Bt毒素表達應用及其殘留風險與免疫檢測研究進展

摘要：" Bt毒素是蘇云金芽孢桿菌產生的一類生物大分子蛋白質，對多種常見的農林害蟲甚至衛(wèi)生媒介蚊蟲都有特異性毒殺活性，是具備重大經(jīng)濟價值和生態(tài)環(huán)境效益的綠色抗蟲材料。然而，隨著Bt毒素制劑和轉基因抗蟲作物長期應用，致使靶標害蟲抗藥性進化加快，并對非靶標生物的交互毒性等潛在風險加大，因此對其殘留監(jiān)測成了農業(yè)食品和環(huán)境安全風險評估的重要內容。本研究梳理了Bt毒素傳統(tǒng)的依托微生物表達體系的制劑和植物表達體系的轉基因抗蟲作物應用及其對靶標害蟲抗藥性和非靶標生物交互毒性潛在風險的研究現(xiàn)狀，概述了針對Bt毒素殘留分析的免疫檢測研究進展；并結合本研究團隊近年來依托熱門的噬菌體展示抗體庫技術，在Bt毒素特異性基因工程抗體創(chuàng)制以及Bt毒素抗蟲模擬物靶向設計等方面的最新研究成果，探討了基于Bt毒素的新型安全殺蟲蛋白質創(chuàng)新研發(fā)與應用策略及其毒素蛋白質殘留檢測技術創(chuàng)新等未來潛在發(fā)展動向和可行捷徑，為進一步圍繞Bt毒素的相關研究提供有價值的文獻資料和新的思路。

關鍵詞：" Bt毒素；殺蟲蛋白質；蛋白質表達；轉基因作物；農藥殘留；免疫檢測

中圖分類號：" S481""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2387-14

收稿日期：2024-03-13

基金項目：江蘇省自然科學基金面上項目（BK20231384）；國家自然科學基金重點項目（31630061）；國家重點研發(fā)計劃政府間國際合作重點專項（2023YFE0109400）；江蘇省農業(yè)自主創(chuàng)新基金項目

作者簡介：徐重新（1987-），男，湖南新田人，博士，副研究員，主要從事農業(yè)食品安全危害物防控研究。（E-mail）hhxyxcx@163.com

徐重新，沈建興，金嘉鳳，等. Bt毒素表達應用及其殘留風險與免疫檢測研究進展［J］. 江蘇農業(yè)學報，2024，40（12）：2387-2400.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.022

Research progress on the expression and application of Bt toxin and its residue risk and immunoassay

XU Chongxin1，2，" SHEN Jianxing1，2，" JIN Jiafeng1，2，" CHEN Wei2，" ZHANG Xiao2，" LIU Yuan2，" LIU Xianjin2

（1.School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China;2.Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory Cultivation Base， Ministry of Science and Technology——Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety， Nanjing 210014， China）

Abstract：" Bt toxin is a kind of biological macromolecular protein produced by Bacillus thuringiensis， which has specific toxic activity for many common agricultural and forestry pests and even health mosquito vectors， and is a green insect-resistant material with great economic value and ecological and environmental benefits. However， with the long-term use of Bt toxin preparations and Bt-transgenic crops， the potential risks of their exposure， such as driving the evolution of resistance to target pests and cross-toxicity to non-target organisms， have attracted much attention. Therefore， monitoring their residues has become an important part of agriculture， food and environmental safety risk assessment. This paper reviewed the current status of research on the application of Bt toxin traditional preparations based on microbial expression system and transgenic insect-resistant crops based on plant expression system， as well as the potential risk of resistance to target pests and cross-toxicity of non-target organisms， and summarized the research progress of immunoassay for Bt toxin residues monitoring. Combined with the latest research results of our research team in the creation of Bt toxin-specific genetic engineering antibodies and the targeted design of Bt toxin anti-insect mimics based on the popular phage display antibody library technology in recent years， the innovative research and development and application strategies of new safe insecticidal proteins based on Bt toxins and the future potential development trends and feasible shortcuts of technological innovation in the detection of toxin protein residues were discussed. This paper can provide valuable literature and new ideas for further research on Bt toxin.

