滸苔多酚對2 型糖尿病小鼠降血糖功效研究

邱小明，郭 欣，黃聰亮

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學院食品工程學院，福建漳州 363000；2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應用技術(shù)工程中心，福建漳州 363000）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌（或）作用缺陷所引起。長期碳水化合物以及脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂可引起多系統(tǒng)損害，導致眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織器官慢性進行性病變、功能減退及衰竭；病情嚴重或應激時可發(fā)生急性嚴重代謝紊亂，如糖尿病酮癥酸中毒、高滲高血糖綜合征[1]。國際糖尿病聯(lián)盟最新數(shù)據(jù)顯示：2021 年，全球成年人糖耐量受損患病率為9.1%，人數(shù)高達4.64億，預計到2045 年，這一比例將增加到10.0%，約為6.4 億人，其中，2 型糖尿病約占90%左右[2]。2 型糖尿病發(fā)病原因大多是由于高碳水化合物、高脂的膳食習慣以及運動缺乏的生活習慣所致，最終導致碳水化合物及脂質(zhì)代謝紊亂綜合癥，其特征是缺乏胰島素或胰島素水平較低，導致血糖水平異常升高[3]。2 型糖尿病的治療主要包括磺脲類和奈列類、二甲雙胍、噻唑烷二酮類以及α-糖苷酶抑制劑、鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白酶抑制劑、GLP-1 受體激動劑類、胰島素等藥物[4-5]，但以上藥物價格昂貴、副作用多、治療存在缺陷[6-7]，因此開發(fā)具有降糖降脂作用的天然產(chǎn)物藥物，對于糖尿病的輔助治療具有重要意義。

滸苔（Enteromorpha prolifera，EP）又名苔菜，是石莼科、滸苔屬藻類植物，藻體鮮綠色，由單層細胞組成，圍成管狀或粘連為帶狀[8-9]，因其可以食藥兼用而受到亞洲國家（如中國、日本）的歡迎。滸苔富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、粗纖維、氨基酸、脂肪酸、維生素和多種礦物質(zhì)[10-11]，已被開發(fā)成多種風味食品。為了有效利用豐富的滸苔資源，近年來對其進行了大量研究，主要有：滸苔多糖的結(jié)構(gòu)及藥理研究[10,12]、滸苔提取物抗氧化、腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[13-14]、制備生物柴油[15]和生物乙醇[16]等方面，而有關(guān)滸苔多酚提取分離及其降血糖功效研究，國內(nèi)外鮮見報道。

本研究以滸苔為原料，采用醇提取技術(shù)、經(jīng)減壓濃縮、石油醚萃取去脂，硅膠柱層析法洗脫、濃縮冷凍干燥后得到滸苔多酚樣品，通過四氧嘧啶誘導建立2 型糖尿病小鼠模型，研究滸苔多酚對2 型糖尿病小鼠降血糖作用及相關(guān)代謝因子的變化[17-19]，分析和探討滸苔多酚的降血糖活性、抗氧化及改善脂代謝功效，既有助于提升滸苔的綜合利用率，又可為治療2 型糖尿病提供新的原料和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮干滸苔 產(chǎn)自福建漳浦縣，2022 年夏季收獲；6 周齡雄性小鼠60 只 SPF 級，購自上海史萊克實驗動物有限公司（實驗動物許可證號：SCXK（滬）2022-0004），動物實驗中的所有操作程序嚴格遵守中國關(guān)于實驗動物的使用和護理法規(guī)；糖原測定試劑盒、葡萄糖測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、MDA 試劑盒、低密度脂蛋白測定試劑盒、高密度脂蛋白測定試劑盒、CAT 試劑盒、SOD 試劑盒、GSH-Px 試劑盒 南京建成生物工程研究所；胰島素ELISA 測定試劑盒 上海源葉生物科技有限公司；四氧嘧啶 Sigma 公司；格列齊特片深圳海王藥業(yè)有限公司；普通飼料 上海普路騰生物科技有限；其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1-15p 離心機 德國Sigma；強生OneTouchUltra血糖儀 強生公司；DK-S22 恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；AL204 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ3200B 超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 滸苔多酚的提取及測定 取新鮮干滸苔5 kg洗滌干凈，70 ℃條件下干燥粉碎過100 目篩，取100 g滸苔粉末用55%乙醇按料液比1:30 提取三次，每次2 h，收集提取液減壓濃縮除去乙醇[20]，45 ℃恒溫條件下按液料比2:1 用石油醚萃取24 h 脫脂，收集含滸苔多酚的水相部分。滸苔多酚純化采用硅膠柱層析法洗脫，硅膠柱為（60 cm×5 cm）采用濕法裝柱，上樣液的濃度為4.6 mg/mL，洗脫流速 1.0 Bv/h，上樣之后，采用乙酸乙酯-甲醇體系梯度洗脫，流動相組成由100%乙酸乙酯逐漸過渡到100%甲醇，洗脫收集制備樣品，經(jīng)減壓濃縮冷凍干燥后得到滸苔多酚樣品[21]，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

