SPE-HPLC-UV 法測(cè)定絞股藍(lán)提取物中皂苷的含量

陳 晗， 楊悠悠， 趙青余， 張軍民， 余雅男 ， 張 凱

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；3. 青島特種食品研究院，山東 青島 266109）

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum）是葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本藥食兩用植物，《中華本草》記載，絞股藍(lán)別名為七葉膽、小苦藥、公羅鍋底、落地生等（國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)，1999），在日本還被稱為“甘茶蔓”。我國(guó)絞股藍(lán)的三大產(chǎn)區(qū)分別為陜西安康平利、 廣西金秀和湖北神農(nóng)架地區(qū)， 分布廣泛， 資源豐富 （李華等，2015）。 絞股藍(lán)在我國(guó)具有悠久的藥用歷史，根據(jù)《本草綱目》記載，其具有消炎解毒、止咳祛痰、清熱補(bǔ)虛的功效。 在1986 年的國(guó)家科委的“星火計(jì)劃” 中， 由于突出的藥用價(jià)值絞股藍(lán)位居待開(kāi)發(fā)“名貴中藥材”之首（史琳等，2011），并在2020 年被衛(wèi)生部納入保健品名錄。 絞股藍(lán)含有多種生物活性成分，包括皂苷、黃酮類化合物、多糖、氨基酸、微量元素以及其他多種化學(xué)成分（鮑鳳霞等，2018），絞股藍(lán)皂苷一直是研究熱點(diǎn)，并且被認(rèn)為是絞股藍(lán)中主要發(fā)揮生物活性的物質(zhì)。 研究表明絞股藍(lán)含有Rb1、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3 等多種皂苷， 具有相似的骨架結(jié)構(gòu) （Su 等，2021；Ha 等，2019），都屬于達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜，且部分絞股藍(lán)皂苷在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為稀有的人參皂苷（鄭溢等，2018）。 因此絞股藍(lán)皂苷，具有神經(jīng)保護(hù)（Park 等，2020）、抗氧化（Seo 等，2017）、抗癌癥（Ma 等，2019；Xing 等，2018）、抑菌（Srichana 等，2011）、抗衰老（Phu 等，2020）、降血糖（Zhu 等，2021）、調(diào)節(jié)血脂、 保護(hù)肝臟、 調(diào)節(jié)腸道微生物 （Zhang 等，2021；Huang 等，2019；Khan 等，2019；Bae 等，2018）等多種功能。在“禁抗、限抗”的大背景下，絞股藍(lán)已列入我國(guó)《飼料原料目錄》，其產(chǎn)品的市場(chǎng)需求也日益強(qiáng)烈。

目前，有采用UPLC-Q-Trap-MS 法對(duì)絞股藍(lán)藥材中的9 種皂苷成分含量進(jìn)行測(cè)定 （Duan 等，2021），HPLC-UV-ELSD 法對(duì)絞股藍(lán)藥材中槲皮素、蘆丁、絞股藍(lán)皂苷A 和絞股藍(lán)皂苷XLIX 4 種指標(biāo)性成分的含量進(jìn)行測(cè)定與分析（王源源和丁鵬，2021），RP-HPLC-ELSD 法對(duì)絞股藍(lán)藥材中的皂苷含量進(jìn)行測(cè)定（李浩飛，2015），HPLC-QAMS法對(duì)藥品清肺散結(jié)丸中絞股藍(lán)皂苷ⅩLⅨ、 絞股藍(lán)皂苷A 和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ的含量進(jìn)行測(cè)定（周穎等，2020），HPLC 法對(duì)藥品絞股藍(lán)總苷分散片中絞股藍(lán)皂苷A 的含量進(jìn)行測(cè)定（徐文峰等，2019）。對(duì)絞股藍(lán)提取物中絞股藍(lán)皂苷含量測(cè)定的研究較少，且我國(guó)尚未制定有關(guān)飼料原料絞股藍(lán)粗提物質(zhì)量評(píng)價(jià)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過(guò)對(duì)色譜條件及前處理進(jìn)行研究、優(yōu)化，旨在建立SPE-HPLC-UV 法測(cè)定絞股藍(lán)三萜皂苷含量，為絞股藍(lán)粗提物作為飼料原料使用時(shí)，其中三萜皂苷（絞股藍(lán)皂苷A 和絞股藍(lán)皂苷XLIX）含量的測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 高效液相色譜儀（1290 Infinity II）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲儀 （昆山市超聲儀器有限公司）；HD-2500 型多管渦旋混合儀（杭州佑寧儀器有限公司）；XP-205 型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；Avvanti J-26S XP 高速冷凍離心機(jī)；SPE 固相萃取萃取柱：Cleanert S C18（60 mg/ 3 mL 50/pkg）；固液萃取減壓凈化系統(tǒng)。