Key words：" Bt toxin；insecticidal protein;protein expression;genetically modified crops;pesticide residue;immunoassay

Bt毒素是蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）代謝產生的具有高特異性靶向抗蟲功能的生物大分子蛋白質，現(xiàn)已認定命名的Bt毒素包括Cry、Cyt、Vip和Sip等4大類型總計超過1 000余種亞型，它們的相對分子量大多介于25 000～135 000 Da，殺蟲譜涵蓋鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目、膜翅目以及線蟲和蝸牛等多種常見農林害蟲和衛(wèi)生媒介蚊蟲。盡管Bt毒素種類多、殺蟲譜廣，但它們中絕大多數(shù)亞型對靶標害蟲的作用機制基本被鎖定為與相應蟲體中腸壁細胞膜上特異性膜蛋白受體的系列級聯(lián)互作，從而導致蟲體腸道功能消化吸收紊亂，最終引起蟲體生長發(fā)育受阻直至死亡。目前，Bt毒素以微生物表達制劑和轉基因抗蟲作物形式被廣泛用于害蟲綠色防治，單是在中國登記的現(xiàn)行的有效成分中含Bt毒素的微生物農藥就有240余種，而其商品化的轉基因作物涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、棉花、煙草等重要作物類型，每年在全球的種植面積接近2×108 hm2，帶動產生了巨大的經(jīng)濟價值和社會生態(tài)效益。不過，自20世紀30年代和90年代商品化的Bt毒素制劑和轉基因抗蟲作物先后面世以來，Bt毒素產品在全世界連續(xù)推廣應用已近百年，由其長期疊加蓄積誘發(fā)的靶標害蟲抗藥性以及對非靶標生物的交互毒性等潛在風險問題日益凸顯，尤其是近年來，有關其轉基因作物食品的安全性備受輿論關注，爭議不絕于耳。中國早在2001年就由國務院頒布了《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》，2023年農業(yè)農村部頒布最新修訂的《轉基因植物安全評價指南》，國家層面上一直高度重視轉基因及其產品研發(fā)應用，同時也不斷明確要求加大轉基因及其產品的監(jiān)督檢查與安全評價力度。基于抗體-抗原特異性識別原理的免疫檢測是在蛋白質層面上追蹤和篩查Bt毒素的最常用方法，特別是酶聯(lián)免疫分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和金標側流免疫層析法（Lateral flow immunoassay， LFIA）已被納入國家標準《轉基因產品檢測 蛋白質檢測方法》（GB/T 19495.8-2004）用于Bt毒素檢測。當前抗體已從傳統(tǒng)多克隆抗體（Polyclonal antibodies，pAbs）和單克隆抗體（Monoclonal antibody， mAb）發(fā)展到了形式更為多樣的人工基因工程抗體（Genetically engineered antibody， GEAb）階段，依托這些抗體材料衍生出了借助比色（Colorimetric）、熒光（Fluorescence）、化學發(fā)光（Chemiluminescence）、電化學（Electrochemical）、光電化學發(fā)光（Photoelectrochemical）、表面等離子共振（Surface plasmon resonance）以及肉眼可視化試紙（特指LFIA）等技術手段的可用于Bt毒素快速追蹤篩查的免疫分析方法?；诖耍谙到y(tǒng)梳理Bt毒素表達應用及其殘留風險研究現(xiàn)狀的基礎上，重點概述了有關免疫檢測方法在Bt毒素追蹤篩查上的研究進展，并結合本研究團隊近年來在基因工程抗體靶向設計與應用上的最新研究成果和相應研究經(jīng)驗，對圍繞Bt毒素的殺蟲蛋白質創(chuàng)新研發(fā)與應用策略以及相應毒素蛋白質追蹤篩查技術的未來發(fā)展動向進行探討，以期為開展相關研究提供新的、有價值的文獻資料，同時為相關研究開拓新思路。

