狹葉薰衣草葉片愈傷組織和懸浮細胞組織培養(yǎng)及其代謝物差異

摘要：" 為明確狹葉薰衣草（Lavandula angustifolia Mill.）葉片產(chǎn)生活性代謝物的能力，本研究以狹葉薰衣草無菌苗葉片為外植體，建立無菌苗葉片愈傷組織和懸浮細胞培養(yǎng)體系，利用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜儀（UHPLC-Q-TOF-MS）對愈傷組織和懸浮細胞的代謝物進行表征，并分析差異代謝物的代謝通路，比較代謝物對ABTS（2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基的清除能力。結果表明，狹葉薰衣草種子在培養(yǎng)30 d后即可得到無菌苗，愈傷組織和懸浮細胞在培養(yǎng)8 d后，生長量可提升7倍以上。愈傷組織和懸浮細胞中共檢測出1 403種代謝物，包括迷迭香酸、齊墩果酸、咖啡酸甲酯等薰衣草特色活性物質和未報道過的人參皂苷F3、積雪草酸、羥基積雪草酸、刺囊酸等活性物質。從1 403種代謝物中篩選得到218種差異顯著性代謝物，包括49種生物活性物質。愈傷組織和懸浮細胞表現(xiàn)出不同的代謝物合成能力，愈傷組織偏向于酚酸類化合物的合成而懸浮細胞偏向于萜類化合物的合成。差異代謝通路主要富集于代謝途徑（Metabolic pathways）和核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）通路。愈傷組織和懸浮細胞乙醇提取物均具有較高的ABTS自由基清除能力，半清除質量濃度（IC50）分別為0.50 mg/mL和0.49 mg/mL。因此，利用狹葉薰衣草無菌苗葉片作為外植體，利用不同的組織培養(yǎng)方式，可以得到多樣化的次生代謝產(chǎn)物。本研究結果為狹葉薰衣草葉片愈傷組織和懸浮細胞組織培養(yǎng)及其代謝物提取提供了依據(jù)。

關鍵詞：" 狹葉薰衣草；組織培養(yǎng)；愈傷組織；懸浮細胞；次生代謝物；代謝組學

中圖分類號：" Q942.6""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2356-11

收稿日期：2024-04-15

基金項目：江蘇省自然科學基金青年項目（BK20221069）

作者簡介：周笑如（1999-），女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向為植物組織培養(yǎng)及活性成分研究。（E-mail）xiaoru0901@163.com

通訊作者：劉" 學，（E-mail）xueliu@jiangnan.edu.cn

周笑如，周昱成，劉" 學，等. 狹葉薰衣草葉片愈傷組織和懸浮細胞組織培養(yǎng)及其代謝物差異［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2024，40（12）：2356-2366.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.019

Leaf callus and suspension cell tissue culture of Lavandula angustata Mill. and their metabolite differences

ZHOU Xiaoru，" ZHOU Yucheng，" LIU Xue，" LIU Chunhuan，" YANG Cheng

（School of Chemical and Material Engineering， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

Abstract：" In order to clarify the ability of Lavandula angustifolia Mill. leaves to produce bioactive metabolites， the sterile seedlings of L. angustifolia were used as explants to establish the culture system of callus and suspension cells of sterile seedling leaves. The metabolites of callus and suspension cells were characterized by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry （UHPLC-Q-TOF-MS）， and the metabolic pathways of differential metabolites were analyzed. The scavenging ability of metabolites to ABTS （2，2′-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） free radicals was compared. The results showed that the aseptic seedlings could be obtained after 30 days of culture， and the growth of callus and suspension cells could be increased by more than seven times after eight days of culture. A total of 1 403 metabolites were detected in callus and suspension cells， including rosmarinic acid， oleanolic acid， caffeic acid methyl ester and other characteristic active substances of lavender and unreported ginsenoside F3， asiatic acid， hydroxyasiatic acid， echinocystic acid and other active substances. A total of 218 significantly different metabolites were screened from 1 403 metabolites， including 49 bioactive substances. Callus and suspension cells showed different ability to synthesize metabolites. Callus preferred the synthesis of phenolic acids， while suspension cells preferred the synthesis of terpenoids. The differential metabolic pathways were mainly enriched in Metabolic pathways and Nucleotide metabolism pathways. The ethanol extracts of callus and suspension cells had high ABTS free radical scavenging ability， and the half scavenging mass concentration （IC50） was 0.50 mg/mL and 0.49 mg/mL， respectively. Therefore， using the leaves of Lavandula angustata aseptic seedlings as explants， using different tissue culture methods， a variety of secondary metabolites can be obtained. The results of this study can provide a basis for callus and suspension cell tissue culture and metabolite extraction of Lavender angustifolia leaves.

