對脂代謝具有重要影響[42]。FAS異常表達會導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)累積[43]。由圖8 實驗結(jié)果可以看出，與正常組相比，高脂組肝臟中CYPTA1mRNA 表達水平高度顯著下降（P＜0.001），與高脂組相比，高脂干預(yù)組CYPTA1mRNA 表達水平顯著上升（P＜0.05）。與高脂組相比，高脂干預(yù)組LXRα和SREBP1CmRNA 表 達水平極顯著下調(diào)（P＜0.01）。與SREBP1C功能相似，姜黃-山楂的干預(yù)可調(diào)節(jié)SCDmRNA，降低SCDmRNA 表達水平，差異高度顯著（P＜0.001）。其中SREBP2表達水平無顯著變化。此外本研究還測定了脂肪酸合成酶的相對表達量，與正常組相比，高脂組FASmRNA 表達水平高度顯著上升（P＜0.001），相比高脂組，高脂干預(yù)組FASmRNA 表達水平高度顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。因此推測姜黃協(xié)同山楂減肥的作用機制可能和CYPTA1、LXRα、SREBP1C、SCD、FASmRNA 表達水平有關(guān)。

圖8 肝臟組織中CYP7A1、LXRα、SREBP2、SREBP1C、SCD、FAS mRNA 水平Fig.8 CYP7A1,LXRα,SREBP2,SREBP1C,SCD,FAS mRNA levels in liver tissue

3 結(jié)論

姜黃-山楂聯(lián)用能夠有效減緩高脂飲食小鼠體質(zhì)量的增加，抑制小鼠血清中脂質(zhì)水平的升高，控制小鼠的隨機血糖水平，能夠有效減少體內(nèi)的脂肪積累、提高瘦肉率的轉(zhuǎn)化，從而達到預(yù)防肥胖的作用。其機制與姜黃-山楂聯(lián)用上調(diào)CYPTA1mRNA 的表達量和下調(diào)LXRα、SREBP1C、SCD、FASmRNA 表達量有關(guān)。從生理生化、病理學(xué)以及肝臟組織中mRNA的測定結(jié)果表明，姜黃和山楂聯(lián)用對C57 小鼠的減肥作用可能是調(diào)節(jié)脂代謝起到的作用，但機制的探索還需從蛋白水平以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等進行深入研究。關(guān)于中草藥在動物實驗中，多以提取物或已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)的制劑為研究對象，這可能會導(dǎo)致某些功能成分的損失。本實驗采用的是全粉進行干預(yù)，這為開展以全藥粉為加工工藝的工業(yè)化應(yīng)用提供了依據(jù)，減少了加工過程中的原料損失。