4種葡萄SOD家族基因鑒定與表達(dá)分析

摘要：" 超氧化物歧化酶（SOD）在植物體氧化與抗氧化平衡中起至關(guān)重要的作用。本研究對4種葡萄SOD家族基因進(jìn)行了全基因組鑒定和表達(dá)分析。鑒定結(jié)果顯示，4種葡萄共有45個(gè)SOD基因，其中黑比諾葡萄12個(gè)、山葡萄8個(gè)、河岸葡萄15個(gè)、圓葉葡萄10個(gè)，SOD基因隨機(jī)分布在染色體上;葡萄SOD基因啟動子中有多個(gè)激素、生長發(fā)育、逆境脅迫等響應(yīng)順式作用元件;種內(nèi)共線性分析結(jié)果顯示，黑比諾葡萄、山葡萄和河岸葡萄SOD基因中僅含有1對共線性關(guān)系，而圓葉葡萄SOD基因中含有6對共線性關(guān)系;qRT-PCR結(jié)果表明VaSOD基因?qū)β然c（NaCl）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）、低溫（4 ℃）等不同非生物脅迫的響應(yīng)明顯。4種葡萄SOD基因之間堿基序列相對保守，親緣關(guān)系較近。本研究結(jié)果為進(jìn)一步解析葡萄SOD 家族基因在其生長發(fā)育和非生物脅迫應(yīng)答中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：" 葡萄;SOD基因;基因家族;生物信息學(xué);表達(dá)分析

中圖分類號：" S663.1""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2334-15

收稿日期：2024-01-12

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32060671）;2021甘肅省青年人才托舉工程項(xiàng)目（GXH20210611-01）;甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202110733035）

作者簡介：梁" 靖（2000-），女，甘肅武威人，碩士研究生，主要從事果樹生理與生物技術(shù)方面的研究。（E-mail）1436387524@qq.com

通訊作者：褚明宇，（E-mail）chu.my@foxmail.com

梁" 靖，王調(diào)葉，劉雅詩，等. 4種葡萄SOD家族基因鑒定與表達(dá)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2024，40（12）：2334-2348.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.017

Identification and expression analysis of SOD family genes in four kinds of grapes

LIANG Jing，" WANG Tiaoye，" LIU Yashi，" SUN Yingying，" CHEN Baihong，" CHU Mingyu

（College of Horticulture， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Abstract：" Superoxide dismutase （SOD） plays an important role in the balance between oxidation and antioxidation in plants. In this study， the whole genome identification and expression analysis of SOD family genes in four kinds of grapes were carried out. The identification results showed that there were 45 SOD genes in the four kinds of grapes， including 12 genes in Pinot Noir， eight genes in Vitis amurensis， 15 genes in Vitis riparia and 10 genes in Vitis rotundifolia. The SOD genes were randomly distributed on chromosomes. There were many cis-acting elements in the promoter of grape SOD gene， such as hormones， growth and development， stress response and so on. The results of intraspecific collinearity analysis showed that there was only one pair of collinearity in the SOD genes of Pinot Noir， Vitis amurensis and Vitis riparia， while there were six pairs of collinearity in the SOD genes of Vitis rotundifolia. The results of qRT-PCR showed that the VaSOD gene responded significantly to different abiotic stresses such as sodium chloride （NaCl）， salicylic acid （SA）， abscisic acid （ABA） and low temperature （4 ℃）. The base sequence of SOD genes in four kinds of grapes was relatively conservative and the genetic relationship was relatively close. The results of this study can lay a foundation for further analysis of the mechanism of grape SOD family genes in their growth and development and abiotic stress response.

Key words：" grape;SOD gene;gene family;bioinformatics;expression analysis

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶。按照SOD中金屬輔基的不同，可將SOD分為4大類，分別為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD ，其活性可以影響植物生長發(fā)育、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定性以及植物的抗逆性。SOD能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在植物體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，干旱、低溫、鹽堿等非生物脅迫會導(dǎo)致植物細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧，而過量的活性氧會導(dǎo)致植物細(xì)胞受到損傷，甚至導(dǎo)致不可修復(fù)的代謝功能障礙和細(xì)胞死亡。因此，在植物生長發(fā)育和進(jìn)化過程中會形成酶和非酶抗氧化保護(hù)系統(tǒng)以清除活性氧。SOD是清除植物體內(nèi)氧自由基的關(guān)鍵酶。