Key words：" Lavandula angustifolia Mill.;tissue culture;callus;suspension cell;secondary metabolites;metabolomics

狹葉薰衣草（Lavandula angustifolia Mill.）是唇形科薰衣草屬植物，原產(chǎn)于地中海一帶。中國的狹葉薰衣草種植主要集中在新疆自治區(qū)。狹葉薰衣草富含黃酮類、酚類等次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化和消炎等功能，其揮發(fā)油具有芳香味，可緩解焦慮和治療失眠癥，因此，狹葉薰衣草被廣泛應用于食品、藥品和化妝品生產(chǎn)中。目前，對狹葉薰衣草的開發(fā)利用多集中于花、穗等器官，而對莖、葉的利用較少，造成了資源的浪費。

植物組織培養(yǎng)技術以“植物細胞具有全能性”為理論基礎，可以克服自然環(huán)境對植物生長的限制，并促進植物中活性成分的生物合成。對薰衣草的組織培養(yǎng)和代謝物成分研究已有一些報道。楊鑫等比較了薰衣草無菌苗和自然生長植株中的揮發(fā)性成分差異，初步揭示了培養(yǎng)方式對薰衣草成分的影響。許耀祖等以孟斯泰德薰衣草葉片為材料，建立了薰衣草葉片懸浮細胞培養(yǎng)體系，奠定了薰衣草細胞培養(yǎng)技術的基礎。Kovatcheva等和Pavlov等從狹葉薰衣草葉片懸浮細胞中提取得到迷迭香酸，開拓了薰衣草細胞的應用潛力。但上述研究中對薰衣草不同細胞培養(yǎng)方式的代謝物差異及其形成機制仍缺乏深入分析。此外，由于植物代謝物種類繁雜，傳統(tǒng)的檢測方法難以進行全面分析。近年來發(fā)展起來的代謝組學技術為植物體代謝物的全面分析、不同生長環(huán)境下植物差異代謝物挖掘及代謝通路的揭示提供了新的手段。

基于狹葉薰衣草不同細胞培養(yǎng)方式的代謝物差異及其形成機制缺乏研究的現(xiàn)狀，本研究在狹葉薰衣草無菌苗培養(yǎng)的基礎上，以無菌苗葉片為外植體，建立其愈傷組織和懸浮細胞的培養(yǎng)體系，并利用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜聯(lián)用儀（UHPLC-Q-TOF-MS）對培養(yǎng)得到的愈傷組織、懸浮細胞進行代謝物鑒定，明確其差異代謝物及代謝通路，為利用植物組培技術進行狹葉薰衣草葉片天然活性物質的提取和細胞次生代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控奠定基礎。

1" 材料與方法

1.1" 材料來源

狹葉薰衣草種子購于宿遷山丘園藝有限公司，MS培養(yǎng)基（pH為5.85～5.88）購于青島海博生物技術有限公司。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 愈傷組織及懸浮細胞培養(yǎng)基配制" 愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)基：分別稱取2.0 mg 6-芐氨基嘌呤（6-BA）、0.5 mg 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、30.0 g蔗糖及7.0 g瓊脂，利用MS培養(yǎng)基定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)混合液pH至5.85～5.88得到。懸浮細胞培養(yǎng)基：分別稱取2.0 mg 6-BA、0.5 mg 2，4-D和30.0 g蔗糖，利用MS培養(yǎng)基定容至1 000 mL，并調(diào)節(jié)混合液pH至5.85～5.88得到。配好的培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻備用。

