SPE-UPLC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定食品中24 種酸性工業(yè)染料

閔宇航，劉斯琪，余曉琴，李澍才，張麗平

（1.四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川成都 611731；2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（白酒監(jiān)管技術(shù)），四川成都 611731；3.成都紡織高等?？茖W(xué)校輕工與材料學(xué)院，四川成都 611731）

工業(yè)染料被廣泛應(yīng)用于毛皮制品、紡織品、陶瓷制品等工業(yè)產(chǎn)品的上色，具有色澤艷麗、價(jià)格低廉、不易褪色等優(yōu)點(diǎn)。工業(yè)染料多以苯、甲苯、萘等芳香族化合物為原料，經(jīng)過磺化、偶氮化等化學(xué)反應(yīng)而成，進(jìn)入人體后，會(huì)被腸道細(xì)菌分解成芳香胺，具有致癌和致突變性[1-2]。此外，還具有胚胎毒性，會(huì)造成發(fā)育異常[3]。酸性工業(yè)染料一般都是芳香族的磺酸鈉鹽，溶于水后電離成色素酸陰離子，能與氨基或酰胺基相結(jié)合，易上色于蛋白類產(chǎn)品[4]，近年來，食品中非法添加酸性工業(yè)染料的惡性事件屢禁不止，例如灌腸類肉制品中檢出紅2G[5]，鹵肉中檢出酸性橙Ⅱ[6]，黃三魚中非法添加酸性橙Ⅱ[7]，豆制品加工中非法添加酸性金黃G[8]等。針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，監(jiān)管部門加大了對(duì)食品中非法添加工業(yè)染料的打擊力度，近幾年也陸續(xù)發(fā)布了食品中工業(yè)染料的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，但是現(xiàn)行的檢測(cè)方法存在能檢測(cè)的酸性工業(yè)染料較少，基質(zhì)覆蓋不夠，通用性不強(qiáng)的問題，造成監(jiān)管存在較大漏洞。因此，建立一種包含化合物多、通用性強(qiáng)、能覆蓋多種高風(fēng)險(xiǎn)食品基質(zhì)的酸性工業(yè)染料檢測(cè)方法非常有必要。

目前，工業(yè)染料的檢測(cè)方法有薄層色譜法[9]、酶聯(lián)免疫法[10]、電化學(xué)分析法[11]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]，高效液相色譜法[14-15]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16-18]。由于食品基質(zhì)較為復(fù)雜，酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；薄層色譜法和電化學(xué)分析法的靈敏度較低，無(wú)法滿足日常風(fēng)險(xiǎn)篩查的需求；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法前處理較為復(fù)雜，檢測(cè)效率較低；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)以及前處理方式較為簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)[19]，被廣泛應(yīng)用于食品非法添加的檢測(cè)中，但是在質(zhì)譜檢測(cè)中由于基質(zhì)中的磷脂、膽固醇、蛋白質(zhì)等內(nèi)源性物質(zhì)會(huì)影響目標(biāo)分析物的離子化效率，使得目標(biāo)分析物的質(zhì)譜信號(hào)增加或者減弱，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，造成定量測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確的問題[20]。

本研究擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），結(jié)合固相萃?。⊿PE）凈化技術(shù)降低基質(zhì)效應(yīng)，建立能覆蓋非法添加的高風(fēng)險(xiǎn)食品基質(zhì)包括肉制品、豆制品、水產(chǎn)品和調(diào)味品中24 種酸性工業(yè)染料的測(cè)定方法，以期為工業(yè)染料的非法添加監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙黃Ⅳ、紅2G、甲基橙、喹啉黃、酸性橙Ⅱ、酸性橙3、酸性橙10、酸性橙12、酸性橙20、酸性紅26、酸性紅52、酸性大紅GR、酸性紅87、酸性黃17、酸性金黃G、酸性藍(lán)1、酸性藍(lán)3、酸性藍(lán)7、酸性藍(lán)83、酸性藍(lán)90、酸性藍(lán)113、酸性綠16、酸性紫43、鉻藍(lán)SE 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司，純度均大于98%；Cleanert PWAX 固相萃取小柱（150 mg，6 mL）天津博納艾潔爾科技有限公司；Oasis WAX 固相萃取小柱（150 mg，6 mL）美國(guó)Waters 公司；WondaSep WAX 固相萃取小柱（150 mg，6 mL）日本島津公司；0.25 μm 聚四氟乙烯（Poly tetra fluoroethylene，PTFE）濾膜、0.25 μm 聚偏氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）濾膜、0.25 μm 聚丙烯濾膜（Polypropylene，PP）濾膜、0.25 μm 尼龍（Nylon，PA）濾膜 天津億鼎鑫分析儀器有限公司；乙腈、乙酸銨 色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；氨水 分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司；水產(chǎn)品、調(diào)味品、肉制品、豆制品各40 批次 購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