Cu/Zn-SOD最早從魚發(fā)光桿菌中分離得到，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物體和動物體內(nèi)，與抗寒、抗旱、耐鹽堿等多種抗逆性密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，在擬南芥和西葫蘆中過表達(dá)SOD基因可提高抗寒能力;馬鈴薯植株在低溫脅迫下，超氧化物歧化酶（SOD）活性是正常溫度下的1.38倍;轉(zhuǎn)SOD基因木薯在低溫下可通過提高SOD活性來清除活性氧并激活機(jī)體抗氧化防御機(jī)制，從而提高機(jī)體對寒冷的耐受性;鉛、鋅、銅、汞等重金屬污染在超過耐受濃度時(shí)會對植物體內(nèi)SOD活性產(chǎn)生顯著影響;MSD1是一種獨(dú)特的高爾基體/質(zhì)體類型的錳超氧化物歧化酶，水稻的MSD1基因會導(dǎo)致水稻植株對熱脅迫非常敏感，在干旱條件下，不耐旱品種苜蓿根莖中SOD活性低于耐旱品種，說明植物的抗旱性可能與SOD活性有關(guān)。低溫脅迫時(shí)，玉米中SOD活性呈現(xiàn)先緩慢增長后下降再增長的趨勢，這表明，在一定范圍內(nèi)玉米可以通過調(diào)節(jié)自身的酶系統(tǒng)來抵御低溫脅迫造成的傷害。近年來，葡萄的生長發(fā)育不斷受到低溫、干旱、鹽堿等非生物因素的影響，造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。黑比諾葡萄（Vitis vinifera）是全球現(xiàn)存最古老的葡萄品種之一，2007年法國和意大利聯(lián)合科學(xué)家團(tuán)隊(duì)采用全基因組鳥槍法首次對黑比諾葡萄全基因組進(jìn)行測序組裝，并經(jīng)過多次更新。山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是世界上被廣泛應(yīng)用的抗寒葡萄資源，能作為抗寒育種的良好親本。河岸葡萄（Vitis riparia）在北美廣泛分布，抗葡萄根瘤蚜和根結(jié)線蟲等。圓葉葡萄（Muscadinia rotundifolia）是世界公認(rèn)的抗病性葡萄品種，也是目前唯一檢測到含鞣花酸的葡萄品種，鞣花酸具有抗癌功效。中國北方地區(qū)光照充足、晝夜溫差大，是優(yōu)質(zhì)葡萄栽培區(qū)，但冬季氣候寒冷干燥，凍害是限制該地區(qū)葡萄種植及產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的主要因素之一。研究葡萄抗寒機(jī)制對于提高葡萄抗寒性及葡萄產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效具有重要意義，而SOD活性是研究植物逆境脅迫的重要指標(biāo)之一。山葡萄在冬季-45～-40 ℃能安全越冬，抗寒能力遠(yuǎn)高于其他葡萄品種，還可作為砧木提高嫁接品種的抗寒性。因此本研究利用黑比諾葡萄、山葡萄、河岸葡萄、圓葉葡萄的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行SOD家族基因的生物信息學(xué)分析，并進(jìn)一步分析了山葡萄SOD基因在非生物脅迫和激素處理下的響應(yīng)表達(dá)模式，為葡萄SOD基因家族成員功能研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 材料處理

本試驗(yàn)所用材料為山葡萄試管苗，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院組培室提供。山葡萄試管苗培養(yǎng)于GS固體培養(yǎng)基中，附加30 g/L蔗糖，置于培養(yǎng)箱（溫度25 ℃/光照16 h，溫度22 ℃/黑暗8 h）中。挑選生長健壯且長勢一致的組培苗，分別繼代培養(yǎng)在含有100 μmol/L脫落酸（ABA）、100 μmol/L水楊酸（SA）、100 μmol/L氯化鈉（NaCl）和加了清水的GS液體培養(yǎng)基中，低溫脅迫處理在植物培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度為4 ℃，處理時(shí)間分別為0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，每個(gè)處理重復(fù)3次。處理結(jié)束后，取樣品并放入-80 ℃冰箱中備用。