滸苔多酚含量測定采用采用福林-酚法[22]，配制沒食子酸標準液0.1 mg/mL，然后分別移取不同體積的標準液于10 mL 比色管中，加入1 mL 福林-酚試劑，充分反應10 min 后，再加入2 mL 75 g/L Na2CO3溶液，在70 ℃的水浴鍋中保溫10 min 后，冷卻并于765 nm 處測定吸光度。以吸光值為縱坐標，沒食子酸含量mg/mL 為橫坐標，繪制標準曲線并得到回歸方程為y=85.196x+0.02（R2=0.9991），線性關(guān)系好，式中：x 為沒食子酸濃度mg/mL；y 為吸光值，滸苔多酚提取含量用上述方法測定并帶入回歸方程計算得到滸苔多酚得率。

滸苔多酚得率（mg/g）計算公式如下：

式中：C 為多酚含量，mg/mL；V 為滸苔多酚提取液體積，mL；m 為滸苔干基質(zhì)量，g；n 為稀釋倍數(shù)。

滸苔多酚純度計算公式如下：

式中：m 表示多酚類物質(zhì)質(zhì)量，g；M 表示混合物總質(zhì)量，g。

1.2.2 小鼠模型建立與給藥方案 雄性健康小鼠60 只分籠飼養(yǎng)7 d，體重24～28 g，室內(nèi)恒溫22±0.5 ℃，相對濕度50%～60%，光照/黑暗交替循環(huán)各12 h，喂食普通飼料，然后隨機選取10 只作為空白對照組飼養(yǎng)（最終選取8 只作為空白對照組），其余50 只小鼠按35 mg/kg mb的劑量注射四氧嘧啶溶液，間隔1 日，連續(xù)注射3 次，空白對照組注射等量生理鹽水，末次注射完后飼養(yǎng)3 天，小鼠禁食12 h 后選出血糖高于11.1 mmol/L 的小鼠進行建模，扣除死亡及血糖不符合要求的8 只，共建模成功42 只2 型糖尿病小鼠模型。選取建模成功的40 只小鼠隨機分成5 組，每組8 只，即：模型組對照組、EPP-L 組、EPP-M 組、EPP-H 組、陽性對照組（格列齊特）。

精確稱取滸苔多酚樣品1 g 加蒸餾水配制20 mL樣品溶液，進行灌藥。空白對照組（灌胃100 mg/kg mb生理鹽水）、模型對照組（灌胃100 mg/kg mb生理鹽水）、EPP-L 組（灌胃150 mg/kg mbEPP）、EPP-M 組（灌胃300 mg/kg mbEPP）、EPP-H 組（灌胃450 mg/kg mbEPP）、陽性對照組（灌胃300 mg/kg mb格列齊特）[23]，每天按0.1 mL/10 g mb灌胃，期間每周稱重1 次，并測空腹血糖值，連續(xù)灌胃四周后，禁食12 h，乙醚麻醉，眼眶取血，在3000 r/min，5 min 條件下離心收集血清，-20 ℃保存，以備測定各項指標。

