補喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒腸道菌群的影響

鐘浩杰， 姚新奎，2，3 ， 孟 軍，2，3， 姚岳揚， 楊鈺瑤， 王川坤

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆馬繁育與運動生理重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆農(nóng)業(yè)大學馬產(chǎn)業(yè)研究院，新疆 烏魯木齊 830052；4.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，新疆 烏魯木齊 830052）

馬的胃腸道系統(tǒng)龐大而復(fù)雜， 包含多種不同的微生物（Julliand，2016；Dicks，2014），機體所需的大部分能量是通過微生物分解結(jié)構(gòu)性碳水化合物獲得（Julliand，1999）。 腸道菌群在營養(yǎng)消化、維持動物健康和生產(chǎn)性能方面起著至關(guān)重要的作用。 微生物群通常是指存在于胃腸中所有的微生物集合， 而微生物組成則是生物因素和非生物因素的統(tǒng)一， 包括微生物及其基因組（Marchesi，2015）。腸道菌群在馬屬動物的健康維持和疾病的病理生理學中扮演者重要的角色（Jassim，2009）。除了參與營養(yǎng)物質(zhì)的消化， 也在免疫功能中發(fā)揮一定的作用。 同時，與腸腦軸、動物行為（Cryan，2012）、 糖尿病和肥胖有關(guān)（Biddle，2018；Morrison，2018；Leyre，2006）。 盡管腸道內(nèi)的微生物群落具有明顯的重要性，但與其他動物物種相比，對馬腸道菌群的特征認識還遠遠不足。

近年來， 人們將微生物發(fā)酵技術(shù)廣泛應(yīng)用于飼料研究中以緩解我國優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料的供需矛盾。發(fā)酵豆粕在牛、羊、豬、雞以及水產(chǎn)等動物營養(yǎng)研究中取得了一定的研究成果， 但是鮮見其在馬匹上的研究報道。因此，本試驗旨在研究補喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒腸道菌群多樣性以及菌群結(jié)構(gòu)組成的影響， 以此探究發(fā)酵豆粕在伊犁馬駒專用飼料中的應(yīng)用效果， 為伊犁馬駒專用飼料研發(fā)以及消化系統(tǒng)健康提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設(shè)計 本試驗于2021 年5 月至10 月在新疆昌吉良源農(nóng)牧業(yè)發(fā)展有限公司馬場進行，選取15 匹體況相近、無消化系統(tǒng)疾病病史的12 月齡伊犁馬駒，隨機分為3 組，每組5 匹馬。對照組、 試驗I 組和試驗II 組分別在干草和普通精飼料的基礎(chǔ)上添加5%的普通豆粕、2.5%普通豆粕+2.5%發(fā)酵豆粕和5%的發(fā)酵豆粕。 分別飼于不同圈舍，預(yù)飼7 d，試驗期為56 d，整個試驗過程中， 所有馬均為舍飼， 墊料選取清潔干燥的木屑，每天分3 次給料，自由飲水和舔食舔磚。

1.2 基礎(chǔ)飼料 試驗所用發(fā)酵豆粕由新疆酵博仕生物科技有限公司生產(chǎn)，菌種為植物乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母等。 試驗過程中，所有試驗馬匹每天飼喂干草1.5 kg/100 kg 體重，每天按照每匹馬駒體重的1%飼喂精飼料。 精飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗樣品采集 分別于試驗第0 天和56 天無菌采集所有試驗馬匹直腸糞便， 所有用于腸道菌群多樣性分析的樣品均收集在無菌的5 mL 凍存管中，樣品立即放入液氮中儲存，直到DNA 提取和微生物測序。

1.4 糞便樣品16S rRNA 高通量測序 首先提取腸道菌群總DNA 并擴增， 然后對PCR 產(chǎn)物定量和混樣以及文庫的構(gòu)建，最后上機測序。測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計與分析 用Excel 2019 對數(shù)據(jù)進行整理；用SPSS 26.0 軟件對Alpha 多樣性和分類學組成進行分析； 對照組、 試驗I 組和試驗II 各組間Alpha 多樣性指數(shù)以及門、科、屬豐度采用單因素方差分析，并采用Duncan’s 法多重比較；試驗0 d和56 d 的Alpha 多樣性指數(shù)以及門、科、屬豐度比較采用獨立樣本t 檢驗；結(jié)果用平均值表示。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果與Alpha 多樣性分析 由表2 可知， 試驗0 d 和56 d 的30 個樣品共獲得有效序列2672029 條和32234 個ASVs。

試驗0 d 和56 d 的覆蓋率均超過96%，說明本試驗檢測到了96%以上的腸道細菌。 腸道菌群豐富度指數(shù)顯示，各組的超1 指數(shù)、觀察物種數(shù)和香濃指數(shù)在試驗第56 天較試驗第0 天均有所下降，其中對照組第56 天觀察到的物種數(shù)顯著低于第0 天（P＜0.05），試驗I 組第56 天的香濃指數(shù)顯著低于第0 天（P＜0.05）。

