不同培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間和處理方式對(duì)真菌處理小麥秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與瘤胃發(fā)酵效果的影響

王 欣， 王 慧， 田雨佳 ， 張學(xué)煒， 劉鼎闊， 胡鵬程， 魏勇躍

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 西青 300384；2.天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 西青 300383；3.天津市武清區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 武清 301700）

目前，玉米秸稈應(yīng)用廣泛，但小麥秸稈大多被浪費(fèi)，從營(yíng)養(yǎng)水平分析，二者差異不大，若能合理利用小麥秸稈，則能減輕環(huán)境壓力、解決人畜爭(zhēng)糧的矛盾。但是秸稈的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，植物細(xì)胞壁由纖維素嵌入交聯(lián)木質(zhì)素和半纖維素的無(wú)定形基質(zhì)中，一同構(gòu)建形成非水溶性的層狀結(jié)構(gòu)，阻礙酶和微生物的可及性（Chundawat 等，2011）。 研究發(fā)現(xiàn)真菌中的白腐真菌降解木質(zhì)素的能力較強(qiáng)， 且具有成本低、 對(duì)環(huán)境友好的特點(diǎn)， 因而被廣泛使用（Kainthola 等，2021；Tuyen 等，2012）。

霉菌毒素可通過(guò)多種方式進(jìn)入機(jī)體， 影響機(jī)體的新陳代謝及抑制免疫機(jī)能等構(gòu)成健康安全風(fēng)險(xiǎn)。 為得到與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或消化性有關(guān)的分子結(jié)構(gòu)信息，采用了傅立葉交換紅外光譜（FTIR）技術(shù)（Zhang 和Yu，2012）。 該技術(shù)消除了傳統(tǒng)方法中破壞分子結(jié)構(gòu)的弊端，可能是預(yù)測(cè)飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和降解特性的一種快速高效的方法。 小麥秸稈對(duì)反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值需要考慮在瘤胃中的發(fā)酵特性，因此采用體外試驗(yàn)?zāi)M瘤胃生理功能，探究小麥秸稈在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵效果。 本試驗(yàn)在課題組前期的研究基礎(chǔ)上（張曉紅等，2021），對(duì)小麥秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行探索， 旨在為秸稈的資源化利用及可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 小麥秸稈 從江蘇省連云港市采集小麥秸稈，粉碎至2 ～3 cm，制成風(fēng)干樣保存待用。

1.1.2 培養(yǎng)真菌 從廣東省微生物菌種保藏中心購(gòu)得Pleurotus eryngii（GDMCC 5.280）真菌，4 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原代菌種擴(kuò)繁 用接種鏟將原代真菌接種于斜面試管培養(yǎng)基，于25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待菌絲布滿斜面后，將其接種至培養(yǎng)基平板，于25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 Pleurotus eryngii 真菌定植培養(yǎng)基質(zhì) 將500 g 高粱、小麥煮沸20 ～30 min，過(guò)濾水分，于121 ℃高壓滅菌1 h。 將真菌菌絲分別接種至4 g高粱、8 g 小麥培養(yǎng)基中，25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，相對(duì)濕度為70%。

1.2.3 小麥秸稈預(yù)處理 將小麥秸稈預(yù)先用蒸餾水浸泡72 h，進(jìn)行后續(xù)預(yù)處理。 常規(guī)組：室溫下未對(duì)秸稈進(jìn)行任何預(yù)處理。 滅菌組： 稱取小麥秸稈200 g/瓶于培養(yǎng)瓶，121 ℃下高壓滅菌1 h。 微貯組： 小麥秸稈中加入1×105CFU/g 植物乳桿菌和布氏乳桿菌，1：1 混合，微貯5 d。