1.2.2" 無菌苗培養(yǎng)" 10 g狹葉薰衣草種子用0.04%赤霉素浸種10 h后取出，利用無菌水清洗3次，在超凈工作臺中將清洗后的狹葉薰衣草種子用3% 次氯酸鈉（NaClO）溶液浸泡消毒5 min，然后利用無菌水沖洗3～5次，再用無菌槍頭吸取狹葉薰衣草種子點播到MS培養(yǎng)基上，在恒溫25 ℃、光周期16 h/d的條件下培養(yǎng)30 d，得到狹葉薰衣草無菌苗。

1.2.3" 愈傷組織的誘導及繼代培養(yǎng)

愈傷組織誘導：在超凈工作臺中，將狹葉薰衣草無菌苗葉片切成3～5 mm長的小塊，以狹葉薰衣草無菌苗葉片小塊為外植體，接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，在恒溫25 ℃、光周期16 h/d的條件下培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計長出愈傷組織的外植體數(shù)，得到外植體的出愈率。

出愈率=（長出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100%（1）

愈傷組織形態(tài)觀察及繼代培養(yǎng)：采用徒手制片的方法，利用0.9%生理鹽水配制的0.2%亞甲基藍溶液將愈傷組織染色后，再利用Leica DM500正置顯微鏡（德國Ernst Leitz Wetzlar GmbH公司產(chǎn)品）對不同形態(tài)的愈傷組織進行形態(tài)觀察。選取無明顯褐變的愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基中，每皿（培養(yǎng)皿尺寸100 mm×100 mm）接種1 g，在恒溫25 ℃、濕度50%±5%、光周期16 h/d的條件下培養(yǎng)，每7～10 d繼代1次，繼代培養(yǎng)至15代。

1.2.4" 懸浮培養(yǎng)體系的建立" 懸浮細胞培養(yǎng)：選取繼代培養(yǎng)3次以上的疏松愈傷組織接種于懸浮細胞培養(yǎng)基中，每皿接種量為1 g，置于搖床上100 r/min振蕩培養(yǎng)，每7 d用100 μm無菌篩網(wǎng)過濾后接種到新培養(yǎng)基中，過濾物在25 ℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，直至形成穩(wěn)定的懸浮細胞系，繼代培養(yǎng)至15代。

1.2.5" 細胞生長曲線及細胞生長活力曲線的繪制" 細胞生長曲線：愈傷組織接種后在超凈工作臺中每2 d取出培養(yǎng)皿中的愈傷組織進行稱重1次，共7次，建立愈傷組織細胞生長曲線；將懸浮細胞搖勻后用100 μm細胞濾網(wǎng)過濾，稱取濾渣的重量即為懸浮細胞鮮重，每2 d稱重1次，共7次，建立懸浮細胞生長曲線。

細胞生長活力檢測：采用TTC染色法，用UV-1800PC紫外分光光度儀（上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品）測得485 nm處的吸光度。每2 d檢測1次，共7次，以生長天數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制細胞生長活力曲線。

1.2.6" 愈傷組織和懸浮細胞差異代謝物及其代謝通路分析" 樣品制備：取愈傷組織和懸浮細胞各40 mg，分別加入體積比2∶2∶1的甲醇、乙腈、水混合溶液，利用漩渦混合器QT-1（上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品）渦旋混合，4 ℃低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，4 ℃離心20 min，取上清液真空干燥，然后加入100 μL體積分數(shù)50%的乙腈稀釋液，渦旋復溶，離心后取上清液用于質譜分析，每組樣品重復6次。