乙腈和甲醇均為色譜純，均購(gòu)于Fisher 試劑公司；正丁醇和乙醇為色譜純，均購(gòu)于Macklin 試劑公司；屈臣氏蒸餾水；絞股藍(lán)XLIX 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品和絞股藍(lán)A 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品來(lái)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬百平研究員團(tuán)隊(duì)（純度≥98.0%）。市場(chǎng)采購(gòu)絞股藍(lán)提取物樣品6 批，編號(hào)為S1 ～S6，規(guī)格均為提取率20∶1。

1.2 色譜條件 色譜柱：Kinetex C18色譜柱（150 mm× 4.6 mm，2.6 μm）；柱溫：40 ℃；以水-乙腈為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫見(jiàn)表1；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm。混合對(duì)照品高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

1.3 溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 精密稱取并記錄絞股藍(lán)皂苷XLIX 和皂苷A 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品， 用色譜純甲醇定容至1 mL，搖勻，得對(duì)照品貯備液。 儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用， 臨用時(shí)再配制成為不同濃度梯度的混合工作液。

1.3.2 供試品溶液制備 采用甲醇直接提取法對(duì)絞股藍(lán)提取物樣品進(jìn)行制備。 精密稱取樣品約0.2 g，置于50 mL 離心管中，加10 mL 75%甲醇水，2500 r/min 振搖30 min，50 kHz 超聲30 min，8000 r/min、4 ℃離心5 min，過(guò)0.45 μm 有機(jī)相膜后，取上清1 mL 用蒸餾水定容至10 mL，作為絞股藍(lán)提取液。

1.3.3 供試品溶液凈化 將SPE 柱置于固相萃取系統(tǒng)上，活化：向SPE 柱中加入3 mL 甲醇，浸潤(rùn)后緩慢過(guò)柱棄流出液，再加入3 mL 蒸餾水，浸潤(rùn)后緩慢過(guò)柱棄流出液；上樣：精密吸取0.5 mL待凈化絞股藍(lán)提取液至已活化的SPE 柱中，以2 ～3 滴/s 流速過(guò)柱，棄流出液；淋洗：依次加入2 mL蒸餾水，2 mL 20%乙腈，淋洗SPE 柱，棄淋洗液；洗脫：加入2 mL 40%乙腈，浸潤(rùn)后以2 ～3 滴/s流速過(guò)柱，收集洗脫液，待液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化 比較Shimadzu Sum C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Kinetex C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）2 款不同色譜柱，發(fā)現(xiàn)在相同的條件下，2 種色譜柱都具有較好的分離度，但Kinetex C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）分離條件較好，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰峰形對(duì)稱，出峰時(shí)間也相對(duì)縮短，節(jié)省實(shí)驗(yàn)周期。確定色譜柱后， 考察了30、35 ℃和40 ℃不同色譜柱柱溫，發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí)，目標(biāo)化合物色譜峰與相鄰色譜峰分離效果更好，能提前出峰時(shí)間。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化 本研究考察了甲醇、乙醇和水作為直接提取法的溶劑對(duì)絞股藍(lán)皂苷含量測(cè)定的影響，結(jié)果表明甲醇的提取效果更好，這也與龍凌云（2018）等對(duì)絞股藍(lán)皂苷前處理溶劑一致，并對(duì)甲醇水濃度（25%、50%、75%和100%）進(jìn)行選擇， 比較得75%甲醇水濃度具有最高提取率，結(jié)果如圖2 所示。絞股藍(lán)提取液中成分相對(duì)復(fù)雜，含有多種皂苷、黃酮、多糖等成分，在本實(shí)驗(yàn)選擇了固相萃取柱對(duì)目標(biāo)皂苷進(jìn)行凈化和富集。 首先以20 μg/mL 混合對(duì)照品為模型探究SPE 柱的淋洗和洗脫條件， 將SPE 柱先后使用3 mL 甲醇和蒸餾水活化，加入2 mL 混合對(duì)照品，以蒸餾水及20%、40%、60%、80%、100%乙腈水淋洗SPE 柱，收集洗脫液，進(jìn)行液相檢測(cè)。 結(jié)果表明，40%乙腈條件下，目標(biāo)化合物洗脫完全，對(duì)照品經(jīng)SPE 柱洗脫后，絞股藍(lán)皂苷XLIX 的回收率達(dá)91.3%，絞股藍(lán)皂苷A 的回收率達(dá)94.8%，結(jié)果證明SPE 柱對(duì)樣品前處理的的凈化效果良好，且回收率較高，這也與Chen 等 （2021） 對(duì)保健品中人參皂苷和Song 等（2020）對(duì)原人參二醇人參皂苷的試驗(yàn)結(jié)果相似。SPE 柱有一定柱容量，過(guò)載會(huì)出現(xiàn)柱穿透現(xiàn)象，即部分目標(biāo)化合物也會(huì)隨流動(dòng)相流出（彭曉俊等，2013），實(shí)驗(yàn)確定了此SPE 柱下最適添加絞股藍(lán)提取液體積為0.5 mL。

