山東中華櫻桃資源的ISSR分析

摘" 要：以46份中華櫻桃種質(zhì)為試材，進(jìn)行ISSR引物擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算遺傳距離并進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，篩選出12條多態(tài)性良好的ISSR引物，共獲得106個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶78個(gè)，多態(tài)率為73.58%。46份材料間遺傳相似系數(shù)為0.59 ～ 0.94，有效等位基因數(shù)、基因多樣性、香農(nóng)信息指數(shù)分別為1.36、0.21、0.32，說(shuō)明山東地區(qū)中華櫻桃遺傳多樣性較高。通過(guò)UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，12條ISSR引物能夠完全區(qū)分46份種質(zhì)，并將其分為7個(gè)類(lèi)群。研究結(jié)果為山東地區(qū)櫻桃種質(zhì)資源的保存與利用提供參考。

關(guān)鍵詞：中華櫻桃；ISSR；種質(zhì)資源；遺傳多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S662.5""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A""""" 文章編號(hào)：1002－2910（2024）06－0036－06

ISSR analysis of Chinese cherry germplasm resources in Shandong Province

Abstract： In this study， 46 Chinese cherry （Prunus pseudocerasus Lindl.） germplasm were used as research materials， and DNA was extracted for ISSR primer amplification， and genetic distances were calculated based on the amplification results and analyzed by clustering. The results showed that 106 bands were obtained by PCR amplification with 12 selected ISSR primers， of which 78 bands were polymorphic， with a polymorphism rate of 73.58%. The genetic similarity coefficients among 46 materials were 0.59 ～ 0.94， and the effective allele number， gene diversity， and Shannon's information index were 1.36， 0.21， and 0.32， respectively， which indicated that the genetic diversity of Chinese cherry was high in Shandong Province. Cluster analysis by UPGMA method showed that 12 ISSR primers were able to completely distinguish 46 germplasm and classify them into seven taxa. The conclusion showed that the genetic analysis of ISSR molecular markers can provide reference for the conservation and utilization of cherry germplasm resources in Shandong Province.

Keywords： chinese cherry; ISSR; germplasm resources; genetic diversity

中華櫻桃（Prunus pseudocerasus Lindl.）屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，具有早果和自交親和的特性，廣泛應(yīng)用于櫻桃新品種選育[1]。山東泰安、棗莊、五蓮等地區(qū)擁有豐富的中華櫻桃地方種質(zhì)資源[2，3]，但種質(zhì)分類(lèi)混亂，存在大量同名異物和同物異名的問(wèn)題[4]，且部分種質(zhì)正在或已經(jīng)流失[5]，亟需加強(qiáng)對(duì)地方種質(zhì)資源的收集、保護(hù)與利用。圃地保存是種質(zhì)資源保存的常用方法，但需地面積大，工程量相對(duì)較大[6]。對(duì)于性狀相近的種質(zhì)，通過(guò)表型特征難以區(qū)分，需要從基因?qū)用孢M(jìn)行種質(zhì)鑒定。目前ALFP[7]、RAPD[8]、RFLP[9]、SSR[10]等分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于歐洲甜櫻桃的遺傳多樣性分析，能夠從基因?qū)用娣从巢煌N質(zhì)之間的差異?；诜肿訕?biāo)記，對(duì)四川、貴州等地區(qū)的中華櫻桃地方種質(zhì)遺傳資源進(jìn)行了分析[11，12]。ISSR（Iinter-simple Sequence Repeat）標(biāo)記是一種基于微衛(wèi)星序列（SSR）的多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)，由加拿大特利爾大學(xué)的學(xué)者[13]提出。ISSR使用帶有1～4個(gè)簡(jiǎn)并堿基的微衛(wèi)星序列作為引物擴(kuò)增重復(fù)序列之間的區(qū)域，不依賴(lài)已知物種的基因組序列，是一種理想的分子標(biāo)記技術(shù)[14]，具有操作簡(jiǎn)單高效、技術(shù)難度低和成本低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、進(jìn)化與親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性評(píng)價(jià)等方面[15-18]。本研究通過(guò)ISSR分子標(biāo)記對(duì)34份山東地區(qū)中華櫻桃種質(zhì)和12份省外種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，闡明種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系，為山東地區(qū)中華櫻桃種質(zhì)資源的分類(lèi)、保存與利用、遺傳轉(zhuǎn)化等研究提供參考依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 供試材料