利用Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀及Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（1.7 μm×2.1 mm×100.0 mm）（美國Hamp;E公司產(chǎn)品）對愈傷組織和懸浮細胞離心上清液進行色譜分析。色譜條件為柱溫25 ℃，流速0.5 mL/min，進樣量2 μL；流動相A相為乙酸銨含量25 mmol/L、氨水含量25 mmol/L的混合溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序為0～0.50 min 95% B相，0.51～7.00 min 95%～65% B相，7.01～8.00 min 65%～40% B相，8.01～9.00 min 40% B相，9.01～9.10 min 40%～95% B相，9.11～12.00 min 95% B相。

利用Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480質譜儀，采用電噴霧電離（ESI）正離子模式和負離子模式對愈傷組織和懸浮細胞離心上清液進行質譜分析。ESI源條件為離子源溫度350 ℃，噴霧電壓（ISVF）為3 500 V（正離子模式）和2 800 V（負離子模式）。一級質荷比檢測范圍70～1 200，分辨率60 000，掃描累積時間100 ms。二級質荷比掃描范圍70～1 200，分辨率60 000，掃描累積時間100 ms，動態(tài)排除時間4 s。

原始質譜數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉換成mzXML格式，然后采用XMJS軟件進行峰對齊、保留時間校正和峰面積提取等處理，以一級質譜確定相對分子量，再用二級質譜碎片和同位素分布信息與中科新生命植物代謝物數(shù)據(jù)庫進行信息匹配，鑒定代謝物結構。

以主成分分析、正交偏最小二乘判別分析和t檢驗篩選出愈傷組織和懸浮細胞顯著性差異代謝物，并進行生物信息學分析。利用KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異顯著代謝物的代謝通路進行注釋和分析。

1.2.7" 代謝物對2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除能力比較" 將愈傷組織和懸浮細胞凍干處理后，分別取凍干懸浮細胞和愈傷組織10 mg，加入無水乙醇充分研磨，37 ℃超聲30 min，得到愈傷組織和懸浮細胞的乙醇提取液，將上述提取液用無水乙醇稀釋為質量濃度0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL稀釋液。

稱取6.6 mg過硫酸鉀定溶解于10 mL去離子水，配制成2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，然后稱取7.7 mg ABTS溶解于2 mL過硫酸鉀溶液，混合反應16 h后，用水將其稀釋為734 nm吸光度為0.7的ABTS工作液。在96孔板中加入50 μL不同質量濃度的稀釋液和150 μL ABTS工作液及50 μL無水乙醇和150 μL ABTS工作液，每處理3次重復。反應15 min后，分別測得不同質量濃度的稀釋液和無水乙醇734 nm處的吸光度，分別記為As和Ac。ABTS自由基清除率按下式計算：

ABTS自由基清除率= （1-As/Ac）×100%（2）

式中，As為稀釋液的吸光度；Ac無水乙醇的吸光度。

2" 結果與分析

2.1" 愈傷組織的誘導及繼代培養(yǎng)

狹葉薰衣草種子培養(yǎng)30 d即可獲得完整的狹葉薰衣草無菌苗，具有薰衣草芳香氣味。葉片片段為外植體進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，出愈率為76%，整體呈現(xiàn)灰白色。葉片愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中，細胞形態(tài)會呈現(xiàn)3種情況：綠色且質地堅硬不易分開的細胞團，記為“綠色堅硬”；白色且質地疏松、形態(tài)松散的細胞團，記為“白色疏松”；白色且質地軟爛、含水量較多的細胞團，記為“白色軟爛”（圖1）。將這3種細胞形態(tài)的細胞團經(jīng)過0.2%亞甲基藍染色后在顯微鏡下觀察可知，“綠色堅硬”細胞團的細胞團聚緊湊，不易分開；“白色疏松”細胞團的細胞結構松散，細胞分界明顯，多呈大小均一的圓形細胞；“白色軟爛”細胞團的細胞在視野內(nèi)多呈巨大圓形狀，細胞形態(tài)不均。因此，選取“白色疏松”細胞團的細胞作為繼代培養(yǎng)的材料，其細胞在形態(tài)上基本符合分生細胞增殖較快、形態(tài)均勻且等徑的特征。