1.2" 葡萄SOD基因家族的鑒定

下載黑比諾葡萄、山葡萄、河岸葡萄和圓葉葡萄基因組和注釋信息文件。利用TBtools軟件提取葡萄的所有蛋白質(zhì)氨基酸序列并與AtSOD家族蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行比對，初步獲取葡萄SOD基因家族成員。通過NCBI數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)聚類信息進(jìn)行BLAST比較篩選得到SOD蛋白質(zhì)氨基酸序列，用PFAM和SMART兩個(gè)軟件去除不含保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，共鑒定出45個(gè)葡萄SOD家族基因。

1.3" 葡萄SOD蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位預(yù)測及二級結(jié)構(gòu)分析

葡萄SOD蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分別使用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）、PSORT（http：//psort.hgc.jp/）進(jìn)行分析和預(yù)測。葡萄SOD家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)占比通過SOPMA進(jìn)行預(yù)測。

1.4" 葡萄SOD家族基因系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結(jié)構(gòu)和motif分析

利用Clustal X對4種葡萄、擬南芥、番茄、水稻SOD家族蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行分析，并通過MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置1 000重復(fù)值，并使用在線工具iTOL v6（https：// itol. embl.de/）進(jìn)行美化?；蚪Y(jié)構(gòu)通過TBtools 1.6進(jìn)行可視化，SOD家族氨基酸序列利用工具M(jìn)EME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對保守基序進(jìn)行分析（設(shè)置10個(gè)motif）。

1.5" 葡萄SOD家族基因順式作用元件分析

使用TBtools 1.6提取所有葡萄SOD家族基因的順式作用元件區(qū)域，將所得結(jié)果利用在線軟件Plant CARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和TBtools 1.6分別進(jìn)行預(yù)測分析和可視化。

1.6" 葡萄SOD家族基因染色體定位、密碼子偏好性及共線性分析

利用TBtools 1.6提取染色體信息，繪制目標(biāo)基因的染色體圖譜。利用編碼序列（CDS）計(jì)算密碼子使用偏好，主要參數(shù)為多物種密碼子偏好性（RSCU）、密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）、密碼子偏好性指數(shù)（CBI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（Fop）、有效密碼子數(shù)（Nc）、同義密碼子第3位堿基中G+C含量（GC3s）、鳥嘌呤-胞嘧啶含量（GC）;用TBtools 1.6對共線性基因進(jìn)行分析和定位。

1.7" 非生物脅迫及外源激素處理下山葡萄SOD基因的表達(dá)分析

在生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成8個(gè)山葡萄基因的qPCR引物（表1）。在4 ℃條件下，以SA、ABA、乙烯和NaCl處理下的山葡萄試管苗為材料提取RNA，通過試劑盒（Prime Script RT reagent Kit，Perfect Real Time，TaKaRa）轉(zhuǎn)化為cDNA。以cDNA 2 μL、上游＋下游引物2 μL、SYBR酶 10 μL、ddH2O去離子水6 μL作為反應(yīng)體系，通過PCR儀（Light Cycler 96 Real-Time PCR System，Roche）分析，使用TBtools 1.6進(jìn)行可視化。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 葡萄SOD家族基因鑒定及其編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)