1.2.3 小鼠體質(zhì)情況及空腹血糖濃度的測定 實驗期間每周記錄小鼠體質(zhì)變化情況，分別于給藥第1、2、3、4 周結(jié)束后禁食12 h 不禁水測定空腹血糖值。

1.2.4 小鼠口服葡萄糖耐糖量（Oral glucose tolerance test，OGTT）測試 小鼠喂養(yǎng)四周結(jié)束前1 天，禁食不禁水過夜16 h 后尾靜脈采血測定血糖含量（0 min 值），每只小鼠腹腔注射2.0 g/kg Glu，用強生OneTouchUltra 血糖儀分別測定給糖后0、0.5、1.0、1.5、3.0 h 血糖含量，參照文獻[24-25]計算血糖時間曲線下面積（Area undercurve，AUC）。

1.2.5 小鼠其他生化指標測定 小鼠血清胰島素水平、甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholestero，LDL-C），谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）及高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholestero，HDL-C）濃度均按試劑盒操作說明進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 滸苔多酚提取得率與純度

按1.2.1 實驗方法提取計算得到滸苔多酚得率為21.80±0.11 mg/g，經(jīng)硅膠柱層析法洗脫采用乙酸乙酯-甲醇體系梯度洗脫后滸苔多酚純度由純化前的25.63%提高到83.64%，說明硅膠柱層析法能有效提高滸苔多酚的純度。

2.2 滸苔多酚對糖尿病小鼠體重的影響

由表1 可知，造模成功后各實驗組小鼠體重與空白對照組小鼠相比體重均減輕，各實驗組小鼠體重與空白對照組小鼠體重均存在極顯著差異（P＜0.01），可能是造模后四氧嘧啶選擇性地破壞胰島B 細胞導致胰島素分泌功能降低造成小鼠內(nèi)分泌紊亂[26]，造成小鼠體重下降甚至死亡情況。經(jīng)格列齊特和EPP 灌胃治療后陽性對照組和EPP 組小鼠體重1～4 周內(nèi)呈現(xiàn)增長趨勢，且高劑量的滸苔多酚效果更明顯。而未治療的模型組小鼠體重呈現(xiàn)下降趨勢，經(jīng)格列齊特和滸苔多酚灌胃治療4 周后陽性對照組和滸苔多酚組小鼠體重與模型對照組小鼠相比較體重均存在極顯著差異（P＜0.01），可能是經(jīng)藥物治療后小鼠胰島素分泌功能得到一定恢復使代謝正常體重增加[27]，這一結(jié)果與邱立等[20]研究結(jié)果一致。

表1 滸苔多酚對糖尿病小鼠體重的影響（，n=8）Table 1 Effect of EPP on body weight of diabetic mice (,n=8)

表1 滸苔多酚對糖尿病小鼠體重的影響（，n=8）Table 1 Effect of EPP on body weight of diabetic mice (,n=8)

注：與空白對照組小鼠比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組小鼠比較，+P＜0.05，++P＜0.01；表2～表5同。

2.3 滸苔多酚對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

空腹血糖是反映機體血糖代謝的重要指標[28]，由表2 可知，經(jīng)四氧嘧啶造模后小鼠初始空腹血糖濃度均大幅高于空白對照組4.98±1.13 mmol/L，具有極顯著差異（P＜0.01），說明糖尿病小鼠造模成功。經(jīng)格列齊特和滸苔多酚灌胃治療4 周，陽性對照組、滸苔多酚組小鼠空腹血糖濃度均呈下降趨勢，陽性對照組、滸苔多酚組小鼠空腹血糖與模型對照相比下降顯著（P＜0.05），其中EPP-H 組小鼠空腹血糖濃度為11.78±1.62 mmol/L，與陽性對照組小鼠空腹血糖濃度11.32±1.89 mmol/L 接近，說明兩組降糖效果基本一致。雖然陽性對照組、EPP-H 組小鼠空腹血糖濃度下降明顯，但無法恢復到空白對照組水平，可能是由于四氧嘧啶導致小鼠胰島細胞不可逆破壞導致無法恢復至初始狀態(tài)水平[29]，以上分析表明滸苔多酚能抑制糖尿病小鼠血糖升高，具有明顯的降血糖效果。Huang 等[30]也證實了滸苔中存在多酚類化合物可顯著降低空腹血糖，改善空腹血糖耐量。