ACQUITY UPLC?BEH C18色譜分析柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）美國(guó)WatersTM公司；AcclaimTMRSLC 120 C18色譜分析柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）、Thermo Scientific Heraeus Mlutifuge X3R 高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；ZORBAX Eclipse RRHD C18色譜分析柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、ZORBAX Eclipse RRHD C18色譜分析柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）、Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀、Agilent 6495C 三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent 公司；IRM IDH30 超聲儀 德國(guó)IRM Technology GmbH 公司；IKA MS3 渦旋混合器 德國(guó)IKA 公司；Biotage TurboVap 全自動(dòng)氮吹儀 瑞典Biotage 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 準(zhǔn)確稱取24 種酸性工業(yè)染料標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.01 mg），用水溶解，乙腈定容至10 mL，混勻，制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再精密吸取10 μL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置10 mL 容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，制成1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法制備濃度為20、50、100、150、200、250、300 ng/mL 隨行基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取均質(zhì)后的樣品2 g（精確至0.001 g），置50 mL 離心管中，加入10 mL氨水乙醇溶液（氨水:無(wú)水乙醇:水=2:7:1，v/v/v），渦旋1 min，再超聲（功率500 W）10 min，以10000 r/min在4 ℃條件下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至20 mL 容量瓶中，殘?jiān)偌尤? mL 氨水乙醇溶液重復(fù)提取1 次，合并上清液，用氨水乙醇溶液定容至刻度，混勻，作為提取液。精密吸取10 mL 提取液至氮吹管中，氮吹濃縮至約1 mL，加入10 mL 5%甲醇水溶液混勻，作為待凈化液。

凈化前，依次用6 mL 甲醇，6 mL 水對(duì)PWAX固相萃取小柱進(jìn)行活化。將待凈化液以1 mL/min的速度通過固相萃取小柱，依次用6 mL 水，6 mL 甲醇淋洗，再用5%氨水甲醇溶液10 mL 洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮吹至近干，精密加入1 mL 乙酸銨乙腈溶液（10 mmol/L 乙酸銨溶液:乙腈=1:1，v/v）復(fù)溶，過PTFE 濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.3 分析條件 液相色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse RRHD C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A 相：10 mmol/L 乙酸銨溶液；B 相：乙腈；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相梯度見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program of mobile phase

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：11 L/min；霧化氣壓力：25 psi；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流量：11 L/min?；衔镔|(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 24 種酸性工業(yè)染料的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass parameters of 24 acid industrial dyes

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用美國(guó)Agilent Technologies Inc.的MassHunter Workstation Software 11.0 軟件進(jìn)行分析處理，Microsoft Office Excel 2016 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 工業(yè)染料的測(cè)定，研究[21-22]均采用了C18色譜柱進(jìn)行液相色譜分離，為實(shí)現(xiàn)24 種酸性工業(yè)染料的快速有效分離，實(shí)驗(yàn)分別考察了Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse RRHD C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Agilent ZOR BAX Eclipse RRHD C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）4 種不同品牌和參數(shù)的C18色譜柱。Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse RRHD C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）由于柱長(zhǎng)較短，可以縮短分析時(shí)間，但是無(wú)法實(shí)現(xiàn)酸性橙Ⅱ與酸性12 兩個(gè)同分異構(gòu)體的基線分離，影響定性定量的準(zhǔn)確性；選擇柱長(zhǎng)更長(zhǎng)的Agilent ZORBAX Eclipse RRHD C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）進(jìn)行考察后的結(jié)果顯示24 種目標(biāo)化合物均可以得到較好的分離。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 液相色譜中常用乙腈和甲醇作為有機(jī)流動(dòng)相，相較于甲醇，乙腈的洗脫能力更強(qiáng)，可以提高分析效率[23]，而在流動(dòng)相水相中加入乙酸銨可以改善酸性染料的峰型，提高分離度，同時(shí)增加質(zhì)譜負(fù)模式下的離子化效率[24-25]。實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水和乙腈-10 mmol/L 乙酸銨溶液兩種流動(dòng)相體系?？疾旖Y(jié)果發(fā)現(xiàn)水相中加入乙酸銨可以得到較好的酸性工業(yè)染料色譜峰形，相比之下純水相的效果略差，喹啉黃和鉻藍(lán)SE 峰形有拖尾的情況；而對(duì)乙腈-10 mmol/L 的流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度條件的考察，結(jié)果表明在表1 的梯度條件下，可以實(shí)現(xiàn)酸性橙Ⅱ與酸性12 兩個(gè)同分異構(gòu)體的基線分離，同時(shí)24 種目標(biāo)化合物均可以達(dá)到一個(gè)較好的峰型和分離。24 種酸性工業(yè)染料的總離子流圖見圖1。