通過同源篩選，４種葡萄共鑒定出45個(gè)SOD基因（表2），其中黑比諾葡萄SOD基因（VvSOD） 12個(gè)、山葡萄SOD基因（VaSOD）8個(gè)、河岸葡萄SOD基因（VrSOD）15個(gè)、圓葉葡萄SOD基因（VmSOD）10個(gè)，根據(jù)其染色體位置信息命名為VvSOD1～VvSOD12、VaSOD1～VaSOD8、VrSOD1～VrSOD15以及VmSOD1～VmSOD10。理化特性分析結(jié)果表明，VmSOD蛋白氨基酸序列長度介于152 aa至322 aa之間，其中VmSOD1最長;等電點(diǎn)介于5.48至9.05之間；其中VmSOD2、VmSOD5蛋白為堿性蛋白質(zhì)，其余為酸性蛋白質(zhì)；VmSOD1、VmSOD3、VmSOD4蛋白為疏水蛋白質(zhì)，其余為親水蛋白質(zhì)。VrSOD蛋白氨基酸序列長度介于122 aa至322 aa之間，其中VrSOD1最長;等電點(diǎn)介于5.33至8.79之間，其中VrSOD3、VrSOD4、VrSOD6和VrSOD7蛋白為堿性蛋白質(zhì)，其余為酸性蛋白質(zhì);VrSOD蛋白大部分為親水蛋白質(zhì)，只有VrSOD1和VrSOD2蛋白為疏水蛋白質(zhì)。VvSOD蛋白氨基酸序列長度為79～352 aa，其中VvSOD5最長;等電點(diǎn)為4.89～9.07，其中VvSOD2、VvSOD4和VvSOD5蛋白為堿性蛋白質(zhì)，其余為酸性蛋白質(zhì);VvSOD蛋白大多數(shù)為親水蛋白質(zhì)，只有VvSOD1、VvSOD3和VvSOD8蛋白為疏水蛋白質(zhì)。VaSOD蛋白長度介于146 aa至511 aa之間;等電點(diǎn)介于5.42至9.45之間，其中VaSOD1、VaSOD6、VaSOD7、VaSOD8蛋白為酸性蛋白質(zhì)，VaSOD2、VaSOD3、VaSOD4和VaSOD5蛋白為堿性蛋白質(zhì);VaSOD蛋白大部分為親水性蛋白質(zhì)，只有VaSOD1蛋白為疏水蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，４種葡萄SOD家族基因編碼的蛋白質(zhì)主要位于線粒體、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中。

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（表3）表明，所有基因編碼的蛋白質(zhì)均無β-折疊，主要為α-螺旋、無規(guī)則卷曲、拓展鏈結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角。圓葉葡萄α-螺旋介于3.95%至46.07%之間，無規(guī)則卷曲介于32.89%至55.77%之間，拓展鏈結(jié)構(gòu)介于11.80%至33.55%之間，β-轉(zhuǎn)角介于3.79%至9.05%之間;河岸葡萄α-螺旋介于3.29%至51.75%之間，無規(guī)則卷曲介于29.39%至59.02%之間，拓展鏈結(jié)構(gòu)介于12.42%至34.87%之間，β-轉(zhuǎn)角介于3.21%至9.02%之間;黑比諾α-螺旋介于2.63%至52.19%之間，無規(guī)則卷曲介于29.82%至60.00%之間，拓展鏈結(jié)構(gòu)介于11.44%至34.21%之間，β-轉(zhuǎn)角介于4.82%至10.53%之間;山葡萄α-螺旋介于3.95%至46.08%之間，無規(guī)則卷曲介于33.27%至55.26%之間，拓展鏈結(jié)構(gòu)介于12.09%至36.30%之間，β-轉(zhuǎn)角介于2.94%至8.41%之間。總之，葡萄SOD家族基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)無規(guī)則卷曲和α-螺旋占比較大，β-轉(zhuǎn)角占比最小，推測這可能是葡萄SOD家族基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。

2.2" 不同物種SOD家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

經(jīng)過鑒定的12個(gè)黑比諾葡萄、8個(gè)山葡萄、10個(gè)圓葉葡萄、15個(gè)河岸葡萄SOD基因和從NCBI中獲取的8個(gè)番茄、19個(gè)擬南芥、9個(gè)水稻SOD基因，將這81個(gè)SOD基因利用軟件MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），根據(jù)其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近將81個(gè)SOD基因分為5個(gè)亞族，其中第Ⅰ亞族中含有27個(gè)成員，第Ⅱ亞族中含有13個(gè)成員，第Ⅲ亞族中僅含有1個(gè)成員，第Ⅳ亞族中含有5個(gè)成員，第Ⅴ亞族中含有35個(gè)成員。VaSOD4、VaSOD7、VaSOD8、VvSOD5、VvSOD12、VrSOD5、VrSOD6、VrSOD14、VrSOD15、VmSOD10位于第Ⅰ亞家族;VaSOD2、VaSOD5、VrSOD3、VrSOD7、VvSOD2、VvSOD6、VmSOD2、VmSOD6位于第Ⅱ亞家族;VvSOD1、VrSOD1、VmSOD1位于第Ⅳ亞家族;VrSOD的9個(gè)成員和VvSOD的7個(gè)成員、VmSOD的6個(gè)成員以及VaSOD的3個(gè)成員位于第Ⅴ亞家族。4種葡萄的SOD基因與水稻、番茄的SOD基因親緣關(guān)系較近，推測這3個(gè)物種的SOD基因在功能方面可能具有一定相似性。