1.2.4Pleurotus eryngii真菌發(fā)酵試驗(yàn) 將包裹菌絲的培養(yǎng)基質(zhì)和小麥秸稈依次裝入培養(yǎng)瓶， 分別按照200 g 濕秸稈與4 g 高粱，200 g 濕秸稈與8 g小麥的比例混合均勻，保持溫度為25 ℃、濕度為70%。 培養(yǎng)5、8、11 周時(shí)分別采集樣品。 粉碎后過(guò)40 目分析篩待測(cè)，每個(gè)試樣設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 濕化學(xué)法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)指標(biāo) 依據(jù)美國(guó)官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定小麥秸稈的干物質(zhì)（DM）、粗灰分（Ash）和蛋白質(zhì)（CP）（Ensminger，2008）； 利用全自動(dòng)纖維分析儀（ANKOM A20000）測(cè)定粗纖維（CF）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）、木質(zhì)素、 半纖維素、 纖維素的含量， 測(cè)定依據(jù)Van Soest 方法進(jìn)行（Van Soest 等，1991）。

1.3.2 霉菌毒素的測(cè)定 利用PriboFastR 檢測(cè)試劑盒測(cè)定嘔吐毒素 （DON）、 黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、伏馬毒素（FB）的含量。

1.3.3 中紅外法測(cè)定分子結(jié)構(gòu) 使用傅立葉變換紅外光譜儀 （天津港東科技有限公司產(chǎn)FTIR-7600）采集樣品光譜圖，每個(gè)樣品平行掃描9 次，掃描波段為4000 ～800 cm-1， 掃描次數(shù)為64 次，并采集空白圖譜。 使用OMNIC 8.2 軟件分析。

總碳水化合物（TCHO）的基線區(qū)域在ca.1189 ～902 cm-1附近，結(jié)構(gòu)性碳水化合物（STCHO）的基線區(qū)域在ca.1482 ～1189 cm-1附近， 纖維性碳水化合物（CELC） 基線區(qū)域在ca.1282 ～1189 cm-1附近。

1.3.4 瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定 采用體外發(fā)酵技術(shù)，通過(guò)30 h 產(chǎn)氣量（GP30）、氨態(tài)氮（NH3-N）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA） 等發(fā)酵參數(shù)反映瘤胃內(nèi)環(huán)境， 進(jìn)一步分析真菌處理小麥秸稈后在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵效果。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、霉菌毒素含量及碳水化合物二級(jí)分子結(jié)構(gòu)試驗(yàn)采用SAS 9.4 的三因素MIXED 模型進(jìn)行LSD 檢驗(yàn)分析，瘤胃發(fā)酵參數(shù)采用SAS 9.4 的兩因素GLM 模型進(jìn)行Tukey 檢驗(yàn)分析。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 Pleurotus eryngii真菌處理小麥秸稈對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響 由表1 可知， 培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用對(duì)CP、ADL、 木質(zhì)素以及纖維素呈極顯著影響（P＜0.01），對(duì)Ash、ADF、CF 影響顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)基質(zhì)和處理方式的交互作用對(duì)木質(zhì)素有極顯著影響（P＜0.01）；培養(yǎng)時(shí)間和處理方式的交互作用對(duì)DM、Ash、NDF、ADF、ADL、 木質(zhì)素、半纖維素、纖維素均呈極顯著影響（P＜0.01）。培養(yǎng)基質(zhì)、 培養(yǎng)時(shí)間和處理方式三者的交互作用對(duì)CP 及木質(zhì)素呈極顯著影響（P＜0.01），對(duì)DM、NDF、ADF 和纖維素影響顯著（P＜0.05）。

表1 不同培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間及處理方式對(duì)小麥秸稈中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值含量的影響 %

培養(yǎng)基質(zhì)為小麥組的NDF、ADF、CF 和木質(zhì)素較高粱組分別降低了3.71%、4.32%、2.90%、18.45%，小麥作為培養(yǎng)基效果更優(yōu)；培養(yǎng)時(shí)間為11 周的DM、Ash、CP 高于8 周和5 周，而11 周的NDF 較5 周降低了5.06%； 處理方式對(duì)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)均呈極顯著影響 （P＜0.01）， 滅菌組在11 周時(shí)ADL 和木質(zhì)素的含量最低，相較于8 周分別降低了74.90%、31.16%， 而微貯組在8 周時(shí)NDF、ADF、CF 含量最低。綜上所述，滅菌組最適培養(yǎng)時(shí)間為11 周，微貯組最適培養(yǎng)時(shí)間為8 周。