圖1 24 種酸性工業(yè)染料的總離子流圖（100 ng/mL）Fig.1 Total ion current chromatogram of the 24 acid industrial dyes (100 ng/mL)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

酸性工業(yè)染料中含有磺酸基，易溶于水電離產(chǎn)生陰離子，選擇ESI-模式進(jìn)行檢測(cè)，母離子一般為[M-Na]-；含有2 個(gè)或以上Na+，且具有相同數(shù)量的磺酸基的化合物會(huì)形成[（M-xNa+yH）/（x-y）]-多離子共存的狀態(tài)，單價(jià)態(tài)和更高價(jià)態(tài)的分子離子峰響應(yīng)較低，多以二價(jià)準(zhǔn)分子離子為基峰[26]，例如紅2G、酸性藍(lán)113、酸性紅26、鉻藍(lán)SE。確定目標(biāo)化合物母離子后，進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，得到相應(yīng)的碎片離子，盡量選擇響應(yīng)最好的三對(duì)碎片離子進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性，具體質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)測(cè)定的目標(biāo)化合物均含有苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)，屬于強(qiáng)酸性化合物，容易被堿性溶劑提取，參考文獻(xiàn)[27]，考察采用空白基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，添加水平為100 μg/kg，每個(gè)條件做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)（n=3），以溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目標(biāo)化合物的絕對(duì)回收率。實(shí)驗(yàn)考察了氨水-乙醇-水溶液（2:88:10，v/v/v）、氨水-乙醇-水溶液（10:80:10，v/v/v）、氨水-乙醇-水溶液（20:70:10，v/v/v）3 種提取溶劑的提取能力，以絕對(duì)回收率評(píng)價(jià)提取效果。由于目標(biāo)化合物均含有苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)，容易被堿性溶劑提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著提取溶劑中氨水濃度的升高，目標(biāo)化合物的提取效果越好，采用氨水-乙醇-水溶液（2:88:10，v/v/v）作為提取溶劑，24 種酸性工業(yè)染料的絕對(duì)回收率在27%～79%，采用氨水-乙醇-水溶液（10:80:10，v/v/v）作為提取溶劑，24 種酸性工業(yè)染料的絕對(duì)回收率在31%～89%，采用氨水-乙醇-水溶液（20:70:10，v/v/v）作為提取溶劑，24 種酸性工業(yè)染料的絕對(duì)回收率在35%～92%；氨水-乙醇-水溶液（20:70:10，v/v/v）的提取能力優(yōu)于其余兩種考察溶劑，提取溶劑考察結(jié)果見圖2。

圖2 提取溶劑的考察（n=3）Fig.2 Investigation of extraction solvents (n=3)

2.3.2 固相萃取小柱的選擇 實(shí)驗(yàn)測(cè)定的目標(biāo)化合物均帶有磺酸根，屬于強(qiáng)酸性極性化合物，凈化時(shí)宜采用對(duì)強(qiáng)酸性化合物有很好選擇性的弱陰離子交換固相萃取小柱[28]?？疾觳捎每瞻谆|(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，添加水平為100 μg/kg，每個(gè)條件做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)（n=3），以溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目標(biāo)化合物的絕對(duì)回收率，實(shí)驗(yàn)考察了市面上常見的三種弱陰離子交換固相萃取小柱，分別為Waters Oasis WAX（150 mg，6 mL）、Agela Cleanert PWAX（150 mg，6 mL）和島津WondaSep WAX（150 mg，6 mL），以絕對(duì)回收率評(píng)價(jià)三個(gè)小柱的凈化效果。結(jié)果表明，采用島津WondaSep WAX（150 mg，6 mL）作為凈化小柱，24 種目標(biāo)化合物的絕對(duì)回收率在30%～83%，采用Waters Oasis WAX（150 mg，6 mL）作為凈化小柱，24 種目標(biāo)化合物的絕對(duì)回收率在31%～90%，采用Agela Cleanert PWAX（150 mg，6 mL）作為凈化小柱，24 種目標(biāo)化合物的絕對(duì)回收率在35%～92%，并且待凈化溶液在Agela Cleanert PWAX（150 mg，6 mL）的通過速度高于其他兩種固相萃取小柱。綜合考察結(jié)果Agela Cleanert PWAX 的凈化效果和凈化速度優(yōu)于Waters Oasis WAX 和島津WondaSep WAX，固相萃取小柱考察結(jié)果見圖3。