2.3" 葡萄SOD家族基因的染色體定位和共線性分析

利用TBtools進(jìn)行染色體定位分析（圖2）。河岸葡萄VrSOD基因定位在7條染色體上，其中2號、8號和13號染色體上各有1個(gè)基因，6號、10號和16號染色體上均有2個(gè)基因，14號染色體上基因分布最多，有6個(gè)基因，占河岸葡萄SOD總基因數(shù)的40%。圓葉葡萄VmSOD基因定位在6條染色體上，其中2號、8號、13號和16號染色體上各分布1個(gè)基因，6號和14號染色體上均有3個(gè)基因。山葡萄VaSOD家族基因不均勻地分布在6條染色體上，6號和16號染色體上各有2個(gè)基因，8號、10號、13號和14號染色體上各有1個(gè)基因。黑比諾葡萄VvSOD基因定位在7條染色體上，2號、8號、10號、13號和16號染色體上各有1個(gè)基因，6號染色體上有2個(gè)基因，14號染色體上基因分布最多，有5個(gè)基因，占黑比諾葡萄SOD總基因數(shù)的41.67%。河岸葡萄、圓葉葡萄和黑比諾葡萄SOD基因均在14號染色體上基因分布最多。為了進(jìn)一步了解基因家族的進(jìn)化關(guān)系，本研究使用TBtools的MCScanX工具進(jìn)行了種內(nèi)共線性分析（圖3）。圓葉葡萄VmSOD家族基因有6對共線性關(guān)系，位于2號染色體、6號染色體、13號染色體、14號染色體和16號染色體上，分別是VmSOD1/VmSOD3、VmSOD2/VmSOD6、VmSOD3/VmSOD9、VmSOD7/VmSOD8、VmSOD7/VmSOD9和VmSOD6/VmSOD10，其中VmSOD3、VmSOD6、VmSOD7和VmSOD9有2個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，這些結(jié)果表明部分VmSOD基因可能是通過基因重復(fù)產(chǎn)生的，它們可能具有相似的功能;黑比諾葡萄VvSOD家族基因有1對共線性關(guān)系，位于染色體14上，為VvSOD7/VvSOD11;山葡萄VaSOD家族基因有1對共線性關(guān)系，位于6號染色體和13號染色體上，為VaSOD2/VaSOD5;河岸葡萄VrSOD家族基因有1對共線性關(guān)系，位于6號染色體和13號染色體上，為VrSOD3/VrSOD7。

2.4" 葡萄SOD家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序motif分析

葡萄SOD基因共分為3個(gè)亞族，各亞族間的motif差異較大（圖4）。第Ⅰ亞族有24個(gè)基因，大部分基因N端是motif9，C端是motif2，除了VvSOD1、VrSOD1、VmSOD1不含motif 1和motif 2，其他均含有motif 1和motif 2，且第Ⅰ亞族中13個(gè)基因含有motif 1、motif 2、motif 3和motif 9，占該組所有成員的54.17%;5個(gè)基因含有motif 1、motif 2、motif3和motif 4。第Ⅱ亞族僅有3個(gè)基因，且僅含有motif 1、motif 3。第Ⅲ亞族motif的數(shù)量和種類較多，共含有7種基序，分別是motif 2、motif 4、motif 5、motif 6、motif 7、motif 8、motif 10，其中VmSOD10、VaSOD7、VrSOD14、VrSOD15、VvSOD12和VaSOD8的motif結(jié)構(gòu)相似。在同一亞族中基因motif的種類和數(shù)量相似，但同一亞族不同分支間motif的種類和數(shù)量有差異?？傊?種葡萄SOD基因中堿基序列相對保守，基序種類、數(shù)量和分布差異較小。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分析，第Ⅰ亞族中12基因不含非翻譯區(qū)，內(nèi)含子數(shù)量為4～7個(gè);VvSOD1、VrSOD1和VmSOD1含有4個(gè)內(nèi)含子，且VvSOD1和VmSOD1具有相似的內(nèi)含子分布和長度，大多數(shù)基因含有7個(gè)內(nèi)含子，VvSOD10編碼序列長度最長。第Ⅱ亞族中的3個(gè)基因都不含非翻譯區(qū)，內(nèi)含子數(shù)量2～4個(gè)，其中VrSOD9含有4個(gè)內(nèi)含子，且堿基序列在該亞族中長度最長。第Ⅲ亞族中僅有5個(gè)基因含有非翻譯區(qū)，除VmSOD2不含內(nèi)含子，其他均含有5個(gè)以上內(nèi)含子，其中VaSOD8含有11個(gè)內(nèi)含子。結(jié)果表明，同一亞家族不同基因之間的基因結(jié)構(gòu)相似，但并不完全相同，這可能是由于 SOD基因功能的多樣性以及在進(jìn)化過程中發(fā)生了變異。