葉片愈傷組織細胞生長曲線和細胞活力變化如圖2所示。從圖中可以看出，葉片愈傷組織生長呈“S”形特征，0～4.0 d細胞緩慢增長，4.1～10.0 d細胞快速增長，10.1～14.0 d細胞又緩慢增長。隨著時間變化，細胞活力呈先上升后下降的變化特征。0～4.0 d細胞活力增加，4.1～8.0 d細胞活力快速下降，8.1～14.0 d細胞活力緩慢下降，因而8.0 d為適宜的繼代培養(yǎng)時間。

2.2" 懸浮細胞生長曲線及細胞生長活力曲線特征

狹葉薰衣草葉片愈傷組織經(jīng)過3代以上懸浮培養(yǎng)后，細胞呈勻漿狀，顯微鏡下可觀察到細胞為小圓球狀，細胞分裂增殖旺盛（圖3）。狹葉薰衣草葉片懸浮細胞培養(yǎng)0～4.0 d緩慢生長，4.1～10.0 d生長迅速，10.1 d后生長速率變緩。細胞活力同樣呈先上升后下降的趨勢，在生長第6.0 d達到峰值，6.1～10.0 d細胞活力快速下降，10.1～14.0 d細胞活力緩慢下降，因此，懸浮細胞的最佳繼代時間為7.1～10.0 d（圖4）。

2.3" 愈傷組織和懸浮細胞中的代謝物

利用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜儀（UHPLC-Q-TOF-MS）從狹葉薰衣草愈傷組織（LC）和懸浮細胞（LS）提取液中共檢測到1 403種代謝物，其中正離子模式922種，負離子模式481種。常見種類代謝物統(tǒng)計結果如表1。脂類和類脂類化合物的含量高達21.60%，這與Topu等研究結果相一致。2種細胞培養(yǎng)物中均含有較為豐富的天然活性成分，狹葉薰衣草細胞培養(yǎng)物檢測到已報道的迷迭香酸、綠原酸、咖啡酸甲酯、牡荊素、齊墩果酸等薰衣草特征活性物，還檢測到未見報道過的人參皂苷F3、積雪草酸、羥基積雪草酸、刺囊酸等活性物質，說明狹葉薰衣草細胞培養(yǎng)物除了擁有與傳統(tǒng)植株相似的次生代謝物合成能力，還能合成更多種類的生物活性物，展現(xiàn)出合成次生代謝物的多樣性。

2.4" 愈傷組織和懸浮細胞中的差異代謝物

正、負離子模式下狹葉薰衣草愈傷組織（LC）和懸浮細胞（LS）鑒定中得到的代謝物主成分得分如圖5所示。從圖中可以看出，同組樣品聚集，說明組內(nèi)的重復性較好；不同組樣品分離，說明組間的差異較為顯著。

正、負離子模式下狹葉薰衣草愈傷組織（LC）和懸浮細胞（LS）代謝物的正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）結果如圖6所示。從圖中同樣可以看出，樣品具有組內(nèi)相對聚集、組間分離的特征。