46份中華櫻桃種質(zhì)資源信息見(jiàn)表1，其中34份山東地區(qū)種質(zhì)、12份省外種質(zhì)，樣本編號(hào)前兩位字母代表取樣地（見(jiàn)表注）。選取無(wú)病蟲(chóng)害的幼嫩葉片，保鮮袋封存，液氮處理后，保存于－80 ℃冰箱。

1.2" DNA提取

采用北京博友順生物技術(shù)有限公司的磁珠試劑盒提取葉片DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量及濃度，－20 ℃保存。

1.3" ISSR分析

ISSR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件。ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的序列（Http：//www.

biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.pdf），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以隨機(jī)抽取的4個(gè)樣品基因組DNA為模板，利用梯度PCR擴(kuò)增儀篩選引物及退火溫度。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）為：DNA模板約40 ng，10×Bufer 2.5 μL，primer 0.3 μmol/L，四種dNTPs各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，TaqDNA聚合酶1.25U。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94 ℃變性45 s，55～62 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1.5 min；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4" ISSR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR產(chǎn)物在2.0 %的瓊脂糖凝膠（電壓120V電泳50 min）檢測(cè)，以DL 2 000 Marker（天根生化科技北京有限公司）為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，紫外凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.5" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無(wú)DNA條帶記為0。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，計(jì)算多態(tài)性條帶所占比例，形成ISSR的表型數(shù)據(jù)矩陣，通過(guò)NTSYS軟件計(jì)算相似系數(shù)（DICE系數(shù)），并按照UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建遺傳熱度圖和聚類(lèi)分析圖。用POPGENE 32軟件對(duì)供試材料的遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei氏多樣性（H）和香農(nóng)信息指數(shù)（I）。

2" 結(jié)果與分析

2.1 "引物篩選及多態(tài)性分析

使用4個(gè)樣本（QD1、TA5、ZZ1、ZZ8），在48條ISSR通用引物中篩選出12條多態(tài)性豐富、重復(fù)性好且擴(kuò)增條帶特征明顯的引物進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)（表2）。利用Popgene.32軟件對(duì)46份櫻桃資源的12條引物分別進(jìn)行遺傳多樣性分析。

擴(kuò)增結(jié)果表明，ISSR 標(biāo)記數(shù)多，多態(tài)性豐富（圖1），12條引物共擴(kuò)增出長(zhǎng)度為200～750 bp的條帶106個(gè)，其中多態(tài)性標(biāo)記 78個(gè)，多態(tài)率為73.58%。12條引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶在2～14條之間，平均每條引物擴(kuò)增出6.5個(gè)標(biāo)記，并且不同引物間存在較大差異。每個(gè)位點(diǎn)的平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.36，基因多樣性（H）0.21，香農(nóng)信息指數(shù)（I）0.32，因而上述引物可用于中華櫻桃種質(zhì)的鑒定。

2.2" 遺傳相似系數(shù)分析

根據(jù)12條引物擴(kuò)增產(chǎn)生的106份條帶，計(jì)算46份櫻桃種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（DICE）。46份種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)分布在0.59～0.94之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.78。其中LS-01嶗山豐產(chǎn)（QD3）和丁家喬長(zhǎng)把（QD4）2份種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)最大，為0.94，表明2份種質(zhì)的親緣關(guān)系最近，可能為同物異名或者其親本相似。成都C4（SC5）和LS-01嶗山豐產(chǎn)（QD3）的遺傳相似系數(shù)最小，為0.59，表明兩者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)各個(gè)地區(qū)種質(zhì)之間的平均遺傳相似系數(shù)，山東泰安、五蓮、嶗山、棗莊地區(qū)平均遺傳相似系數(shù)為0.81，其中泰安地區(qū)最高，為0.82，而棗莊地區(qū)最低，為0.79，表明山東不同地區(qū)種質(zhì)之間親緣關(guān)系較近，種質(zhì)資源多樣性較差。來(lái)自江蘇的東塘櫻桃（JS1）[19]和其他45份種質(zhì)的平均遺傳相似系數(shù)最低，為0.67，遺傳距離最遠(yuǎn)。

2.3" ISSR聚類(lèi)分析

根據(jù)“0”“1”矩陣數(shù)據(jù)，利用NTSYS軟件分別計(jì)算46份種質(zhì)遺傳相似矩陣，構(gòu)建遺傳距離矩陣熱圖（圖2）。根據(jù)GS值矩陣，利用UPGMA法對(duì)46份種質(zhì)的ISSR結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到環(huán)狀聚類(lèi)圖（圖3）。