2.2 Pleurotus eryngii 真菌處理小麥秸稈對(duì)霉菌毒素含量的影響 由表2 可知， 培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用對(duì)5 種霉菌毒素呈極顯著影響（P＜0.01）； 培養(yǎng)基質(zhì)和處理方式的交互作用對(duì)DON、ZEN、OTA 和FB 呈極顯著影響（P＜0.01），對(duì)AFB1影響顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)時(shí)間和處理方式二者的交互作用對(duì)DON、AFB1、ZEN 和FB 呈極顯著影響（P＜0.01），對(duì)OTA 影響顯著（P＜0.05）。 培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間和處理方式三者的交互作用對(duì)5 種霉菌毒素均呈極顯著影響（P＜0.01）。

表2 不同培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間及處理方式對(duì)小麥秸稈中霉菌毒素含量的影響

培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)DON、ZEN、FB 呈極顯著影響（P＜0.01），培養(yǎng)基質(zhì)為小麥組的ZEN、OTA、及FB 的含量較高粱組分別降低了13.85%、3.06%、10.50%；培養(yǎng)時(shí)間對(duì)5 種霉菌毒素均呈極顯著影響（P＜0.01），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AFB1、OTA和FB 的含量逐漸降低，ZEN 的含量逐漸遞增而DON 含量先增加后降低；處理方式對(duì)5 種霉菌毒素呈極顯著影響（P＜0.01）， 滅菌組和微貯組的DON 含量較常規(guī)組分別降低了36.51%、18.69%，OTA 含量分別降低了23.56%、20.51%，F(xiàn)B 含量分別降低了52.29%、31.06%，但所有處理組DON 和ZEN 含量均低于限量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3Pleurotus eryngii真菌處理小麥秸稈對(duì)二級(jí)分子結(jié)構(gòu)差異的影響 由表3 可知，不同培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間和處理方式對(duì)小麥秸稈碳水化合物二級(jí)分子結(jié)構(gòu)呈極顯著影響（P＜0.01）。除培養(yǎng)時(shí)間和處理方式二者的交互作用對(duì)CELCA 無(wú)顯著影響外，其他互作均對(duì)分子結(jié)構(gòu)存在顯著影響（P＜0.05）。

表3 不同培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間及處理方式對(duì)小麥秸稈碳水化合物二級(jí)分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)的影響

小麥組 TCHO1H、TCHO1A、TCHO3H、TCHO3A、STCHOH 顯著高于高粱組；滅菌組總碳水化合物第一亞峰和結(jié)構(gòu)性碳水化合物的峰高、峰面積高于微貯組，微貯組高于常規(guī)組，而總碳水化合物和纖維性碳水化合物的峰高、 峰面積滅菌組低于常規(guī)組和微貯組，可見(jiàn)滅菌組效果最好，其次是微貯組。

由表4 可知，DM 與TCHO3H、TCHO3A 呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與TCHO3A 的相關(guān)系數(shù)最低達(dá)到-0.725；Ash、CP 與TCHO3A 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；NDF 與TCHO1H、STCHOA 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與TCHO1A 呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）， 與TCHO1A 的相關(guān)系數(shù)最低達(dá)到-0.622；ADF 與TCHO1H、TCHO3A 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05）， 與 TCHO1A、TCHO3H、STCHOH、STCHOA 呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與STCHOH的相關(guān)系數(shù)最低達(dá)到-0.666；ADL 與TCHO1H、TCHO1A、STCHOA 呈極顯著負(fù)相關(guān) （P＜0.01），與TCHO1A 的相關(guān)系數(shù)最低達(dá)到-0.742； 木質(zhì)素與TCHO1H、TCHO1A、STCHOA 呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）， 與TCHO1A 的相關(guān)系數(shù)最低達(dá)到-0.674；半纖維素與CELCH、CELCA 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）， 與CELCA 的相關(guān)系數(shù)最高達(dá)到0.540； 纖維素與TCHO1H、TCHO1A、STCHOA 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與CELCA 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）， 與TCHO1A 的相關(guān)系數(shù)最高達(dá)到0.523。