1" Bt毒素表達應用研究現(xiàn)狀

Bt毒素在靶標害蟲防治應用上主要依托基于微生物表達體系的制劑和基于植物表達體系的轉基因抗蟲作物兩種形式。就微生物表達體系的制劑而言，商品化的Bt毒素制劑產品幾乎都是依托蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株進行表達，相應配套的表達質粒載體較為成熟，毒素產物結構較為完整、構象相對穩(wěn)定，蛋白質表達量及其活性受到sigma 70家族（Sig A/E/K/H）轉錄起始因子、Spo0A～P孢子形成調控因子、sigma 54家族（Sig L）和多聚磷酸鹽激酶（PPK）代謝調控因子以及輔助蛋白質P20等多重因素的復雜協(xié)同調控。而在實驗室研究階段，大腸桿菌（Escherichia coli）憑借其較為清晰的遺傳背景和成熟的配套質粒載體，幾乎成為了包括Bt毒素在內的外源蛋白質室內小劑量表達分析和初步應用的首選菌株。此外畢赤酵母（Pichia pastoris）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、發(fā)光桿菌（Photorhabdus temperata）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、乳酸鏈球菌（Lactococcus lactis），甚至桿狀病毒baculovirus-sf 9細胞表達體系和噬菌體phage-大腸桿菌表達體系都有用于表達Bt毒素的研究報道，文獻可查的涉及Bt毒素表達的微生物菌株及相應配套的質粒載體見表1所示。就植物表達體系的Bt毒素轉基因抗蟲作物而言，目前僅有Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa2、Cry2Ab2、Cry2Ae、Cry3Bb1、Cry9C、Cry34Ab1、Cry35Ab1和Vip3Aa19、Vip3Aa20，以及人工改造的Cry1A.105、mCry3A和eCry3.1Ab等為數(shù)不多的亞型轉基因抗蟲作物實現(xiàn)了商品化推廣應用。不過涉及Bt毒素的轉基因作物研發(fā)一直是業(yè)界持續(xù)關注的熱點，供試的Bt毒素種類眾多，相關作物現(xiàn)已涵蓋水稻、玉米、小麥、大豆、花生、鷹嘴豆、豇豆、卷心菜、油菜、煙草、棉花等主要糧食作物和經(jīng)濟作物。涉及的Bt毒素蛋白質在相應轉基因作物植株根、莖、葉以及花粉、果實等不同部位中的表達量差異較大，總體來說在葉片中的毒素蛋白質表達量相對較高，大多能達到μg/g級別，在花粉、果實中表達量普遍較低，一般都處于或低于ng/g級別。文獻至文獻中報道的Bt毒素在鮮葉中的蛋白質表達量在μg/g級別（表2）。這是因為在構建轉基因抗蟲作物品系過程中，往往會以靶標害蟲對作物植株取食部位的偏好性（多數(shù)為葉莖）為導向，從而設計組織特異性驅動的啟動子，如用于轉基因水稻的pGreen啟動子、用于轉基因玉米的ubi啟動子和用于轉基因土豆的Lhca3啟動子等都是靶向定位在相應轉基因作物植株葉片的特異性高效表達啟動子，這種設計策略在有效防治害蟲的同時，也能最大限度減少毒素蛋白質在這些農作物的食用組織部位的殘留蓄積。