根據(jù)UPGMA聚類(lèi)分析圖，46份中華櫻桃可以分為7個(gè)類(lèi)群以及山亭超早紅（ZZ6），烏皮櫻桃（CQ1）2份游離種質(zhì)。其中第I類(lèi)群包括尖嘴黃櫻（ZZ10）、MYRX（LY2）、丁家喬長(zhǎng)把（QD4）、

LS-01嶗山豐產(chǎn)（QD3）、成都紅花（SC4）、東塘櫻桃（JS1）共6份種質(zhì)；第II類(lèi)群包括成都C4（SC5）、五蓮水櫻桃（RZ5）、安丘大硬（WF2）、五蓮大紅（RZ1）、五蓮尖黃（RZ2）、山亭尖嘴黃櫻1（ZZ8）、山亭尖嘴黃櫻2（ZZ9）、五蓮硬肉1（RZ6）共8份種質(zhì)；第III類(lèi)群包括天寶紅櫻（TA1）、蒙陰紅櫻（LY1）、沂源尖嘴（ZB1）、龍廷尖黃院內(nèi)（TA4）、嶗山黃櫻（QD1）、丁家喬短把（QD5）、襄星（SC6）、泰山紅櫻1（TA5）共8份種質(zhì)；第IV類(lèi)群包括4份泰安地區(qū)的種質(zhì)（泰山干櫻、泰山紅櫻2、天寶黃櫻、龍廷尖黃山上）以及嶗山紅櫻（QD2）共5份種質(zhì)；第V類(lèi)群包括五蓮短枝紅（RZ4）、五蓮早紅（RZ3）、越星（ZJ2）、安丘尖嘴（WF1）、山亭桃源黃櫻（ZZ5）共5份種質(zhì)；第VI類(lèi)群包括大果脆（SC1）、成都賈家土櫻桃1（SC2）、成都賈家土櫻桃2（SC3）、浦江小櫻桃（ZJ1）、瑪瑙紅（GZ1）共5份種質(zhì)，第VII類(lèi)群包括來(lái)自棗莊的5份種質(zhì)（山亭小白花、山亭小尖葉、滕縣大紅櫻桃、山亭大尖葉、山亭大窩婁葉）以及來(lái)自湖北的房縣小櫻桃1（HB1）和房縣小櫻桃2（HB2），共7份種質(zhì)。

3" 小結(jié)與討論

3.1" 山東櫻桃種質(zhì)資源的多樣性

通過(guò)各地區(qū)櫻桃種質(zhì)的聚類(lèi)分布和遺傳相似系數(shù)來(lái)看，泰安地區(qū)的種質(zhì)遺傳多樣性不高，在聚類(lèi)分析圖上單獨(dú)聚類(lèi)（第III和第IV類(lèi)群），這與泰安地區(qū)平均遺傳相似系數(shù)最高的結(jié)論一致。棗莊地區(qū)的遺傳多樣性最為豐富，聚類(lèi)在I、II、V、VII類(lèi)群中，其中還包括一份難以聚類(lèi)的種質(zhì)ZZ6（山亭超早紅）。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，棗莊地區(qū)擁有豐富的本地特色資源[20]，并進(jìn)行過(guò)人工選種和對(duì)外引種工作[21]。這似乎可以解釋為何棗莊和湖北房縣的種質(zhì)親緣關(guān)系較近。五蓮和嶗山地區(qū)的種質(zhì)盡管地域接近，但是互相之間遺傳距離較遠(yuǎn)，分散在I～V五個(gè)類(lèi)群中，表明五蓮和嶗山地區(qū)的中華櫻桃種質(zhì)遺傳多樣性相對(duì)豐富，這與之前種質(zhì)資源調(diào)查的結(jié)論一致[22]。Itow的觀點(diǎn)認(rèn)為，在氣候濕潤(rùn)地區(qū)，海拔高度的增加會(huì)提高物種多樣性[23]，這可能是嶗山和五蓮地區(qū)櫻桃種質(zhì)遺傳資源豐富的原因之一。此外，過(guò)去的調(diào)查表明嶗山地區(qū)曾經(jīng)大量引入日本的櫻亞屬植物[24]，這進(jìn)一步提高了嶗山地區(qū)種質(zhì)的遺傳多樣性。綜合來(lái)看，山東省內(nèi)中華櫻桃種質(zhì)資源較為豐富，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)地方特色種質(zhì)的保護(hù)，依托特色種質(zhì)選育優(yōu)良品種。