圖3 固相萃取小柱的考察（n=3）Fig.3 Investigation of solid phase extraction colum (n=3)

2.3.3 濾膜的選擇 常用的尼龍濾膜會(huì)對(duì)酸性染料產(chǎn)生吸附作用[29-30]，實(shí)驗(yàn)室考察了聚偏氟乙烯（PVDF）濾膜、聚丙烯濾膜（PP）濾膜、聚四氟乙烯（PTFE）濾膜、尼龍（PA）濾膜?？疾觳捎每瞻谆|(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，添加水平為100 μg/kg，每個(gè)條件做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)（n=3），以溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目標(biāo)化合物的絕對(duì)回收率，結(jié)果表明，PA 濾膜對(duì)紅色染料有較為明顯的吸附作用，能在濾膜上看見紅色染料的殘留，采用PA 濾膜進(jìn)行過濾，紅2G、酸性紅26、酸性紅52 和酸性大紅GR 的絕對(duì)回收率僅為30%～65%，明顯低于其他三種濾膜；采用PVDF 濾膜，24 種酸性工業(yè)染料的絕對(duì)回收率為34%～88%，采用PP 濾膜，24 種酸性工業(yè)染料的絕對(duì)回收率為35%～92%，采用PTFE 濾膜，24 種酸性工業(yè)染料的絕對(duì)回收率為36%～95%；綜合考慮選擇PTFE 濾膜，濾膜考察結(jié)果見圖4。

圖4 濾膜的考察（n=3）Fig.4 Investigation of filter membrane (n=3)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)通過斜率法[31]來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME），采用公式：進(jìn)行計(jì)算，A 表示溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，B 表示基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME＜1，表明基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用；ME＞1，表明基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生了增強(qiáng)作用；ME＝1，表明沒有基質(zhì)效應(yīng)。若0.8≤ME≤1.2 時(shí)，為弱基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)0.5＜ME＜0.8 或1.2＜ME＜1.5 時(shí)，為中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME≤0.5 或ME≥1.5 時(shí)，為強(qiáng)基質(zhì)相應(yīng)[32]。實(shí)驗(yàn)考察了20～300 ng/mL濃度范圍內(nèi)24 種酸性工業(yè)染料在4 種食品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明，考察的食品基質(zhì)對(duì)24 種酸性工業(yè)染料均產(chǎn)生了抑制作用，其中酸性橙12、酸性橙20、酸性大紅GR、酸性紅87、酸性藍(lán)113、鉻藍(lán)SE 在四種食品基質(zhì)中均表現(xiàn)為強(qiáng)抑制基質(zhì)效應(yīng)；酸性藍(lán)1、酸性綠16 在四種基質(zhì)中均為弱抑制基質(zhì)效應(yīng)；其余16 種酸性工業(yè)染料在四種基質(zhì)中呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，這可能是因?yàn)樗姆N基質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂肪組成存在差異，在同樣的前處理?xiàng)l件下，產(chǎn)生了不同的基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)的具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 四種食品基質(zhì)中24 種酸性工業(yè)染料的基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Matrix effects of 24 acid industrial dyes in four food matrices

2.4.2 基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償措施 彌補(bǔ)和消除基質(zhì)效應(yīng)常用的方法主要有同位素內(nèi)標(biāo)法[33]和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法[34]。由于市面上沒有合適的同位素內(nèi)標(biāo)，基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償措施采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法。實(shí)驗(yàn)考察了隨行基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的補(bǔ)償效果。采用添加水平為100 μg/kg 的空白基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（n=3），分別以隨行基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液計(jì)算目標(biāo)化合物的回收率，考察結(jié)果見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用隨行基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液計(jì)算24 種酸性工業(yè)染料的回收率為92.0%～103.2%；采用配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)溶液計(jì)算的回收率為29.4%～88.1%，其中酸性橙12、酸性黃17、酸性藍(lán)83、酸性藍(lán)113、鉻藍(lán)SE 的回收率均低于60%，不符合GB/T 27404 的檢測(cè)方法技術(shù)要求，實(shí)驗(yàn)選擇隨行基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作為基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償措施。