2" Bt毒素殘留風險研究現(xiàn)狀

自Bt毒素制劑及其轉基因抗蟲作物推廣應用以來，對其殘留及暴露風險不間斷持續(xù)性監(jiān)測與評估是相關農業(yè)食品和生態(tài)環(huán)境安全研究的重要內容。長期跟蹤研究結果表明，采用常規(guī)制劑噴灑和轉基因作物表達應用方式，在自然條件下，Bt毒素蛋白質在土壤和轉基因作物組織中的殘留量半降解期普遍在20～35 d，且1年內降解量均可達到85%以上，完全降解則需要3～4年甚至更長時間。不過隨著Bt毒素制劑和轉基因抗蟲作物長期廣泛應用，其殘留或疊加累積殘留風險越發(fā)突出，其中驅動靶標害蟲抗藥性進化風險是包括Bt毒素在內的幾乎所有農藥在長期廣泛使用后都會出現(xiàn)的問題。自20世紀90年代在田間自然環(huán)境中首次發(fā)現(xiàn)小菜蛾（Plutella xylostella）對Bt毒素產生抗藥性以來，目前至少包括小菜蛾、草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）在內的13種常見鱗翅目害蟲以及包括美洲玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgifera）和山楊葉甲（Chrysomela tremulae）在內的2種鞘翅目害蟲在野外已經(jīng)被監(jiān)測到對一種或多種Bt毒素產生了抗藥性（表3）。此外，遍布世界的相關研究機構在實驗室條件下特異性篩選的各種靶標害蟲抗性品系更是不勝枚舉，這些品系的潛在逃逸風險極大地增加了野外環(huán)境中靶標害蟲對Bt毒素抗性進化的不確定性。

非靶標生物的交互毒性也是Bt毒素在推廣應用過程中關注的重點。大量研究結果表明，在科學理性劑量條件下的毒理試驗中，Bt毒素對包括人類、小鼠、兔子、羊在內的哺乳動物以及鵪鶉、斑馬魚、蜜蜂、蚯蚓、捕食性天敵草蛉等典型代表性實驗生物均未觀測到明顯異常的毒副作用表征，但也無法完全排除其可能存在的潛在風險。有跡象表明，Bt毒素殘留可能會導致某些環(huán)境微生物多樣性結構亞失衡，只是相關研究結果尚存爭議。目前，有確切證據(jù)表明，部分Bt毒素對非靶標生物家蠶（Bombyx mori）、二星瓢蟲（Adalia bipunctata）和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）具有較強的特異性交互毒副作用（表3），部分Bt毒素還對個別寄生蜂種類如中紅側溝繭蜂（Microplitis mediator）、內寄生小黃蜂（Palmistichus elaeisis）、赤眼蜂（Trichogramma chilonis）的卵孵化和幼蟲發(fā)育存在一定毒副作用?？偟膩碚f，相較于化學農藥，除了同樣存在不可規(guī)避的驅動靶標害蟲抗藥性風險之外，Bt毒素對非靶標生物的交互毒性風險仍然是現(xiàn)有可用的所有同等藥效農藥類型中相對最低的。Bt毒素制劑及其轉基因抗蟲作物所帶動產生的巨大經(jīng)濟價值和生態(tài)環(huán)境效益奠定了其在害蟲綠色防控上的引領地位，并在可預知的未來相當時期內幾乎不可替代。

3" Bt毒素殘留免疫檢測研究現(xiàn)狀

免疫檢測是基于抗體-抗原特異性結合互作識別的分析方法，具有操作簡便、反應快速、特異性強、靈敏度高等特點，現(xiàn)已廣泛應用于包括Bt毒素在內的靶標抗原快速篩查監(jiān)測中。免疫檢測法的核心基礎材料是抗體，而當前抗體形式已經(jīng)從傳統(tǒng)天然pAbs和mAb發(fā)展到了人工修飾的GEAb階段。天然抗體中，除羊駝和鯊魚等極少數(shù)為先天缺失輕鏈結構的特殊抗體外，其他高等級動物均為包含了典型雙重-輕鏈結構的“Y”型抗體，而GEAb則為人工修飾而成的天然抗體的完整抗原結合片段，較為常見的如天然“Y”型抗體的單重-輕鏈由柔性短肽拼接而形成的單鏈抗體（scFv）及其單個重鏈或單個輕鏈的單域抗體（sDAb）和源于羊駝或鯊魚的單重鏈納米抗體（Nbs）。目前，基于這些抗體形式，采用單抗體或雙抗體組合等策略，結合特異性標記物及相應探測手段，衍生出了包括比色的酶聯(lián)免疫分析（ELISA），肉眼可視化試紙LFIA以及熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、光電化學發(fā)光、表面等離子共振等特征性發(fā)光探測乃至免疫PCR等形式多樣的免疫檢測方法，均可用于Bt毒素殘留的追蹤篩查，相關代表性研究實例見表4。