2.5" 葡萄SOD基因順式作用元件

為了進(jìn)一步明確葡萄SOD家族基因的潛在功能，本研究分析了上游2 kb區(qū)域的順式作用元件（圖5）。結(jié)果表明，VmSOD、VrSOD、VvSOD和VaSOD均含有4種順式作用元件，包括光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件以及生長發(fā)育相關(guān)元件。多數(shù)基因含有ABA響應(yīng)元件，其中VvSOD6、VvSOD10、VaSOD7、VmSOD6和VaSOD5居多，VvSOD6和VvSOD10含有5個(gè)，VmSOD6和VaSOD5含有6個(gè)，VaSOD7含有7個(gè)。在山葡萄中，VaSOD含有較多的ABA和赤霉素（GA）響應(yīng)元件，在河岸葡萄、黑比諾和圓葉葡萄中生長素、赤霉素和水楊酸響應(yīng)元件相對較少。防御和脅迫響應(yīng)元件包括低溫、干旱、厭氧誘導(dǎo)等，除VaSOD6、VvSOD8、VmSOD10和VrSOD3不含厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件外，其他均含有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件，其中VrSOD8最多，數(shù)量為4個(gè)，推測SOD在厭氧誘導(dǎo)中起著重要的調(diào)控作用。綜上，4種葡萄SOD家族基因不僅可以進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄活動，還可以參與光響應(yīng)、激素響應(yīng)、應(yīng)激響應(yīng)和生長發(fā)育。

2.6" 葡萄SOD家族基因的密碼子偏好性

為了解SOD基因在植物中的進(jìn)化情況，本研究系統(tǒng)分析了SOD家族基因在4種葡萄中相對同義密碼子的使用頻率（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4種葡萄的SOD家族基因中，UUC、CUU、AUG、AUU、GUU、UCU、UCC、CCU、ACU、GCU、UGA、CAU、CAG、AAU、GAU、AGA、AGG、GGU和GGA等19個(gè)密碼子的同義密碼子相對使用度（RSCU）≥1，其中11個(gè)密碼子以U結(jié)尾，3個(gè)密碼子以A結(jié)尾，3個(gè)密碼子以G結(jié)尾，2個(gè)密碼子以C結(jié)尾，這表明葡萄SOD基因中密碼子第3個(gè)堿基更傾向于U。此外，CUU和AGA在4種葡萄SOD基因中均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的偏好性，GAU在河岸葡萄SOD基因中的偏好性最強(qiáng)（圖6a）。根據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，葡萄SOD家族基因密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）、密碼子偏好性指數(shù)（CBI）和最優(yōu)密碼子使用頻率（Fop）的平均值分別為0.212 5、-0.012 5和0.412 5。4種葡萄SOD基因的G+C含量和同義密碼子第3位堿基中G+C含量（GC3s）均小于0.5，說明葡萄SOD基因不偏好于使用G、C堿基;葡萄SOD家族基因的有效密碼子數(shù)目（Nc）值在50.06～52.45，平均值為51.405 0，說明在該家族基因中每個(gè)密碼子都被平均使用（圖6b）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT- PCR）結(jié)果表明，VaSOD家族基因在NaCl、ABA、SA和低溫誘導(dǎo)下，不同基因?qū)Σ煌巧锩{迫響應(yīng)表達(dá)模式有差異（圖7）。NaCl處理下，除VaSOD3的相對表達(dá)量隨處理時(shí)間（3～48 h處理期間）的增加逐漸下降外，其他基因表達(dá)量隨處理時(shí)間的增加波動較大，VaSOD2在48 h時(shí)達(dá)到高峰，其表達(dá)量是對照（對照為1）的7.94倍。在ABA處理下，VaSOD6的相對表達(dá)量隨處理時(shí)間的增加而增加，VaSOD4在48 h時(shí)達(dá)到高峰，表達(dá)量是對照的9.57倍，VaSOD6在48 h時(shí)達(dá)到高峰，表達(dá)量是對照的7.24倍。SA處理下，VaSOD2的相對表達(dá)量在0～24 h隨處理時(shí)間的增加呈上調(diào)表達(dá)，且在24 h時(shí)達(dá)到高峰，VaSOD6在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)最高值，是對照的4.51倍。在4 ℃低溫處理下，VaSOD4和VaSOD6的相對表達(dá)量在48 h時(shí)達(dá)到峰值，其表達(dá)量分別是對照的6.87倍和8.12倍。qRT-PCR結(jié)果表明，鹽脅迫、2種激素和低溫脅迫均能誘導(dǎo)葡萄SOD基因不同程度表達(dá)，且VaSOD2、VaSOD4、VaSOD6多在處理48 h時(shí)達(dá)到峰值。