表4 不同培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間及處理方式對(duì)小麥秸稈營(yíng)養(yǎng)組分與二級(jí)分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)的相關(guān)性

2.4Pleurotus eryngii真菌處理小麥秸稈對(duì)瘤胃體外發(fā)酵30 h 參數(shù)的影響 由表5 可知，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)VFA 和TVFA 呈極顯著影響 （P＜0.01），處理方式對(duì)瘤胃參數(shù)均呈極顯著影響（P＜0.01）；培養(yǎng)時(shí)間和處理方式的交互作用對(duì)VFA 和TVFA呈極顯著的影響（P＜0.01），對(duì)GP30影響顯著（P＜0.05）。 滅菌組的GP30顯著高于常規(guī)組和微貯組；pH 均在標(biāo)準(zhǔn)界限內(nèi)。 滅菌組與微貯組的NH3-N較常規(guī)組分別降低了44.86%和17.03%。 體外發(fā)酵30 h 時(shí)，常規(guī)組乙酸含量低于滅菌組低于微貯組； 滅菌組丙酸含量高于微貯組高于常規(guī)組；乙酸：丙酸在8 周的濃度顯著低于11 周顯著低于5周， 滅菌組顯著低于微貯組低于常規(guī)組 （P＜0.01）；微貯組TVFA 濃度顯著高于滅菌組和常規(guī)組（P＜0.01）。

表5 Pleurotus eryngii 真菌處理小麥秸稈對(duì)瘤胃發(fā)酵30 h 參數(shù)的影響

3 討論

3.1Pleurotus eryngii真菌處理小麥秸稈對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值含量及分子結(jié)構(gòu)特征的影響 本試驗(yàn)中小麥組的NDF、 木質(zhì)素低于高粱組， 且TCHO1H、TCHO1A、TCHO3H、TCHO3A、STCHOH 均顯著高于高粱組，從營(yíng)養(yǎng)組分和分子結(jié)構(gòu)參數(shù)水平表明，小麥作為培養(yǎng)基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于高粱， 隋春麗等（2022）表明，小麥能夠提取更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；微貯組中，小麥組8 周時(shí)木質(zhì)素最低，為4.61，此時(shí)纖維素含量最高，為39.69，較高的木質(zhì)素含量會(huì)使纖維素和半纖維素?zé)o法被微生物降解， 進(jìn)而降低可消化率（Abrahamsen 等，2021）；NDF、ADF 等纖維組分含量越高， 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和能量利用效率越低。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，滅菌組NDF、ADF、木質(zhì)素等纖維含量極顯著降低，CP 含量提高， 說(shuō)明通過(guò)處理可有效改善小麥秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 （Qutab ud din 和Macit，2020；劉紅菊，2018）。

3.2Pleurotus eryngii真菌處理小麥秸稈對(duì)霉菌毒素含量的影響 本試驗(yàn)表明， 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AFB1、OTA 和FB 的含量逐漸降低，Juodeikiene 等（2018）研究顯示，DON、T-2 和HT-2 毒素濃度降低， 表明在培養(yǎng)基質(zhì)中產(chǎn)生大量醋酸的LAB 菌株可降低麥芽顆粒中的霉菌毒素污染。 ZEN 含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，可能原因是初期利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)生ZEA，隨著霉菌數(shù)量的減少，ZEN 不斷積累，其含量逐步上升，這與王旭哲（2016）的研究結(jié)果相似。 本試驗(yàn)的樣品中均檢測(cè)到了霉菌毒素的含量，但并未發(fā)現(xiàn)霉變樣品，Manni 等（2022）也均在霉變和非霉變樣品中發(fā)現(xiàn)了霉菌毒素。 滅菌組中DON、OTA 和FB 含量低于微貯組和常規(guī)組， 說(shuō)明滅菌處理抑制了部分有害微生物的生長(zhǎng)。