圖5 基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償措施的考察（n=3）Fig.5 Research on compensation measures of matrix effects (n=3)

2.4.3 線性范圍、檢出限和定量限 按照前處理方法制備24 種酸性工業(yè)染料的隨行基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度分別為20、50、100、150、200、250、300 ng/mL。以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)得到線性回歸方程（表4），24 種酸性工業(yè)染料在四種食品基質(zhì)中線性范圍20～300 ng/mL 的相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。通過空白基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，24 種酸性工業(yè)染料在四種基質(zhì)中10 μg/kg 的添加水平下的加標(biāo)溶液的定性離子信噪比（S/N）均大于3，表明24 種酸性工業(yè)染料的在四種基質(zhì)中的檢出限均可達(dá)到10 μg/kg；24 種酸性工業(yè)染料在四種基質(zhì)中25 μg/kg 的添加水平下加標(biāo)溶液的定性離子信噪比（S/N）大于10，且回收率為90.4%～112.7%，表明24 種酸性工業(yè)染料在四種基質(zhì)中的定量限均可達(dá)到25 μg/kg。

表4 24 種酸性工業(yè)染料在4 種食品基質(zhì)中的線性方程Table 4 Regression equation of 24 acid industrial dyes in four food matrices

2.4.4 回收率、精密度和穩(wěn)定性 在空白基質(zhì)中添加25、100、250 μg/kg 三個(gè)水平，每個(gè)水平分別做6 份平行樣，計(jì)算各水平的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。豆制品、調(diào)味品、水產(chǎn)品、肉制品中24 種酸性工業(yè)染料三個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為91.0%～112.7%，RSD 為0.42%～4.39%，具體見表5。樣品加標(biāo)溶液分別在0、2、4、8、16、24、48 h 進(jìn)樣，定量離子峰面積RSD 為2.69%～4.41%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法在四個(gè)基質(zhì)中三個(gè)濃度水平下回收率均在GB/T 27404 給出的參考范圍內(nèi)，表明該方法準(zhǔn)確且穩(wěn)定。

表5 24 種酸性工業(yè)染料在4 種食品基質(zhì)中的回收率與RSDTable 5 Spiked recoveries and RSDs of 24 acid industrial dyes in four food matrices

2.4.5 實(shí)驗(yàn)室間協(xié)作驗(yàn)證 選擇了5 家檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)本方法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示，24 種酸性工業(yè)染料在四種基質(zhì)的20～300 ng/mL 線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r均大于0.999；四種基質(zhì)檢出限濃度下的加標(biāo)試樣溶液定性離子信噪比均大于3，滿足方法檢出限的要求；四種基質(zhì)定量限濃度下的加標(biāo)試樣溶液定性離子信噪比均大于10，且回收率為86.1%～115.3%，滿足方法定量限的要求。24 種酸性工業(yè)染料在四種食品基質(zhì)，25、100、250 μg/kg 三個(gè)加標(biāo)水平下的回收 率為86.1%～116.1%，RSD 為0.86%～4.96%，滿足方法準(zhǔn)確度的要求。5 家檢測(cè)機(jī)構(gòu)的驗(yàn)證數(shù)據(jù)說明該方法在不同的實(shí)驗(yàn)室之間的耐用性良好。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室周邊農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷售的豆制品、調(diào)味品、水產(chǎn)品、肉制品各40 批次進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 批次鹵肉樣品中檢出了酸性橙Ⅱ，含量分別為138±2.8 μg/kg 和179±3.7 μg/kg；2 批次香腸樣品中檢出紅2G，含量分別為320±8.6 μg/kg和230±6.2 μg/kg；其余樣品均未檢出。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了食品中24 種酸性工業(yè)染料測(cè)定的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑、固相萃取小柱、濾膜選擇的前處理?xiàng)l件，優(yōu)化了色譜條件和質(zhì)譜采集參數(shù)，并對(duì)方法的線性范圍、檢出限、定量限、回收率、精密度、穩(wěn)定性等技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行了考察，最終建立了食品中24 種酸性工業(yè)染料的固相萃取小柱凈化結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，24 種酸性工業(yè)染料在20～300 ng/mL 范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999；方法檢出限為10 μg/kg，定量限為25 μg/kg；在25、100、250 μg/kg 三個(gè)不同加標(biāo)水平下的回收率為91.0%～112.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為0.42%～4.39%。該方法操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、通用性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能一次性測(cè)定食品中24 種酸性工業(yè)染料，擴(kuò)大了酸性工業(yè)染料篩查范圍和覆蓋的食品基質(zhì)，可以為監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。