3" 討論

超氧化物歧化酶（SOD）是植物抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，可有效保護(hù)細(xì)胞和機(jī)體本身，增強(qiáng)植物在逆境脅迫下的耐受能力。本研究對4種葡萄SOD基因的全基因組、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、染色體定位、共線性、密碼子使用偏好、順式作用元件和表達(dá)模式進(jìn)行了綜合分析，從歐洲葡萄黑比諾葡萄中鑒定出12個(gè)SOD基因，從山葡萄中鑒定出8個(gè)SOD基因，從河岸葡萄中鑒定出15個(gè)SOD基因，從圓葉葡萄中鑒定出10個(gè)SOD基因。從前人研究結(jié)果可知，目前在毛竹中發(fā)現(xiàn)7個(gè)SOD基因，番茄中9個(gè)，谷子中8個(gè)，水稻中9個(gè)，大豆中13個(gè)，辣椒中15個(gè)，油菜中32個(gè)，由此可見，在不同物種中SOD基因數(shù)目存在較大差異。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，4種葡萄SOD基因編碼的蛋白質(zhì)大部分為酸性蛋白質(zhì)，只有13個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)為堿性蛋白質(zhì)，大部分基因編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)，在植物中功能保持相對穩(wěn)定，這與郭棟等對油菜SOD家族基因生物信息學(xué)分析的結(jié)果相一致。4種葡萄不同基因的染色體定位及其編碼的蛋白質(zhì)長度、相對分子量、等電點(diǎn)、親水性等特征均有差異，但蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)均以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，無β-折疊;亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明4種葡萄SOD基因編碼的蛋白質(zhì)主要定位于葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，這與綠豆SOD家族基因編碼的蛋白質(zhì)主要定位在葉綠體中的結(jié)果相似，也為葡萄SOD酶生物學(xué)功能的研究提供了基礎(chǔ)信息。

4種葡萄SOD基因保守性較強(qiáng)，在進(jìn)化中沒有太大的分化，且與水稻和番茄的親緣關(guān)系較近。據(jù)此推測，這3個(gè)物種的SOD家族基因并沒有發(fā)生太大的分化，而是相對保守的。在保守基序分析中發(fā)現(xiàn)4種葡萄的基序存在一些差異，因此推測該家族基因在進(jìn)化過程中存在一定的變異。基因復(fù)制在生物進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要作用，包括串聯(lián)復(fù)制、局部復(fù)制和全基因組復(fù)制。本研究中SOD基因染色體定位結(jié)果顯示，不同葡萄SOD基因在染色體上的分布大多呈兩端分布，并且一些基因在染色體上形成基因簇，根據(jù)位置及序列信息，推測它們是串聯(lián)重復(fù)基因。種內(nèi)共線性分析結(jié)果顯示，黑比諾葡萄、山葡萄和河岸葡萄分別僅有1對基因?yàn)楣簿€性關(guān)系，而圓葉葡萄中有6對基因?yàn)楣簿€性關(guān)系，由此推測串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)是葡萄SOD基因家族成員數(shù)量擴(kuò)增的主要方式。