2.2 Beta 多樣性分析 圖1 為基于ASV 水平的PCoA 分析結(jié)果。試驗第0 天，PCo1 對檢測到的總細菌的代表性貢獻率為15.7%，PCo2 貢獻率為12.7%。 試驗第56 天，PCo1 貢獻率為16%，PCo2貢獻率為11.7%。 試驗第56 天的PCoA 分析結(jié)果顯示，對照組、試驗I 組和試驗II 組中的大部分個體能夠明顯的分開， 說明補喂發(fā)酵豆粕對馬駒腸道菌群組成具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

圖1 主坐標分析

2.3 物種組成分析

2.3.1 補喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒腸道菌群門水平豐度的影響 補喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒腸道菌群門水平多樣性結(jié)果如表3 所示， 基于門水平統(tǒng)計分析，得到相對豐度排名前10 的門，分別為厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門、變形菌門、疣微菌門、纖維桿菌門、放線菌門、TM7、柔壁菌門以及SR1。隨著馬駒日齡增加，對照組56 d 變形菌門豐度極顯著高于0 d（P＜0.01）；試驗I 組56 d 螺旋菌門豐度極顯著低于0 d （P＜0.01）； 試驗II 組56 d變形菌門豐度顯著高于0 d（P＜0.05），56 d 的放線菌門豐度顯著低于0 d（P＜0.05）。 隨著發(fā)酵豆粕添加量的增加， 各試驗組腸道菌群門水平豐度與對照組無顯著性差異。

表3 腸道菌群門水平豐度 %

2.3.2 補喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒腸道菌群科水平豐度的影響 由表4 可知，通過統(tǒng)計分析，得到豐度前10 的科，分別是毛螺旋菌科、瘤胃球菌科、普雷沃氏菌科、鏈球菌科、韋榮氏球菌科、艱難桿菌科、螺旋體科、梭菌科、BS11 和RFP12。隨著馬駒日齡增加， 對照組56 d 梭菌科豐度極顯著高于0 d（P＜0.01），56 d 的艱難桿菌科豐度顯著低于0 d（P＜0.05）； 試驗I 組56 d 鏈球菌科豐度極顯著高于0 d（P＜0.01），56 d 的毛螺旋菌科豐度顯著低于0 d （P＜0.05）。 隨著發(fā)酵豆粕添加量的增加，試驗56 d 時，試驗II 組瘤胃球菌科豐度顯著高于對照組（P＜0.05），試驗II 組鏈球菌科豐度顯著低于對照組（P＜0.05），試驗I 組艱難桿菌科顯著高于對照組（P＜0.05）。

表4 腸道菌群科水平豐度 %

2.3.3 補喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒腸道菌群屬水平豐度的影響 基于屬水平的伊犁馬駒腸道菌群結(jié)構(gòu)分析如由表5 所示。 隨著馬駒日齡增加，對照組56 d 梭菌屬豐度極顯著高于0 d（P＜0.01）；試驗I組56 d 鏈球菌屬豐度顯著高于0 d（P＜0.05），56 d的考拉菌屬豐度顯著低于0 d （P＜0.05），56 d 的密螺旋體屬豐度極顯著低于0 d（P＜0.01）；試驗II 組顫螺菌屬豐度顯著高于對照組（P＜0.05）。隨著發(fā)酵豆粕添加量的增加，試驗56 d 時，試驗II組鏈球菌屬豐度顯著低于對照組（P＜0.05），試驗II 組顫螺菌屬豐度極顯著高于對照組（P＜0.01）。

表5 腸道菌群屬水平豐度 %

3 討論

目前，發(fā)酵豆粕在牛、羊、豬、雞以及水產(chǎn)等動物營養(yǎng)研究中獲得了一定的研究成果。 黨文慶等（2020） 在研究不同含量發(fā)酵豆粕對斷奶仔豬糞便微生物的影響中發(fā)現(xiàn)，試驗組大腸桿菌豐度較對照組顯著降低（P＜0.05），10%和15%發(fā)酵豆粕添加組沙門氏菌數(shù)量分別顯著低于CK 和5%發(fā)酵豆粕添加組（P＜0.05）。張晨等（2018）在顆粒型TMR 日糧對育肥羊生產(chǎn)性能及其影響機制研究中發(fā)現(xiàn)，通過添加發(fā)酵豆粕和顆粒化處理相較于常規(guī)TMR 日糧組可以顯著提高瘤胃內(nèi)普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）的相對豐度。畢艷麗等（2021）研究發(fā)酵大豆粉對肉雞腸道菌群的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，發(fā)酵大豆粉2 組和發(fā)酵大豆粉3 組大腸桿菌較對照組分別降低20.24%和22.47%，差異顯著；發(fā)酵大豆粉2 組和發(fā)酵大豆粉3 組乳酸桿菌較對照組分別提高19.86%和22.87%。