ELISA是基于酶標記（如辣根過氧化物酶HRP）的特異性顯色比色法，其中依托雙抗體-抗原互作的夾心ELISA（DAS-ELISA）和單抗體-抗原互作的競爭ELISA（IC-ELISA）是Bt毒素最為經(jīng)典的免疫檢測方法，其檢測靈敏度主要由抗體-抗原互作的親和力決定，一般而言基于優(yōu)質的抗體所建立的ELISA對Bt毒素檢測的靈敏度能達到甚至略低于ng/mL級或ng/mg級；如果進一步優(yōu)化標記物，如將HRP與鏈霉親和素（SA）及沸石咪唑鹽骨架（ZIF-8）耦合形成HRPamp;SA/ZIF-8復合物標記抗體建立DAS-ELISA，對Cry1Ab毒素檢測的靈敏度就可達pg/mL級或pg/mg級。LFIA也是Bt毒素最為常見的免疫檢測方法之一，其中膠體金標記抗體的肉眼可視化試紙LFIA最具代表性，商品化產品也最為成熟，只是該方法靈敏度相對較低，一般在100 ng/mL級或100 ng/mg級；不過隨著量子點（QDs）、多重熒光-生物素耦合放大效應物（如FLPL-BSAS）等熒光性標記物應用到LFIA上，借助熒光激發(fā)顯色儀，可實現(xiàn)對Bt毒素檢測的肉眼可視，檢測靈敏度達到ng/mL級或ng/mg級甚至pg/mL級或pg/mg級。ELISA和LFIA作為Bt毒素最基礎也是最具代表性的兩種免疫檢測方法，相關研究較多，產品化開發(fā)也較為成熟，單是美國EnviroLogix Inc公司推出的Bt-ELISA試劑盒就涵蓋了Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry3Bb1、Cry9C、Cry34Ab1、mCry3A等亞型，檢測限均低于1 ng/mL或1 ng/mg，同時其推出的Bt-LFIA試紙條也涵蓋了Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ac、Cry2Ae、Cry3Bb、Cry9C、Cry34Ab1、Vip3A、CryBt11、mCry3A等亞型，檢測限均低于0.1 μg/mL或0.1 μg/mg（http：//www.envirotest-china.com/chan-pin-fen-lei/zhuan-ji-yin/）。

基于熒光、化學發(fā)光、電化學發(fā)光、光電化學發(fā)光、表面等離子共振等特征性發(fā)光信號探測的免疫分析法又被統(tǒng)稱為免疫傳感器（表4），目前在Bt毒素檢測上的創(chuàng)新研究較為熱門。這些檢測方法既有偏向的特征性，在標記物耦合材料、信號激發(fā)或信號探測上又有一些重疊，它們的共同特點是依托抗體-抗體互作的親和力，進一步借助特殊發(fā)光標記物標記抗體，與Bt毒素特異性結合的同時，通過信號激發(fā)起到信號放大的作用，從而極大提高對Bt毒素檢測的靈敏度。不過這些方法大多數(shù)處于實驗室探索研究的初級階段，目前還未出現(xiàn)相關成熟的商品化應用產品。其中，熒光免疫分析（FLISA）主要是借助熒光納米材料標記到抗體上，在特異性結合Bt毒素后，通過熒光顯色就能探測到Bt毒素，代表性的熒光標記物有稀土元素，如量子點、熒光聚合物點（PDs）、熒光素酯（FDA）、磁性納米顆粒（MNps）熒光微球以及異硫氰酸熒光素（FITC）等，相關FLISA對Bt毒素的檢測靈敏度可以達到ng/mL級或ng/mg級甚至個別可以突破pg/mL級或pg/mg級。而化學發(fā)光免疫分析（CLIA）、電化學發(fā)光免疫分析（CLIA）、光電化學發(fā)光免疫分析（PECLIA）以及表面等離子共振免疫分析（SPRIA）則都是依托光、電或光電級聯(lián)的以特征性發(fā)光納米材料標記抗體為基礎的，集材料標記、信號激發(fā)以及信號探測于一體的檢測分析系統(tǒng)，其中金納米顆粒（AuNPs）、鐵離子磁性納米顆粒（如Fe3O4）和量子點納米顆粒是較為常見的基礎性耦合材料，而相應復合材料信號激發(fā)和信號探測方式較為多樣，對Bt毒素的檢測靈敏度也相對較高，一般在pg/mL級或pg/mg級甚至更低（表4）。這類檢測方法在信號材料耦合上較為復雜，對儀器要求較高，依賴性較強，在市場化推廣應用上仍然任重道遠。此外，基于抗體與特異性核苷酸耦合的免疫-PCR也有零星涉及Bt毒素檢測應用研究的報道，不過靈敏度差異較大，相關技術可能還不夠穩(wěn)定。