當(dāng)植物遭受干旱、高溫、低溫、鹽堿等外界非生物脅迫時(shí)，脅迫信號會通過轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制整合到信號因子中，并激活相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，加上相應(yīng)的順式作用元件啟動相應(yīng)的基因表達(dá)和對脅迫的反應(yīng)。例如，ABA響應(yīng)元件（ABREs）可以響應(yīng)ABA、干旱和鹽脅迫;LTR參與低溫響應(yīng)和調(diào)控;MYB可以響應(yīng)各種應(yīng)激信號和應(yīng)激調(diào)控，調(diào)控相應(yīng)基因。本研究分析了葡萄45個(gè)SOD 基因的上游2 kb順式作用元件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VmSOD、VrSOD、VvSOD和VaSOD均含有光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件、生長發(fā)育相關(guān)元件，這表明葡萄SOD家族基因?qū)χ参锷L發(fā)育有顯著調(diào)控作用。其中，光響應(yīng)元件、ABA響應(yīng)元件和生長素響應(yīng)元件在SOD基因的作用元件中占很大比例，已有研究結(jié)果表明在3種薔薇科植物中SOD酶活性與激素及光響應(yīng)密切相關(guān)，由此推測葡萄中SOD酶活性與ABA、SA及光響應(yīng)密切相關(guān)。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可見，位于同一分支上的基因其保守基序和順式作用元件的種類和數(shù)量相似，如分布于第Ⅴ亞族同一個(gè)分支的4種葡萄SOD基因均含有motif 1，且大都包含厭氧響應(yīng)元件和ABA響應(yīng)元件，推測這些基因可能作為正調(diào)控因子參與了ABA信號響應(yīng);已有研究結(jié)果表明位于同一亞族的基因，由于基因結(jié)構(gòu)和保守基序相似，在功能方面也具有相似性，因此推測和VaSOD3在同一分支的VrSOD4、VvSOD4、VmSOD5可能也參與ABA信號響應(yīng);分布于第Ⅳ亞族同一分支的3個(gè)葡萄SOD成員均含有motif 3、motif 6、motif 10，且都包含4個(gè)MeJA響應(yīng)元件、2個(gè)ABA響應(yīng)元件、1個(gè)SA響應(yīng)元件和3個(gè)厭氧響應(yīng)元件，推測這些基因可能作為正調(diào)控因子參與了ABA、MeJA和SA信號響應(yīng);在ABA脅迫下，只有VaSOD7表達(dá)受到抑制（5個(gè)ABA脅迫時(shí)間下VaSOD7相對表達(dá)量均小于1），推測VaSOD7是ABA信號和非生物脅迫的負(fù)調(diào)控基因。

密碼子使用偏好性分析也有助于理解進(jìn)化關(guān)系。本研究通過對8個(gè)山葡萄、12個(gè)黑比諾葡萄、15個(gè)河岸葡萄和10個(gè)圓葉葡萄SOD家族基因的密碼子使用偏好性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，CUU和AGA在4種葡萄SOD基因中均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的偏好性，而GAU在河岸葡萄SOD基因中的偏好性最強(qiáng)，且4種葡萄在密碼子使用上不同基因間存在差異，不偏好于使用G、C堿基。密碼子偏好性的研究可為葡萄轉(zhuǎn)基因和密碼子優(yōu)化提供理論支持。

4" 結(jié)論

本研究鑒定到45個(gè)葡萄SOD家族基因，并對這些基因的結(jié)構(gòu)和motif、順式作用元件、系統(tǒng)發(fā)育樹、染色體定位、密碼子偏好性、共線性及編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)等進(jìn)行了詳細(xì)分析。其中保守基序分析結(jié)果表明，4種葡萄SOD家族基因在進(jìn)化過程中具有較高的保守性，此外，VaSOD2、VaSOD4、VaSOD6在ABA、SA、NaCl、低溫等逆境脅迫應(yīng)答過程中具有重要功能?？傊?，本研究結(jié)果豐富和深化了對葡萄SOD家族基因的認(rèn)識，為進(jìn)一步研究葡萄SOD基因在非生物脅迫下的抗性機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）