表2 滸苔多酚對糖尿病小鼠空腹血糖濃度的影響（，n=8）Table 2 Effect of EPP on fasting blood glucose in diabetic mice (,n=8)

表2 滸苔多酚對糖尿病小鼠空腹血糖濃度的影響（，n=8）Table 2 Effect of EPP on fasting blood glucose in diabetic mice (,n=8)

2.4 滸苔多酚對糖尿病小鼠口服葡萄糖耐受量的影響

耐糖量可反映出機體對葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)能力[31]，由表3 可知，與空白對照組相比，模型對照組小鼠腹腔注射葡萄糖后各時間點的空腹血糖值及AUC 均顯著升高，耐糖量異常極顯著（P＜0.01）。模型對照組小鼠血糖濃度在30 min 后達32.32±2.13 mmol/L，隨后逐漸下降，但180 min 后仍達24.32±1.77 mmol/L。模型對照組小鼠的葡萄糖下曲線面積AUC 為54.75±2.97（mmol/L×h），其數(shù)值極顯著高于（P＜0.01）空白對照組AUC 的21.73±3.37（mmol/L×h），表明模型對照組小鼠葡萄糖耐受能力顯著降低，出現(xiàn)耐糖量異常。與模型對照組相比，灌胃4 周后滸苔多酚組小鼠腹腔注射葡萄糖后各時間節(jié)點的血糖濃度及AUC 均顯著降低（P＜0.05）。EPP-H 組AUC 為41.23±2.27（mmol/L×h）與陽性對照組AUC的39.78±2.92（mmol/L×h）接近，可能是由于滸苔多酚促進了葡萄糖攝取和利用，抑制肝臟生成葡萄糖，同時改善了胰島素抵抗，增加胰島素敏感性，與Lin 等[32]研究結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，滸苔多酚能輕度改善小鼠的葡萄糖耐受能力和具有一定降血糖功效。

表3 滸苔多酚對糖尿病小鼠耐糖量的影響（，n=8）Table 3 Effect of EPP on glucose tolerance in diabetic mice (,n=8)

2.5 滸苔多酚對糖尿病小鼠肝臟抗氧化指標及胰島素水平的影響

自由基和脂質(zhì)過氧化反應對機體的正常代謝起著非常關(guān)鍵的作用[33]，但當二者水平過高時，能破壞機體的相對平衡，形成自由基連鎖反應，會對生物膜和一些重要的細胞器造成損害，甚至有可能會導致細胞的結(jié)構(gòu)和功能會產(chǎn)生不可逆性損傷[21]。SOD 和CAT 能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，MDA 為機體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[21]。Hong 等[34]發(fā)現(xiàn)GSH-Px 可以清除由活性氧和·OH 誘發(fā)產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。胰島素是檢測糖尿病的一個重要的指標，胰島素水平的高低有助于判斷血糖升高與降低的原因，是1 型與2 型糖尿病鑒別診斷的重要指標[35]。胰島素可通過一些重要的組織器官諸如肝臟、肌肉組織和脂肪組織來調(diào)節(jié)血糖，當機體處于胰島素抵抗狀態(tài)，機體對胰島素的反應不敏感，導致血液中葡萄糖無法進入細胞為機體提供能量，從而造成血糖升高。

由表4 可知，與空白對照組相比，模型對照組小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px 活力及胰島素水平極顯著下降（P＜0.01），MDA 濃度極顯著升高（P＜0.01），說明模型對照組小鼠受到氧化損傷。與模型對照組相比，滸苔多酚組和陽性對照組小鼠MDA 濃度顯著下降（P＜0.05），且呈劑量效應，SOD、CAT、GSH-Px 活力及胰島素水平顯著升高（P＜0.05），其提高程度與劑量大小相關(guān)。由表4 還可知，與空白對照組相比，模型對照組小鼠胰島素水平極顯著下降（P＜0.01），而EPP-H 組小鼠胰島素水平與陽性對照組相當。以上結(jié)果表明，滸苔多酚能提高糖尿病小鼠SOD、CAT、GSH-Px 活力及胰島素水平，降低其MDA 濃度，改善糖尿病小鼠代謝情況和有效清除體內(nèi)自由基，能一定程度修復糖尿病小鼠的過氧化損傷，這可能是滸苔多酚降血糖機制之一[17,36]。