4" 展望

得益于Bt毒素對靶標害蟲的高效廣譜殺蟲活性和對人類及生態(tài)環(huán)境的高安全性優(yōu)勢，其成熟的和在研的制劑產品及轉基因抗蟲作物品系幾乎遍布全球，引發(fā)了害蟲防控的綠色革命，也帶動產生了前所未有的經(jīng)濟價值和生態(tài)環(huán)境效益。隨著世界范圍內害蟲綠色防控理念深入人心，農藥投入品從高危高毒高殘留的化學農藥向高效低毒低殘留乃至高效無毒無殘留的生物農藥發(fā)展的趨勢已成為必然。Bt毒素作為當前最具代表性的蛋白質類生物材料，其表達應用策略不斷創(chuàng)新的同時，對其殘留的風險評估和追蹤篩查也必將是農業(yè)食品和生態(tài)環(huán)境安全領域持續(xù)關注的重點。

圍繞Bt毒素表達應用，目前盡管采用傳統(tǒng)微生物制劑或轉基因抗蟲作物方式均能實現(xiàn)對相應靶標害蟲的綠色防控，但隨著靶標害蟲抗藥性進化，特別是一些單劑型Bt毒素產品已經(jīng)無法滿足生產上對害蟲防治的需求。近年來，借鑒成熟的化學農藥復配經(jīng)驗模式，針對不同農藥對相同靶標害蟲的不同作用模式特征，特別是設計Bt毒素與其他蛋白質類生物農藥（如具抗蟲功能的凝集素、蛋白酶抑制劑、動物毒素、植物防御素等）甚至其他亞型的Bt毒素進行復配的創(chuàng)新應用策略，有望提高對靶標害蟲及其抗藥性靶標害蟲的治理能力，相關復配的制劑或基因融合表達的轉基因抗蟲作物品系已有部分研究成功的報道，但成熟的產品較少，相關研究值得繼續(xù)推進。此外，近年來以植物內生菌為生防載體搭載外源抗病、抗蟲蛋白質基因定殖于宿主作物協(xié)同防治靶標病蟲害的策略也逐漸受到關注，如Downing等以植物內生細菌Pseudomonas fluorescens搭載幾丁質酶基因定殖于大豆防治立枯絲核菌引起的病害，Qi等以植物內生真菌Chaetomium globosum搭載半夏凝集素基因定殖于油菜防治蚜蟲，均達到了預期效果。目前這種不同于傳統(tǒng)微生物制劑和轉基因抗蟲作物模式的創(chuàng)新應用策略尚未涉及Bt毒素的相關研究，值得探索開發(fā)。