基于OPLS-DA分析，可以得到各代謝物的VIP（變量重要性投影值）。以VIPgt;1和t檢驗的Plt;0.05為標準，共篩選得到218種愈傷組織（LC）和懸浮細胞（LS）的差異顯著性代謝物。其中，49種差異代謝物為生物活性物質（表2），包括4種黃酮類、23種酚酸類、14種萜類、4種生物堿類、3種醌類、1種芪類。差異倍數(shù)排名前20的差異代謝物繪制的蝴蝶圖如圖7所示。與愈傷組織（LC）相比，懸浮細胞（LS）代謝物中含量顯著上升（差異倍數(shù)＞1）的代謝物共有78種物質，主要為羥基積雪草酸、齊墩果酸等三萜類物質。差異倍數(shù)最高（32.75倍）的差異代謝物是齊墩果酸，一種五環(huán)三萜類化合物，主要存在于天然生長的薰衣草莖葉中，具有抗氧化和消炎等功效。其次為羥基積雪草酸，亦是五環(huán)三萜類化合物，對氧化應激和UVB輻射具有保護作用，還有促進傷口愈合、防止皮膚老化、消炎等功效。懸浮細胞（LS）代謝物中含量下調(diào)的物質共有140種，主要為咖啡酸、紫丁香苷等酚酸類化合物。以上結果說明，薰衣草細胞中天然活性物質種類豐富，且不同的細胞培養(yǎng)方式對薰衣草細胞中次生代謝物的合成調(diào)控存在差異。愈傷組織偏向于酚酸類化合物的合成，而懸浮細胞偏向于萜類化合物的合成。

除次生代謝物外，愈傷組織（LC）和懸浮細胞（LS）中蔗糖、木二糖等初生代謝物的含量亦有顯著差異。懸浮細胞中蔗糖含量比愈傷組織中高1 000倍以上，其原因可能是一方面懸浮細胞相較于愈傷組織更易于吸收培養(yǎng)基的蔗糖，并利用蔗糖產(chǎn)生更多能量進行細胞分裂和代謝物生產(chǎn)；另一方面，蔗糖作為一種滲透調(diào)節(jié)物質可以保衛(wèi)細胞，懸浮細胞為保持細胞在液體中的細胞形態(tài)，產(chǎn)生更高蔗糖濃度來維持細胞內(nèi)外的滲透壓。懸浮細胞中的高蔗糖含量一方面有利于淀粉、果聚糖、蛋白質等細胞所需化合物的合成，為細胞生長發(fā)育和逆境防御提供能量和關鍵碳源，另一方面，作為糖信號分子直接或間接參與到各類代謝途徑中調(diào)節(jié)植物對逆境脅迫的響應。懸浮細胞中木二糖含量比愈傷組織中高64倍以上，有利于細胞保持形態(tài)穩(wěn)定并抵抗外部環(huán)境的壓力。

2.5" 差異代謝物注釋

根據(jù)KEGG、HMDB等數(shù)據(jù)庫，愈傷組織（LC）與懸浮細胞（LS）差異代謝物注釋到203條代謝通路中。其中，差異顯著性最高的前20種代謝物的主要合成通路如圖8所示。從圖中可以看出，LC和LS差異顯著性最高的代謝通路為代謝途徑（Metabolic pathways）和核苷酸代謝通路（Nucleotide metabolism）。代謝途徑是酶介導的生化反應，可以通過糖酵解等代謝途徑產(chǎn)生各種重要的細胞分子前體，并引導細胞內(nèi)小分子天然產(chǎn)物的生物合成或分解代謝。除氨基酸、脫氧胸苷-5-磷酸（dTMP）等植物活動所需的物質在代謝途徑中得到注釋外，香橙素、阿魏酸、香草醇等次生代謝物也參與到代謝途徑中。愈傷組織（LC）與懸浮細胞（LS）中次生代謝物含量的差異表明，同種植物不同培養(yǎng)方式所得到的細胞對次生代謝產(chǎn)物具有不同的合成調(diào)控能力。2-脫氧肌苷-5-單磷酸、脫氧肌苷、dTMP、D-谷氨酰胺等富集到核苷酸代謝通路中。核苷酸作為構成核酸的基本單元，是植物新陳代謝和發(fā)育的重要化合物，除了作為細胞內(nèi)的信號分子參與植物的生理活動，還為細胞的防御系統(tǒng)提供能量，增強植物的抗病能力。懸浮細胞相較于愈傷組織，生長速度更快，需要更多的核酸合成原料為細胞分裂和生理活動提供能量，這可能是愈傷組織與懸浮細胞代謝物在核苷酸代謝通路中差異顯著的原因。