3.2" 遺傳距離與地理距離的相關(guān)性

46份材料在遺傳相似度和地理距離上相關(guān)性不強(qiáng)，聚類(lèi)分析中不同地區(qū)的種質(zhì)可以被劃分為同一類(lèi)群。比如第I和第II類(lèi)群與其他5個(gè)類(lèi)群均有一定遺傳距離，這兩個(gè)類(lèi)群內(nèi)包括數(shù)份來(lái)源地不同的種質(zhì)，但是彼此之間有一定相似性狀，如來(lái)自第I類(lèi)群的尖嘴黃櫻（ZZ10）和MYRX大山河村硬肉（LY2）都具有黃色果皮、尖嘴、心臟形果實(shí)的特征，可能代表2個(gè)類(lèi)群內(nèi)種質(zhì)的來(lái)源比較接近或者具有相似的親本。同時(shí)也出現(xiàn)來(lái)源地相同的品種未能聚類(lèi)在一起的情況。如兩份龍廷尖黃種質(zhì)（TA3和TA4）就被劃分為不同的類(lèi)群，其中TA3和嶗山紅櫻（QD2）親緣關(guān)系較近，而TA4和嶗山黃櫻（QD1）更為親近，這種現(xiàn)象可能是區(qū)內(nèi)引種導(dǎo)致外地種和本地種之間發(fā)生基因滲入[25]，也可能是分子標(biāo)記更能反映基因組本質(zhì)差異[26]。

曹東偉認(rèn)為，山東是第四紀(jì)冰期櫻亞屬植物向低緯度遷移時(shí)的避難所之一[27]，因此山東地區(qū)擁有較為集中的中華櫻桃野生群體分布。考慮到山東地區(qū)山脈成片分布，野生櫻桃群體能夠沿泰山—沂蒙山山脈擴(kuò)展，并發(fā)生群落間基因交流，同時(shí)大量的區(qū)內(nèi)引種降低了地理距離對(duì)于基因交流的阻礙，使得山東地區(qū)的種質(zhì)具有較高的遺傳相似度。

3.3" ISSR遺傳標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源鑒定和保存的意義

中華櫻桃野生資源較多，許多野生資源形態(tài)相似，僅靠形態(tài)特征難以區(qū)分，同時(shí)在前期調(diào)查中發(fā)現(xiàn)部分地方種質(zhì)由于尚未審定，僅使用地方名，造成大量同物異名和同名異物的現(xiàn)象[28]，這進(jìn)一步加大了鑒別的難度。分子標(biāo)記可以反映種質(zhì)的遺傳本質(zhì)，因此可以借助分子標(biāo)記來(lái)研究不同種質(zhì)的基因組差異，提高種質(zhì)鑒定效率，降低重復(fù)保存。本研究篩選出12條引物，通過(guò)排列組合能夠區(qū)分全部46份種質(zhì)資源。同時(shí)研究表明，通過(guò)增加ISSR引物的數(shù)量，能夠鑒別更多材料[29，30]。ISSR分子標(biāo)記不需要預(yù)知物種的基因組信息，具有DNA 樣品用量少、信息量豐富、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[31]，可以作為鑒別種質(zhì)資源、分析種群遺傳進(jìn)化的高效手段，廣泛應(yīng)用于大規(guī)模種質(zhì)資源鑒別工作。汪祖華認(rèn)為，經(jīng)過(guò)人工選育的中華櫻桃相較于野生型表現(xiàn)出更大的遺傳差距和更遠(yuǎn)的親緣關(guān)系[32]。本研究中難以聚類(lèi)的兩份種質(zhì)均為人工選育品種，其中烏皮櫻桃（CQ1）為省外優(yōu)系[33]，山亭超早紅（ZZ6）是2007年棗莊市選育并審定的中華櫻桃品種，已經(jīng)引種到省外多個(gè)地區(qū)[21]，這說(shuō)明通過(guò)分子標(biāo)記進(jìn)行聚類(lèi)分析，可以區(qū)別外地種和本地種，人工選育種和野生種。未來(lái)通過(guò)分子標(biāo)記結(jié)合形態(tài)學(xué)調(diào)查，可以進(jìn)一步發(fā)掘中華櫻桃的群居遺傳特征，篩選具有地方代表性的種質(zhì)，發(fā)掘具有潛力的育種材料，為種質(zhì)資源利用及品種改良等提供科學(xué)依據(jù)。

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