3.3Pleurotus eryngii真菌處理小麥秸稈對(duì)營(yíng)養(yǎng)組分與二級(jí)分子結(jié)構(gòu)特征參數(shù)相關(guān)性分析 本試驗(yàn)中NDF、ADL 和木質(zhì)素與TCHO1H、TCHO1A、STCHOA 存在負(fù)相關(guān)。 Ji 等（2017）也表明，NDF 和ADF 均與TCHO1A 呈負(fù)相關(guān)。 ADF 與TCHO1H、TCHO1A、TCHO3H、TCHO3A、STCHOH、STCHOA呈負(fù)相關(guān)。 Chen 等 （2014） 研究顯示，ADF 與STCHOA、CELCA、TCHO1A、TCHO2A 和 TCHOA呈負(fù)相關(guān)。 NDF、ADL 與CELCH、CELCA 呈正相關(guān)，這與Zhang 和Yu（2012）的研究報(bào)道相似，說(shuō)明真菌處理能通過(guò)改變纖維素結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響秸稈纖維成分含量。 纖維素與CELCA 呈負(fù)相關(guān)，而半纖維素與CELCH、CELCA 呈正相關(guān)，Xin 和Yu（2013） 在研究蕓苔中得出，CHO 和CELC 峰強(qiáng)度的變化與試樣的碳水化合物化學(xué)組成二者緊密相關(guān)。 本試驗(yàn)進(jìn)一步論證，Pleurotus eryngii 真菌處理小麥秸稈可有效改善秸稈纖維素結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響纖維成分含量。

3.4Pleurotus eryngii真菌處理小麥秸稈對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 體外產(chǎn)氣法因其試驗(yàn)可控性、對(duì)大量基質(zhì)無(wú)損篩選的能力和相對(duì)較低的成本而被研究人員廣泛應(yīng)用。 瘤胃微生物的發(fā)酵產(chǎn)氣量與飼料降解率呈正相關(guān)，飼料可發(fā)酵程度越高，微生物活性越強(qiáng)，產(chǎn)氣量越多（Suntara 等，2020）。 本試驗(yàn)中，滅菌組的GP30最高；且GP30與NDF 呈負(fù)相關(guān)，表明飼料中NDF 含量高通常與DM 降解率降低有關(guān)， 從而與低GP30有關(guān) （Maccarana 等，2016）。 瘤胃微生物的活性、生長(zhǎng)繁殖均受pH 的影響，本試驗(yàn)pH 均在正常范圍。NH3-N 可反映飼料蛋白質(zhì)和氨基酸分解的程度（張玲等，2019）。本試驗(yàn)中，滅菌組的NH3-N 含量最低，微貯組低于常規(guī)組，李勝楠等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)、X 和FX 組青貯飼料的NH3-N／TN 顯著低于CK 組。

微貯組TVFA 的濃度顯著高于滅菌組和常規(guī)組，說(shuō)明消化率較高的底物，在發(fā)酵中瘤胃微生物更容易獲得可發(fā)酵碳水化合物， 從而產(chǎn)生較高的TVFA；Datsomor 等（2022）表明，平菇處理水稻秸稈后TVFA 增加， 而使用黃孢菌后導(dǎo)致TVFA 下降。 易于發(fā)酵的碳水化合物濃度更高，NDF 更低，這導(dǎo)致瘤胃中乙酸：丙酸更低（Daza 等，2019）。 本試驗(yàn)中，滅菌組的乙酸：丙酸最低，說(shuō)明滅菌組的瘤胃飼料效率最高。

4 結(jié)論

Pleurotus eryngii真菌在保證飼料安全性的前提下處理小麥秸稈，可有效改善樣品的纖維組分、更好的發(fā)揮出小麥秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值， 并能夠分解飼料原料中的蛋白質(zhì)和氨基酸， 同時(shí)將碳水化合物轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸為動(dòng)物提供能量。 綜合評(píng)價(jià)，以小麥作為培養(yǎng)基質(zhì)，滅菌組發(fā)酵培養(yǎng)11 周，微貯組培養(yǎng)8 周是最佳選擇。