2.6" 愈傷組織與懸浮細胞對ABTS自由基的清除能力

狹葉薰衣草葉片愈傷組織和懸浮細胞乙醇提取液ABTS自由基清除率如圖9所示。從圖中可以看出，隨著愈傷組織和懸浮細胞乙醇提取液質量濃度升高，其對ABTS自由基清除率逐漸增強，說明愈傷組織和懸浮細胞均具有抗氧化活性。葉片愈傷組織和懸浮細胞對ABTS自由基的半清除質量濃度（IC50）分別為0.50 mg/mL、0.49 mg/mL，低于桂花果皮、人參莖葉等乙醇提取物的IC50，說明狹葉薰衣草葉片愈傷組織和懸浮細胞乙醇提取液比桂花果皮、人參莖葉乙醇提取液更具有市場潛力。

3" 結論

本研究通過植物組織培養(yǎng)技術，約30 d可以將狹葉薰衣草種子培養(yǎng)成無菌苗，在MS+6-BA 2 mg/L+

2，4-D 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，可將無菌苗葉片誘導培養(yǎng)成愈傷組織，并以形態(tài)疏松、呈胚性圓球狀的細胞作為材料，建立了懸浮細胞培養(yǎng)體系。愈傷組織和懸浮細胞的生長均符合Logistic生長模型，說明利用植物組織培養(yǎng)技術可以在較短時間內(nèi)獲得增殖速度快且生長穩(wěn)定的狹葉薰衣草細胞培養(yǎng)物。

愈傷組織和懸浮細胞代謝物中均檢測出豐富的生物活性物質，包括迷迭香酸、齊墩果酸、咖啡酸甲酯等已知薰衣草特征活性物，還在狹葉薰衣草葉片細胞培養(yǎng)物中檢測到未見報道的人參皂苷F3、積雪草酸、羥基積雪草酸、刺囊酸等活性物質，說明狹葉薰衣草細胞培養(yǎng)物除了擁有與傳統(tǒng)植株相似的次生代謝物合成能力，還能合成更多種類的生物活性物質，展現(xiàn)出更強的次生代謝物合成能力。愈傷組織和懸浮細胞合成次生代謝產(chǎn)物的能力也有所差異，前者合成酚酸類化合物（咖啡酸、紫丁香苷等）能力更強，而懸浮細胞合成萜類化合物（齊墩果酸、羥基積雪草酸等）的能力更強，因此，在后續(xù)的薰衣草應用中需要根據(jù)需求選擇合適的培養(yǎng)方式。除次生代謝物外，愈傷組織和懸浮細胞中蔗糖、木二糖等初生代謝物含量亦存在顯著差異，說明不同培養(yǎng)條件會影響葉片細胞生長及代謝過程。愈傷組織和懸浮細胞差異代謝物的KEGG通路主要富集于代謝途徑和核苷酸代謝通路，這說明不同的細胞培養(yǎng)方式對代謝物合成通路有影響。狹葉薰衣草葉片愈傷組織和懸浮細胞的乙醇提取物對ABTS自由基的半抑制濃度（IC50）分別為0.50 mg/mL和0.49 mg/mL，都表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，未來可通過合成調(diào)控、提取富集等手段進一步提高其活性，增強細胞培養(yǎng)物的應用潛力。

綜上，本研究以狹葉薰衣草葉片為外植體，建立了增殖穩(wěn)定的狹葉薰衣草愈傷組織和懸浮細胞培養(yǎng)體系，并分析了愈傷組織和懸浮細胞的差異代謝物及其代謝通路，拓展了狹葉薰衣草離體培養(yǎng)產(chǎn)物的應用潛力，為進一步的狹葉薰衣草葉片細胞組織培養(yǎng)體系次生代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用及合成調(diào)控奠定基礎。

參考文獻：

楊" 瑩，位" 凱，呂達平. 吸入薰衣草精油對原發(fā)性失眠癥患者的臨床療效. 中國醫(yī)藥導報，2016，13（24）：144-147.