圖2 不同比例甲醇水提取率比較

2.3 線性實(shí)驗(yàn) 用甲醇將溶劑配制成200 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液， 并逐級(jí)稀釋至濃度梯度分別為0.1、0.5、1.0、2.5、10、25、50、100、200 μg/mL 混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。 以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢出限為S/N=3 的值， 定量限為S/N=10 的值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示， 絞股藍(lán)皂苷XLIX 和絞股藍(lán)皂苷A 在一定濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

表2 線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 按照“2.2.1” 項(xiàng)方法制備100 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定， 連續(xù)6 次進(jìn)樣， 參照峰為絞股藍(lán)皂苷XLIX 和皂苷A 峰， 分別計(jì)算2 個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 和相對(duì)峰面積RSD。 結(jié)果顯示，兩個(gè)峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.01%和0.01%， 相對(duì)峰面積的RSD 為0.32%和0.31%， 表明高效液相色譜儀的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照“2.3.2”項(xiàng)方法制備絞股藍(lán)（S1）提取液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別于0、24、48 h 進(jìn)樣分析， 參照峰為絞股藍(lán)皂苷XLIX 和皂苷A 峰， 分別計(jì)算2 個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 和相對(duì)峰面積RSD。 結(jié)果顯示，兩個(gè)峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.04%和0.05%， 相對(duì)峰面積的RSD 為0.53%和1.27%， 表明本次試驗(yàn)制備的供試品溶液在48 h 內(nèi)較穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的絞股藍(lán)提取液6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，參照峰為絞股藍(lán)皂苷XLIX 和皂苷A 峰， 分別計(jì)算2 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 和相對(duì)峰面積RSD。 結(jié)果顯示，兩個(gè)峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.07%和0.01%， 相對(duì)峰面積的RSD 為0.75%和0.60%，表明本次實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取絞股藍(lán)供試品（S3），每份約0.2 g，分3 組，添加混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的濃度水平為5、25 μg/mL 和200 μg/mL，每組6個(gè)平行，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，參照峰為絞股藍(lán)皂苷XLIX 和皂苷A 峰，記錄峰面積，計(jì)算兩種皂苷3 個(gè)水平加標(biāo)回收率為91.38% ～98.4%，RSD 小于2.48%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，表明本實(shí)驗(yàn)方法回收率較好。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定 按“2.3.2”項(xiàng)分別對(duì)6 個(gè)樣品進(jìn)行制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)從市面上購(gòu)買的6 批樣品進(jìn)行測(cè)定， 結(jié)果表明樣品S2、S3、S5 絞股藍(lán)皂苷XLIX 和A 未檢出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。

表4 含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

實(shí)驗(yàn)測(cè)得的含量結(jié)果顯示， 市場(chǎng)中購(gòu)買的絞股藍(lán)提取物中皂苷的含量差異較大， 質(zhì)量參差不齊，這可能與絞股藍(lán)不同的基原、品種和加工方式等有較大關(guān)系 （Zhang 等，2021；Zhang 等，2021；Dong 等，2018；Huang 和Yu，2000）， 絞股藍(lán)的不同部位和生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)皂苷種類和含量也有影響（樂(lè)圓，2010），有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)前處理利用甲醇直接提取法和SPE柱凈化目標(biāo)化合物， 并使用HPLC-UV 對(duì)絞股藍(lán)皂苷XLIX 和皂苷A 進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測(cè)定， 建立了SPE-HPLC-UV 檢測(cè)方法。 本實(shí)驗(yàn)所建立的方法樣品前處理簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、檢測(cè)效率顯著提高、其穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、線性關(guān)系良好，適用于絞股藍(lán)提取物中對(duì)絞股藍(lán)皂苷XLIX 和皂苷A 進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。