表4 滸苔多酚對糖尿病小鼠肝臟抗氧化指標水平的影響（，n=8）Table 4 Effects of EPP on hepatic antioxidant indexes in diabetic mice (,n=8)

表4 滸苔多酚對糖尿病小鼠肝臟抗氧化指標水平的影響（，n=8）Table 4 Effects of EPP on hepatic antioxidant indexes in diabetic mice (,n=8)

2.6 滸苔多酚對糖尿病小鼠血脂代謝的影響

糖尿病患者一般都患有嚴重的脂質(zhì)代謝紊亂癥狀，長期嚴重的脂質(zhì)代謝紊亂會增加冠心病并發(fā)癥的幾率，給患者帶來極大的健康威脅[37]。由表5 可知，與空白對照組小鼠相比，模型對照組小鼠TC、TG、LDL-C 濃度極顯著增高（P＜0.01），HDL-C 濃度極顯著降低（P＜0.01），表明模型對照組糖尿病小鼠糖代謝紊亂導致脂肪和蛋白質(zhì)大量分解，出現(xiàn)脂代謝異常。EPP-H 組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C 濃度與陽性對照組小鼠濃度水平接近，表明EPP-H 組小鼠血脂代謝紊亂的改善效果與陽性對照組小鼠的效果接近，與Abo-Shady 等[38]研究結(jié)果一致。Feldman 等[39]也研究發(fā)現(xiàn)多酚在改善脂質(zhì)、脂蛋白代謝和減輕高脂血癥方面的潛力，包括餐后和長期干預效果。Behl等[40]研究發(fā)現(xiàn)多酚類物質(zhì)還可以通過阻斷血小板聚集和氧化低密度脂蛋白（LDL），改善內(nèi)皮功能障礙，降低血壓，改善抗氧化防御和減輕炎癥反應，從而對血管系統(tǒng)產(chǎn)生有益的作用。Huang 等[30]研究表明，滸苔多酚能夠抑制氧化應激狀態(tài)導致的JNK 信號通路激活，從而保護胰島細胞免受氧化應激損傷，以上結(jié)果表明滸苔多酚可以改善糖尿病小鼠血脂代謝異常。

表5 滸苔多酚對糖尿病小鼠血脂代謝的影響（，n=8）Table 5 Effects of EPP on blood lipid metabolism in diabetic mice (,n=8)

表5 滸苔多酚對糖尿病小鼠血脂代謝的影響（，n=8）Table 5 Effects of EPP on blood lipid metabolism in diabetic mice (,n=8)

3 結(jié)論

該研究結(jié)果表明：a.滸苔多酚能改善2 型糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力和耐糖量的異常，具有較好的降血糖功效，經(jīng)滸苔多酚灌胃4 周后，EPP-H 組小鼠空腹血糖濃度為11.78±1.62 mmol/L，與格列齊特組小鼠空腹血糖濃度11.32±1.89 mmol/L 基本接近。b.滸苔多酚對2 型糖尿病小鼠的血脂代謝紊亂也有明顯改善效果，與模型組小鼠相比，EPP-H 組小鼠的MDA、TG、TC 和LDL-C 水平明顯降低，而SOD、CAT、GSH-Px 活力及胰島素濃度增加，表明滸苔多酚能影響糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化指標和有效清除體內(nèi)自由基。以上研究結(jié)果表明滸苔多酚有一定降血糖作用并提高小鼠葡萄糖耐受力，能在一定程度上改善2 糖尿病小鼠早期機體血糖代謝紊亂，為今后探討滸苔多酚降糖機制及預防、治療2 糖尿病藥物開發(fā)提供了相關(guān)證據(jù)。