陳莘雨，陳新梅. 薰衣草化學成分與藥理作用研究進展. 中華中醫(yī)藥雜志，2022，37（3）：1600-1604.

楊" 鑫，詹" 爽，彭盡暉，等. 狹葉薰衣草的離體培養(yǎng)及揮發(fā)性成分的分析. 熱帶亞熱帶植物學報，2020，28（1）：84-90.

許耀祖，王曉軍，趙民安，等. 薰衣草細胞懸浮培養(yǎng)體系的優(yōu)化. 細胞生物學雜志，2005，27（6）：701-704.

KOVATCHEVA E， PAVLOV A， KOLEVA I， et al. Rosmarinic acid from Lavandula vera MM cell culture. Phytochemistry，1996，43（6）：1243-1244.

PAVLOV A， ILIEVA M， MINCHEVA M. Release of rosmarinic acid by Lavandula vera MM cell suspension in two-phase culture systems. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2001，17（4）：417-421.

YULIANA N D， KHATIB A， CHOI Y H， et al. Metabolomics for bioactivity assessment of natural products. Phytotherapy Research，2011，25（2）：157-169.

TOPU G， HERRMANN G， KOLAK U， et al. Isolation of fatty acids and aromatics from cell suspension cultures of Lavandula angustifolia. Natural Product Research，2007，21（2）：100-105.

HRAL B， STIERLIN ， FERNANDEZ X， et al. Phytochemicals from the genus Lavandula：a review. Phytochemistry Reviews，2021，20（4）：751-771.

MOSHARI-NASIRKANDI A， ALIREZALU A， ALIPOUR H， et al. Screening of 20 species from Lamiaceae family based on phytochemical analysis，antioxidant activity and HPLC profiling. Scientific Reports，2023，13（1）：16987.

譚周倩，錢" 驊，黃曉德，等. 薰衣草莖葉中幾種有機酸的含量測定. 中國野生植物資源，2020，39（11）：34-38.

AYELESO T B， MATUMBA M G， MUKWEVHO E. Oleanolic acid and its derivatives：biological activities and therapeutic potential in chronic diseases. Molecules，2017，22（11）：1915.

TAN S C， BHATTAMISRA S K， CHELLAPPAN D K， et al. Actions and therapeutic potential of madecassoside and other major constituents of Centella asiatica：a review . Applied Sciences，2021，11（18）：8475.

LIMA V F， MEDEIROS D B， DOS ANJOS L， et al. Toward multifaceted roles of sucrose in the regulation of stomatal movement. Plant Signaling amp; Behavior，2018，13（8）：e1494468.

YOON J， CHO L H， TUN W， et al. Sucrose signaling in higher plants. Plant Science，2021，302：110703.

DEWANGAN B P， GUPTA A， SAH R K， et al. Xylobiose treatment triggers a defense-related response and alters cell wall composition. Plant Molecular Biology，2023，113 （6）：383-400.

WURTZEL E T， KUTCHAN T M. Plant metabolism，the diverse chemistry set of the future. Science，2016，353（6305）：1232-1236.

WANG C G， HUANG X E， LI Q， et al. Extracellular pyridine nucleotides trigger plant systemic immunity through a lectin receptor kinase/BAK1 complex . Nature Communications，2019，10（1）：4810.

WITTE C P， HERDE M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology，2020，182（1）：63-78.

劉" 剛，伍佩珂，蔣小妹，等. 桂花果皮醇提物的抑菌活性和抗氧化活性的研究. 四川師范大學學報（自然科學版），2018，41（5）：672-676.

金學俊，栗銘鴻，崔福順. 人參莖葉成分分析及提取物抗氧化活性研究. 食品科技，2018，43（9）：279-284.

（責任編輯：石春林）