雖然Bt毒素也有殘留風險，但是從目前已知可選的農藥類型分析，綜合靶標害蟲抗蟲活性、非靶標生物交互毒性以及生態(tài)環(huán)境危害性等因素考慮，Bt毒素仍是當前安全系數(shù)最高的綠色生物抗蟲材料，這基本上已經(jīng)成為業(yè)界共識。但不容忽視的是，在Bt毒素制劑產品及其轉基因抗蟲作物的驅動下，近年來靶標害蟲抗藥性進化趨勢正在加劇，同時存在交互毒性的非靶標生物，特別是經(jīng)濟物種家蠶的生境面臨前所未有的脅迫壓力。此外轉基因跨物種基因漂移和轉基因食品潛在安全風險等問題，在有限的時間內既無法肯定也不能完全排除，仍然需要長期跟蹤調查和大數(shù)據(jù)綜合評估。目前，除了借鑒化學農藥采用交替或復配用藥策略外，尚未發(fā)現(xiàn)更好的方式來有效緩解靶標害蟲對Bt毒素的抗藥性壓力，不過針對非靶標生物的交互毒性，目前在室內條件下是可以通過人工定向突變受體基因（如家蠶中腸受體ABC轉運蛋白）的方式來緩解甚至是抵御Bt毒素對其造成的交互毒性。本研究團隊近年來借鑒抗體免疫網(wǎng)絡理論中Ab2β類型抗獨特型抗體具有模擬抗原結構乃至生物功能的特性（圖1a），設計以Bt毒素抗體為固相包被靶點，并結合相應靶標害蟲中腸受體如鈣黏蛋白質、堿性磷酸酶等蛋白質的關鍵功能片段互作信息，從人源化的噬菌體展示抗體庫中靶向篩選獲得一系列具備初步模擬相應Bt毒素部分關鍵結構和殺蟲功能（圖1b）的人源抗蟲抗體材料，Bt毒素及其抗蟲模擬物對靶標害蟲幼蟲飼喂72 h的校正死亡率如表5所示。這類全新的具備模擬Bt毒素殺蟲功能的抗蟲抗體材料，不僅有望緩解靶標害蟲對Bt毒素的抗藥性壓力，同時由于其人源屬性，理論上對人類免疫系統(tǒng)不會造成明顯的異源排斥反應風險，因此與Bt 毒素相比更具安全性，相關研究結果極具借鑒意義和探索價值。

圍繞Bt毒素免疫檢測方面，抗體制備及信號物標記、探測分析是開展相關檢測研究的重點，其中抗體是最為核心的基礎性材料。目前Bt毒素免疫檢測無論是產品研發(fā)還是技術創(chuàng)新設計，仍然以傳統(tǒng)成熟的pAbs和mAb為主，而GEAb盡管受到熱捧，但在抗原結合活性和功能穩(wěn)定性方面普遍不盡如人意，還難以推進應用。值得注意的是，近年來一些新型“擬抗體”功能的生物材料有替代抗體與抗原特異性識別結合并用于Bt毒素免疫檢測的發(fā)展趨勢。如靶標害蟲中腸受體鈣黏蛋白質與部分Bt毒素的親和力可達1 nmol/L，由此Shen等以鈣黏蛋白質片段與pAbs組合建立DAS-ELISA對Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab毒素的廣譜檢測靈敏度達到5.03～30.83 ng/mL，Wan等以鈣黏蛋白質表位短肽聚合物偶聯(lián)生物素建立ELISA對Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F、Cry2Aa毒素廣譜識別能力的線性檢測范圍為0～50 ng/mL，Wang等以小菜蛾BBMV與噬菌體展示短肽組合建立DAS-ELISA對Bt Cry2Ad毒素的檢測靈敏度達到8 ng/mL，Lu等則以噬菌體展示短肽與mAb組合建立HRP/AuNPs標記的ECLIA對Cry1Ab毒素的檢測靈敏度高達7 pg/mL，Jin等依托核酸適配體（Aptamer）建立的類ECLIA對Cry1Ab毒素的檢測靈敏度達到0.96 ng/mL，Chen等依托DNA探針建立的表面增強拉曼分析法對Cry1Ab、Cry1Ac的檢測靈敏度高達0.1 pg/mL。這些新型類抗體功能的生物材料為Bt毒素免疫檢測創(chuàng)新研發(fā)提供了潛在的豐富的可組合甚至是可替代的基礎性材料，值得進一步挖掘應用。

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（責任編輯：黃克玲）