非培養(yǎng)微生物鑒定方法和生物信息學的發(fā)展對馬腸道菌群的研究奠定了基礎(chǔ)， 促進了對微生物的基因組及其與環(huán)境之間相互作用規(guī)律的認識。 本試驗使用Illumina 高通量測序技術(shù)對試驗馬駒的糞便樣品進行測序，結(jié)果顯示，從15 匹伊犁馬駒的30 個糞便樣品中共檢測出2672029 條有效序列和32234 個ASVs，由于高通量測序技術(shù)的進步以及序列處理分析方法的改進， 測序結(jié)果相較前人的研究有了大幅的提高。

以干草為基礎(chǔ)飼料的馬中， 細菌群落表現(xiàn)出較高的豐富度和多樣性， 表明后腸微生物生態(tài)系統(tǒng)具有很強的恢復(fù)力。 而高淀粉飲食對后腸微生物種群有明顯的不良影響（Julliand，2017）。 本試驗56 d， 對照組觀察到的物種數(shù)和試驗I 組香濃指數(shù)均顯著低于0 d，56 d 各組其他多樣性和豐富度指數(shù)較0 d 均有所下調(diào)。 這一結(jié)果可能是由于馬駒飲食結(jié)構(gòu)的突然改變引起的，0 d 前的飲食主要以干草為主， 試驗開始后添加一定量的精飼料，導(dǎo)致淀粉的攝入量迅速升高。飲食結(jié)構(gòu)對馬腸道菌群的影響有待進一步研究。

本試驗從門、科、屬三個分類水平上對伊犁馬駒腸道菌群組成結(jié)構(gòu)進行了研究?；陂T水平統(tǒng)計分析，厚壁菌門和擬桿菌門是馬腸道菌群中的優(yōu)勢菌門，兩者豐度高達90%以上，這與前人的研究結(jié)果 一 致 （Hansen，2015；Moreau，2014；Dougal，2013）。試驗56 d 時各組腸道菌群門水平豐度均無顯著差異，可能由于試驗期間，12 月齡馬駒腸道菌群趨于穩(wěn)定，與成年馬接近，隨時間變化幅度不大，這與Costa（2016）研究結(jié)果基本一致。 變形菌門在腸道中的多樣性是由從環(huán)境中攝取的細菌驅(qū)動的，變形菌門始終在馬消化道（Ericsson，2016）的上部占主導(dǎo)地位，在馬回腸中豐度最高，為33%（Costa，2015）。變形菌門維持腸道菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是哺乳動物腸道健康的關(guān)鍵指標（Shin，2015）。 放線菌是一種條件致病菌，可引起腹瀉、腦膜炎、肺炎、化膿性腎炎或膿毒性多關(guān)節(jié)炎和敗血癥，表明其平衡對動物的健康至關(guān)重要（Layman，2014）。 本試驗II組56 d 的變形菌門豐度顯著高于0 d，56 d 放線菌門豐度較0 d 顯著降低， 表明添加5%的發(fā)酵豆粕能夠增加馬駒腸道菌群中變形菌門的豐度，降低放線菌門的豐度， 從而促進腸道菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，抑制腹瀉和炎癥的發(fā)生。 Fernando 等（2010）研究發(fā)現(xiàn)， 螺旋體門在纖維的發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用，飼料中可發(fā)酵碳水化合物作為細菌的主要能量來源，導(dǎo)致淀粉降解菌的增加， 與纖維降解菌直接競爭，引起螺旋體門和密螺旋體豐度降低。本試驗中螺旋體門和密螺旋體豐度降低與其基本一致。瘤胃球菌科屬于厚壁菌門，其豐度雖然只占細菌群落的一小部分，但被認為是整個馬后腸的“核心”。 瘤胃球菌參與植物細胞壁的降解，它們的缺失可能會影響微生物群的整體平衡（Julliand，2017）。 本試驗在56 d時試驗II 組瘤胃球菌科豐度顯著高于對照組，表明部補喂發(fā)酵豆粕能夠提高腸道菌群中瘤胃球菌科相對豐度，提升消化能力。 鏈球菌科屬于乳酸桿菌目， 包括一些產(chǎn)乳酸的細菌， 如鏈球菌（Fombelle，2001）。 研究發(fā)現(xiàn)，鏈球菌科是健康馬后腸生態(tài)系統(tǒng)中的主要細菌類群之一（Mshelia，2018；Steelman，2012），但是，鏈球菌的增殖與碳水化合物誘導(dǎo)的蹄葉炎的發(fā)病密切相關(guān)（Milinovich，2010）。本試驗中56 d 時試驗II 組鏈球菌科與鏈球菌屬豐度顯著低于對照組，說明補喂發(fā)酵豆粕能夠有效預(yù)防蹄葉炎的發(fā)生。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，補喂發(fā)酵豆粕可顯著提高馬駒腸道菌群變形菌門和瘤胃球菌科的相對豐度，顯著降低螺旋體門、 放線菌門以及鏈球菌科的豐度，有效提升馬駒的消化能力，預(yù)防蹄葉炎、腹瀉以及炎癥的發(fā)生，同時，促進了馬駒腸道菌群的穩(wěn)定性。